Summary
Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.
Abstract
Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.
Introduction
Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden1. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung2,3 . Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota zu beeinflussen. So, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota haben zunehmende Forschungsaufmerksamkeitangezogen 4,5,6,7,8,9.
Es ist schwierig, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota in vivo aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen zu bewerten. Zum Beispiel können Experimente, die die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen, nicht ohne Erlaubnis der Food and Drug Administration durchgeführt werden, und die Rekrutierung von Freiwilligen ist teuer. Daher werden für solche Untersuchungen häufig Tiermodelle verwendet. Die Verwendung von Tiermodellen ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Mikrobiotazusammensetzungen und Diversität in tier- und menschenverbundenen Gemeinschaften begrenzt. Eine alternative In-vitro-Methode zur Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota ist der Einsatz von Batch-Kulturexperimenten.
Exopolysaccharide (EPS) sind Präbiotika, die wesentlich zur Erhaltung der menschlichen Gesundheit beitragen10. Verschiedene EPS, die aus verschiedenen Monosaccharid-Zusammensetzungen und -Strukturen bestehen, können unterschiedliche Funktionen aufweisen. Frühere Analysen haben die Zusammensetzung der Bif EPS bestimmt, die das repräsentative Xenobiotikum sind, das in der aktuellen Studie11ins Visier genommen wird. Die wirtassoziierten metabolischen Effekte wurden jedoch hinsichtlich der EPS-Zusammensetzung und -Vielfalt nicht berücksichtigt.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet die fäkale Mikrobiota von 12 Freiwilligen, um Bif EPS zu fermentieren. Die Dünnschichtchromatographie (TLC), die 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und die Gaschromatographie (GC) werden dann in Kombination verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen EPS und humaner Darmmikrobiota zu untersuchen. Deutliche Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu In-vivo-Experimenten sind seine niedrigen Kosten und die Vermeidung von störenden Effekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Darüber hinaus kann das beschriebene Protokoll in anderen Studien verwendet werden, die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) und der Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, China).
1. Herstellung von Bakterien
- Zubereitung von Bifidobacterium mittlerer Brühe
- Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Fleischextrakt, 5 g/L; Hefeextrakt, 5 g/L; Casein-Pepton, 10 g/L; Soytone, 5 g/L; Glukose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO47H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 ml; Salzlösung, 40 ml (CaCl2.2H2O, 0,25 g/l; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); und Resazurin, 0,4 ml (2,5 mg/L). Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 2 M NaOH ein.
- Autoklav bei 121 °C für 15 min und lassen Sie die Brühe auf Raumtemperatur (RT) unter anaeroben Bedingungen abkühlen (10% H2, 10% CO2, 80% N2). Filtersterilisiertes Cystein-HCl (0,5 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) zum Medium hinzufügen.
- Fügen Sie ein Aliquot (50 l) gefrorenes Bifidobacterium longum zu einem Kulturrohr mit 5 ml Bifidobacterium-Mediumbrühe unter anaeroben Bedingungen hinzu, dann Kultur in einem anaeroben Inkubator für 24 h bei 37 °C.
2. Herstellung von bifidobakteriellen EPS
- Vorbereitung des PYG-Agarmediums
- Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 20 g/L; Hefeextrakt, 10 g/L; Glukose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO47H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/l; KH2PO4, 0,04 g/l; NaHCO3, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 7,2 ein.
- Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min und kühlen Sie auf 50 °C. Dann, pro 1 L Medium, 0,5 ml filtersterilisierte Vitamin K1 Lösung (1 g Vitamin K1 gelöst in 99 ml 99% Ethanol), 5 ml Häminlösung (0,5 g Hämin gelöst in 1 ml 1 mol/L NaOH , dann bis zu 100 ml mit destilliertem Wasser) und 0,5 g Cystein-HCl.
- Vor dem Gießen der PYG-Platten, fügen Sie filtersterilisierte 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactopyranosid (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2 O(5,7 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) auf das Medium.
HINWEIS: X-Gal und LiCl.3H2O ermöglichen die Identifizierung von B. LongumKolonien auf Platten über Färbungsänderungen.
- 20 L B. Longum-Stämme (Schritt 1.2) auf PYG-Platten impfen und 72 h bei 37 °C in einen anaeroben Inkubator geben.
- Sammeln Sie Mukoid-Bakterienkolonien aus den PYG-Platten mit einem Wägelöffel, dann vollständig in 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) mit einem Wirbeloszillator wieder aufsetzen.
HINWEIS: Die Bakteriellen und EPS-Mischungen sollten vollständig durch Wirbeln oder Pipettieren nach oben und unten wiederholt resuspendiert werden, bis die Fasern vollständig in PBS gelöst sind. - Zentrifugieren Sie die Suspension bei 6.000 x g für 5 min.
- Die Überstande vorsichtig auf ein neues Zentrifugenrohr übertragen und durch wiederholte Inversion und Mischung vollständig mit drei Volumen kaltem 99% Ethanol vermischen.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 6.000 x g für 5 min und entfernen Sie die Überräube vollständig.
- Entfernen Sie die Ausscheide aus den Zentrifugenrohren, indem Sie die EPS-Extrakte über Nacht mit einem Geschwindigkeitsvakuum kratzen und trocknen.
3. Herstellung des Fermentationsmediums
- Vorbereitung des Grundkulturmediums VI
- Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 3 g/L; Trypton, 3 g/L; Hefeextrakt, 4,5 g/L; Mucin, 0,5 g/L; Gallensalze Nr. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2bei 6H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/l; MgSO4bei 7H2O, 3,0 g/L; MnCl24H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO47H2O, 0,18 g/L; CaCl22 H2O, 0,1 g/L; ZnSO4bei 7H2O, 0,18 g/L; CuSO4bei 5H2O, 0,01 g/L; und NiCl26H2O, 0,092 g/L. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 mit 1 M HCl ein.
- Bereiten Sie Hämin und Cystein wie in Abschnitt 2.1 getan und nach dem Autoklavieren und Kühlen hinzufügen.
- Bereiten Sie Kulturmedien vor, die verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten, mit einem VI-Basismedium. Vor dem Autoklavieren 8 g/L Bif EPS-Fasern zu Medium VI hinzufügen, bestehend aus Gruppe VI_Bif. Fügen Sie außerdem 8 g/L Stärke zu Medium VI hinzu, um Die Gruppe VI_Starch darzustellen. Schließlich wird Medium VI ohne Zugabe einer Kohlenstoffquelle als Steuerung verwendet (Gruppe VI).
HINWEIS: Bif EPS und Stärke werden zunächst in heißem Wasser mit einem magnetischen Rührer gelöst und dann mit vorbereitetem VI-Medium gemischt. - Alle Medien bei 121 °C für 15 min autoklavieren und auf RT abkühlen lassen.
- Übertragen Sie eine Unterprobe (5 ml) jedes Mediums in Kulturröhren in einem anaeroben Inkubator und lagern Sie die restlichen Medien bei 4 °C.
4. Humane Fäkalienprobenvorbereitung
- Sammeln Sie frische Fäkalienproben unmittelbar nach frischer Defäkation von gesunden erwachsenen menschlichen Freiwilligen mit Kotbehältern und anschließend für die Güllezubereitung.
HINWEIS: Vor der Probenentnahme sollten alle Freiwilligen gescreent werden, um sicherzustellen, dass antibiotika, probiotische oder präbiotische Behandlungen mindestens 3 Monate vor der Entnahme von Proben nicht erhalten werden. Darüber hinaus müssen alle Spender eine informierte, schriftliche Zustimmung erteilen. - Eine frische Fäkalienprobe (1 g) auf 10 ml 0,1 M anaerobe PBS (pH 7,0) in Glasbecher geben, dann Glasstäbe verwenden, um eine 10% (w/v) Gülle zuzubereiten.
- Verwenden Sie ein 0,4 mM Großes Sieb, um die Fäkalienschlämme zu filtern. Verwenden Sie dann eine Unterprobe der gefilterten Gülle, um Diefermentationsexperimente zur Chargenkultur zu impfen, und lagern Sie den Rest bei -80 °C für weitere Analysen.
HINWEIS: Die Schritte 4.2–4.3 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.
5. In-vitro-Chargenfermentation
- In Schritt 3.2 in einer anaeroben Kammer hergestellte gefilterte Fäkalienschlämme (500 l) in das Fermentationsmedium geben und dann bei 37 °C inkubieren.
- Sammeln Sie 2 ml fermentierte Proben bei 24 h und 48 h in der anaeroben Kammer und zentrieren Sie dann außerhalb der Kammer bei 6.000 x g für 3 min.
- Übertragen Sie die Überstande sorgfältig auf ein neues Zentrifugenrohr, das für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) verwendet wird.
- Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei -80 °C auf und verwenden Sie anschließend die bakterielle genomische DNA-Extraktion.
6. EPS-Abbau durch menschliche Fäkalienmikrobiota
- 0,2 l fermentierte Überstoffe auf vorbeschichtete Kieselgel-60 TLC-Aluminiumplatten geben und anschließend mit einem Haartrockner trocknen.
- Entwickeln Sie die Platten in 20 ml einer Ameisensäure/n-Butanol/Wasser (6:4:1, v:v:v) Lösung und trocknen Sie mit einem Haartrockner.
- Die Teller im Orcinol-Reagenz einweichen, um zu färben, dann trocknen Sie mit einem Haartrockner.
- Bereiten Sie Orcin-Reagenzien vor, indem Sie 900 mg Lichenol in 25 ml destilliertem Wasser auflösen und dann 375 ml Ethanol hinzufügen. Anschließend sollte konzentrierte Schwefelsäure langsam zugesetzt und die Lösung gründlich vermischt werden.
- Hitzeplatten bei 120 °C für 3 min im Backofen und bewerten Denkwert von EPS durch Messung von TLC-Bändern.
7. Auswirkungen von EPS auf die menschliche Darmmikrobiota
- Gefrieren Sie die in Schritt 4.3 hergestellten Originalfäkalienproben und die in Schritt 5.4 hergestellten fermentierten Proben.
- Extrahieren Sie bakterielle genomische DNA (gDNA) aus allen Proben mit einem Stuhl bakterielle genomische DNA-Extraktionkit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bestimmen Sie DNA-Konzentrationen, Integrasse und Größenverteilungen mit einem Mikrospektrophotometer und einer Agargelelektrophorese.
- Führen Sie PCR von bakteriellen 16S rRNA-Genen aus der extrahierten gDNA mit den zuvor beschriebenen Vorwärts- und Reverse-Primern12:
-Vorwärtsgrundierung (Barcode-Primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-Reverse Primer (806R): GGACTACHVGGWTCTAAT
Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Bedingungen:- 94 °C für 5 min.
- 94 °C für 30 s.
- 55 °C für 30 s.
- 72 °C für 1 min.
- Wiederholen Sie 2–4 für 35 Zyklen
- 72 °C für 5 min.
- 4 °C halten bis zum Entfernen aus dem thermischen Cycler.
- Führen Sie die Sequenzierung von PCR-Produkten mit hohem Durchsatz bei einem DNA-Sequenzierungsunternehmen mithilfe einer mikrobiellen Community-Analyse mit ultrahohem Durchsatz durch.
- Erhalten Sie saubere, qualitativ hochwertige Sequenzen mit der Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) Sequenzanalysepipeline13.
- Definieren Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs) für 16S rRNA-Gensequenzen mit einer Nukleotidähnlichkeit von mehr als 97 % mithilfe von Bioinformatik-Tools wie der Mothur Software Suite14.
- Wählen Sie aus jeder OTU eine repräsentative Sequenz aus, und verwenden Sie den RDP-Klassifikator zusammen mit der taxonomischen SILVA-Datenbank, um repräsentative Sequenzen15zu klassifizieren.
- Berechnen Sie Goods Abdeckung, Alpha-Diversitätsmetriken (einschließlich Simpson- und Shannon-Index) und Reichtum (beobachtete Anzahl von OTUs) mit Bioinformatik-Tools16.
8. Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion durch menschliche Darmmikrobiota
- In Schritt 5,3 bis 2 ml Zentrifugenrohren fermentierte Überräube (1 ml) hinzufügen.
- Fügen Sie 0,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure zu jeder der Proben hinzu und mischen Sie die Lösungen gründlich durch Wirbeln.
- Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 x g für 20 min und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche.
- Gleichzeitig Lösungen von 120 mM Essig-, Propion-, Butyric-, isobutyric-, Valeric- und Isovalersäuren vorbereiten. Dann 1 ml jeder vorbereiteten Säure zu 1,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure hinzufügen und als Standardcocktails verwenden.
- Filtern Sie die Proben mit einer 0,22-M-Membran.
- SCFA-Konzentrationen mit Hochleistungsgaschromatographie gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen11,17erkennen.
HINWEIS: Für die Gaschromatographie (GC) wird eine InertCap FFAP-Säule (0,25 mM x 30 m x 0,25 m) verwendet. Die SCFA-Konzentrationen werden dann anhand von Spitzenbereichen mithilfe der internen Single-Point-Standardmethode im GC Solution-Softwarepaket quantifiziert.
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Representative Results
Die Produktion von Schleimhaut EPS konnte in B. Longumkulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 h beobachtet werden (Abbildung 1A). Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS (Abbildung 1B). Getrocknetes EPS und lösliche Stärke wurden dann als Kohlenstoffquellen für Fermentationskulturen verwendet. TLC wurde für die Oligosaccharid-Trennung und Reinheitsanalyse aufgrund seiner niedrigen Kosten und schnellen Ergebnisturnaround18verwendet. Obwohl die Abbaurate von Stärke durch humane Fäkalienmikrobiota schneller war als die von Bif EPS (Abbildung 2), wurde bei einigen EPS-inokulierten Proben ein deutlicher Eps-Abbau beobachtet.
Die gemeinschaftliche Zusammensetzungsanalyse mittels 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde dann durchgeführt, um die Auswirkungen von Bif EPS auf die mikrobiota des menschlichen Darms zu untersuchen. Proben aus den Gruppen VI_Bif und VI_Starch gruppierten sich in der PCoA-Analyse getrennt voneinander (Abbildung 3A), was darauf hindeutet, dass DIE EPS- und Stärkeverfügbarkeit die menschlichen Fäkalien-Bakteriengemeinschaften differenziell formt. Lineare Diskriminant-Analyse-Effektgröße (LEfSe) wurde weiter verwendet, um die spezifische bakterielle Taxa zu unterscheiden, die zwischen den VI_Bif- und VI_Starch-Behandlungen unterschieden. Die Gattungen Collinsella, Coprococcus, Parabacteroidesund Rhodopseudomonas waren in den VI_Bif-Proben signifikant häufiger als in den VI_Starch-Proben (Abbildung 3B). Darüber hinaus wurden GC-Messungen für mehrere SCFAs durchgeführt, um ihre Produktion nach dem Hinzufügen verschiedener Kohlenstoffquellen zu bewerten. SCFAs, die aus Fermentationskulturen gemessen wurden, umfassten Essig-, Propion-, isobutyric-, butyric-, isovaler- und Baldriansäuren. Nach der Gärung für 24 h und 48 h waren fünf der sechs genannten SCFA-Konzentrationen bei den Behandlungen ähnlich und zwischen den Gruppen VI_Bif, VI_Starch und VI statistisch nicht unterschiedlich. Die Propionsäurekonzentrationen waren jedoch in der VI_Bif-Gruppe signifikant höher als in der VI_Starch-Gruppe (Abbildung 4).
Abbildung 1: EPS produziert von B. longum.
Gefrorene B. longum wurde in Bifidobacterium mittlere Brühe restauriert und dann auf PYG-Platten gestreift, gefolgt von anaeroben Inkubation bei 37 °C für 72 h (A). Das eps, das von Bakterienkulturen produziert wurde, wurde aus Plattenkulturen abgekratzt, mit Ethanol gefällt und über Nacht mit einem Geschwindigkeitsvakuum getrocknet (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: TLC-Analyse von In-vitro-EPS und Stärkeabbau durch menschliche Darmmikrobiota.
Die TLC-Analyse wurde an 0,2 L-Proben durchgeführt, die bei 24 h und 48 h aus jeder Fermentationskultur entnommen wurden, die unter anaeroben Bedingungen angebaut wurde. VI, VI_Starch und VI_Bif zeigen VI-Medien, VI-Medien + Stärke-Ergänzung und VI-Medien + EPS-Ergänzung an. Die Zahlen 1–12 zeigen fäkale Bakterienproben der 12 Freiwilligen, die verwendet wurden, um die Fermentationsexperimente zu impfen. Die Kontrollgruppe stellt die Behandlung ohne zusätzliche Kohlenstoffzusätze dar. Diese Zahl wurde von Yin et al.geändert. 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswirkungen der Verfügbarkeit von Bif EPS auf menschliche Darmmikrobiota-Gemeinschaften.
(A) PCoA-Plot von Darm-Mikrobiota-Community-Kompositionsunterschiede basierend auf der ungewichteten UniFrac-Metrik. (B) LEfSE-Analyse von bakteriellen Taxa, die zwischen den Behandlungsgruppen unterschiedlich reichlich vorhanden waren. Zur Beurteilung der statistischen Signierung bakterieller taxonomischer Unterschiede zwischen den Gruppen wurde ein Cutoff von p < 0,05 verwendet. Ori zeigt die Darmmikrobiota der freiwilligen Fäkalienproben an. VI_Bif und VI_Starch zeigen die Darmmikrobiota aus Fermentationsproben mit VI-Medien mit EPS bzw. Stärke als Kohlenstoffsubstrate an. VI stellt die Kontrollgruppe mit Darmmikrobiota geimpften Fermentationen in VI-Medien ohne Supplementierung anderer Kohlenhydrate dar. Diese Zahl wurde von Yin et al.geändert. 11 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswirkungen der EPS-Verfügbarkeit auf die SCFA-Produktion nach 24 h und 48 h Fermentation.
Essige, propionische, isobutyrische, butyrische, isovalere und Baldriansäuren wurden mittels Gaschromatographie nachgewiesen. VI_Bif, VI_Starch und VI geben die Proben an, die nach dem Anbau mit VI-Medien + EPS, VI-Medien + Stärke bzw. VI-Medien gesammelt wurden. Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung gemessen. Die Zahlen wurden mit GraphPad Prism Version 5.01 generiert. Die Platten stellen organische Säurekonzentrationen in jeder fermentierten Probe für A, Essigsäure dar; B, Propionsäure; C, Isobuttersäure; D, Buttersäure; E, isovalersäure; und F, Baldriansäure. Diese Abbildung wurde von Yin et al.11geändert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota19,20. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet21, wobei die Darmmikrobiota als eines der funktionellen Organe beim Menschen anerkannt wurden22,23. Der menschliche Körper beherbergt ein komplexes mikrobielles Ökosystem, bestehend aus etwa 1013 mikrobiellen Zellen24. Darüber hinaus gelten die Genome von Darmmikrobiota als Hilfsgenome vom Menschen, die zahlreiche metabolische Gene kodieren, die die metabolischen Fähigkeiten des Wirts erweitern4. Jedoch, Xenobiotika, einschließlich therapeutischer Medikamente und Diät-abgeleitete bioaktive Verbindungen, kann potenziell die Darm-Mikrobiom-Gemeinschaftsstruktur und die damit verbundenen Funktionen verändern5. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota und Xenobiotika eine wichtige Rolle bei der Vermittlung chemischer Toxizität spielen und menschliche Krankheiten verursachen oder auf andere Weise verschlimmeren6,7. So haben Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Xenobiotika und der menschlichen Darmmikrobiota in letzter Zeit erhebliche Forschungsaufmerksamkeit erregt.
Mausmodelle sind die am weitesten verbreiteten Methoden zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota und Wirten. Jedoch, Unterschiede in der Zusammensetzung und Aktivitäten zwischen der Darmmikrobiota von Menschen und Mäusen25 kann zu einer unzureichenden Modellierung der menschlichen Wechselwirkungen durch Studien an Mäusen führen. Dennoch erfordern bioethische Überlegungen einen minimalen Einsatz von Mäusen. Eine Alternative zu den oben genannten In-vivo-Modellen ist die Batchfermentation, die zur Simulation menschlicher Darmmikrobiota in vitro26verwendet werden kann. Folglich wurden Fermentationsexperimente verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Xenobiotika und menschlicher Darmmikrobiota zu untersuchen. Zum Beispiel Yin et al. 17 haben Batch-Fermentationsexperimente verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Polysacchariden und menschlicher Darmmikrobiota zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass einige Polysaccharide durch die menschliche Darmmikrobiota metabolisiert werden können, und dass Polysaccharide die menschliche Bakteriengemeinschaft und Metaboliten, die sie in vitro produzieren, einschließlich SCFAs modulieren. Einige methodische Überlegungen sind jedoch für die Verwendung dieses Protokolls von entscheidender Bedeutung. Beispielsweise sollten Fäkalienproben so schnell wie möglich entnommen werden, und eine anaerobe Kammer sollte verwendet werden, um das Wachstum von obligaten Anaeroben zu gewährleisten. Letztere sträglich ist von entscheidender Bedeutung, da die Sauerstoffexposition zum Tod einiger Darmbakterienpopulationen und damit zur Veränderung der Bakteriengemeinschaft führen kann. Darüber hinaus, Xenobiotika werden im oberen Verdauungssystem metabolisiert. Folglich ist die Modellierung der Wechselwirkungen zwischen Xenobiotika und dem unteren Verdauungssystem Mikrobiota eine wichtige Überlegung für die In-vivo-Modellierung.
Batch-Fermentationsexperimente haben gegenüber in vivo-Studien von Mensch und Tier klare Vorteile, da sie wirtschaftlich machbarer und bequemer sind. Darüber hinaus können sie verwendet werden, um interindividuelle Variation enhumaner Darmmikrobiota-Antworten auf xenobiotische Exposition zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Batchfermentation leicht angewendet werden, um Mikrobiota-Gemeinschaften zu manipulieren und ihre damit verbundenen Stoffwechselfunktionen zu bewerten. Chargenfermentationssysteme leiden jedoch unter der Einschränkung der statischen Zustandsdynamik. Zukünftige Untersuchungen könnten Bioreaktor-Chemostats implementieren, die eine dynamische Modulation von pH,- und Peristaltik ermöglichen und gleichzeitig eine stetige Nährstoffversorgung und die kontinuierliche Abfallentsorgung aufrechterhalten. Solche Aktivitäten würden es Experimenten ermöglichen, in vivo-Darmtrakte besser nachzuahmen und neue Erkenntnisse zu liefern, um die aus Batch-Fermentationsexperimenten zu ergänzen. Eine zusätzliche Einschränkung der Batch-Fermentationsexperimente ist, dass sie alle Mikrobiom-Wirt-Gewebe-Wechselwirkungen entfernen. Dies könnte eine besonders wichtige Überlegung sein, da einige Xenobiotika (z.B. Methamphetamin) von menschlichen Zellen und Darmmikrobiota27mitmetabolisiert werden können. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass Darmmetagenome (GM) indirekt den xenobiotischen Stoffwechsel regulieren können, indem die Regulation der Wirtsgenexpression8reguliert wird.
Obwohl die Weiterentwicklung von Batch-Fermentationssystemen noch erforderlich ist, können diese Systeme häufig für einen hohen Durchsatz und ein schnelles Screening von Wechselwirkungen zwischen Xenobiotika und menschlicher Darmmikrobiota eingesetzt werden. Die Aufklärung der Mechanismen, die der xenobiotischen Resistenz und dem Stoffwechsel in aktiven menschlichen Darmmikrobiomen zugrunde liegen, wird wichtige Einblicke in unerklärliche Patienten-zu-Patienten-Variationen in der Wirksamkeit und Toxizität von Patienten bieten8,9. Darüber hinaus ist ein detaillierteres Verständnis, wie Diäten und spezifische Lebensmittelkomponenten den mikrobiellen Stoffwechsel verändern und damit die Wirtsgesundheit beeinflussen, der erste Schritt zur Verwirklichung des Ziels der personalisierten Medizin durch Mikrobiotamodulation.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Die Zahlen wurden in Yin et al.zitiert. 11.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31741109), der Hunan Natural Science Foundation (Nr. 2018JJ3200) und dem Konstruktprogramm der angewandten charakteristischen Disziplin an der Hunan University of Science and Engineering finanziert. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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