Summary
Aquí se describe un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro.
Abstract
Los microorganismos intestinales humanos se han convertido recientemente en un objetivo importante de la investigación en la promoción de la salud humana y la prevención de enfermedades. En consecuencia, las investigaciones de interacciones entre endobióticos (por ejemplo, fármacos y prebióticos) y la microbiota intestinal se han convertido en un importante tema de investigación. Sin embargo, los experimentos in vivo con voluntarios humanos no son ideales para tales estudios debido a la bioética y las limitaciones económicas. Como resultado, se han utilizado modelos animales para evaluar estas interacciones in vivo. Sin embargo, los estudios de modelos animales siguen estando limitados por consideraciones de bioética, además de diferentes composiciones y diversidades de la microbiota en animales frente a humanos. Una estrategia de investigación alternativa es el uso de experimentos de fermentación por lotes que permiten evaluar las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal in vitro. Para evaluar esta estrategia, se utilizaron exopolisacáridos bifidobacterianos (Bif) como xenobiótico representativo. Luego, las interacciones entre Bif EPS y la microbiota intestinal humana se investigaron utilizando varios métodos como la cromatografía de capa delgada (TLC), el análisis de composición de la comunidad bacteriana con secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). Aquí se presenta un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro. Es importante destacar que este protocolo también se puede modificar para investigar las interacciones generales entre otros endobióticos y la microbiota intestinal.
Introduction
La microbiota intestinal desempeña un papel importante en el funcionamiento de los intestinos humanos y en la salud del huésped. En consecuencia, la microbiota intestinal se ha convertido recientemente en un objetivo importante para la prevención y la terapia de enfermedades1. Además, las bacterias intestinales interactúan con las células intestinales anfitrionas y regulan los procesos fundamentales del huésped, incluidas las actividades metabólicas, la disponibilidad de nutrientes, la modulación del sistema inmunitario e incluso la función cerebral y la toma de decisiones2,3 . Los endobióticos tienen un potencial considerable para influir en la composición bacteriana y la diversidad de la microbiota intestinal. Así, las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana han atraído una creciente atención de la investigación4,5,6,7,8,9.
Es difícil evaluar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana in vivo debido a la bioética y las limitaciones económicas. Por ejemplo, los experimentos que investigan las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana no se pueden realizar sin el permiso de la Administración de Alimentos y Medicamentos, y el reclutamiento de voluntarios es costoso. En consecuencia, los modelos animales se utilizan a menudo para tales investigaciones. Sin embargo, el uso de modelos animales es limitado debido a las diferentes composiciones de microbiota y diversidad en las comunidades asociadas a los animales frente al ser humano. Un método in vitro alternativo para explorar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana es a través del uso de experimentos de cultivo por lotes.
Los exopolisacáridos (SEP) son prebióticos que contribuyen significativamente al mantenimiento de la salud humana10. Los SAE distintos que consisten en diferentes composiciones y estructuras monosacáridos pueden exhibir funciones distintas. Los análisis anteriores han determinado la composición de los SAE Bif, que son el xenobiótico representativo al que se dirige en el actual estudio11. Sin embargo, efectos metabólicos asociados al huésped no se han considerado con respecto a la composición y diversidad EPS.
El protocolo descrito aquí utiliza la microbiota fecal de 12 voluntarios para fermentar Bif EPS. La cromatografía de capa delgada (TLC), la secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases (GC) se utilizan en combinación para investigar las interacciones entre los SSA y la microbiota intestinal humana. Las ventajas distintivas de este protocolo en comparación con los experimentos in vivo son su bajo costo y evitar los efectos de interferencia del metabolismo del huésped. Además, el protocolo descrito se puede utilizar en otros estudios que investigan interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices del comité de ética de la Universidad de Ciencia e Ingeniería de Hunan (Hunan, China) y la Universidad Zhejiang Gongshang (Zhejiang, China).
1. Preparación de bacterias
- Preparación de caldo medio bifidobacterium
- Combinar los siguientes componentes en 950 ml de agua destilada: extracto de carne, 5 g/L; Extracto de levadura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; tono de soja, 5 g/L; glucosa, 10 g/L; K2HPO4, 2.04 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solución salina, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); y resazurina, 0,4 ml (2,5 mg/L). Ajuste el pH a 6,8 con 2 M NaOH.
- Autoclave a 121 oC durante 15 min y dejar que el caldo se enfríe a temperatura ambiente (RT) en condiciones anaeróbicas (10% H2, 10% CO2, 80% N2). Añadir cisteína-HCl esterilizada por filtro (0,5 g/L) y mupirocina (5 mg/L) al medio.
- Añadir una alícuota (50 l) de Bifidobacterium longum congelado a un tubo de cultivo con 5 ml de caldo medio de bifidobacterium en condiciones anaeróbicas, luego cultivar en una incubadora anaeróbica durante 24 h a 37 oC.
2. Preparación de SEP bifidobacterianos
- Preparación del medio de agar PYG
- Combine lo siguiente: peptona, 20 g/L; Extracto de levadura, 10 g/L; glucosa, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,08 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Ajuste el pH a 7.2 utilizando 10 M NaOH.
- Autoclave el soporte a 121 oC durante 15 min y enfríe a 50 oC. A continuación, por 1 L de medio, añadir 0,5 ml de solución de vitamina K1 esterilizada por filtro (1 g de vitamina K1 disuelta en 99 ml de etanol al 99%), 5 ml de solución de hemino (0,5 g de hemino disuelto en 1 ml de 1 mol/L NaOH , entonces llevado hasta 100 mL con agua destilada), y 0,5 g de cisteína-HCl.
- Antes de verter las placas PYG, añadir filtro-esterilizado 5-bromo-4-cloro-3-indolyl -D-galactopiranoside (X-Gal, 0.06 g/L), LiCl-3H2O (5,7 g/L) y mupirocina (5 mg/L) al medio.
NOTA: X-Gal y LiCl.3H2O permiten la identificación de colonias B. longum en placas a través de cambios de coloración.
- Inocular 20 oC de cepas de B. longum (paso 1.2) a placas PYG y colocar en una incubadora anaeróbica a 37 oC durante 72 h.
- Recoger colonias bacterianas mucoide de las placas PYG usando una cuchara de pesaje, luego resuspender completamente en 10 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) utilizando un oscilador de vórtice.
NOTA: Las mezclas bacterianas y EPS deben ser resuspendidas completamente por vórtice o pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente hasta que las fibras se disuelvan completamente en PBS. - Centrifugar la suspensión a 6.000 x g durante 5 min.
- Transfiera cuidadosamente los sobrenadores a un nuevo tubo centrífugo y mezcle completamente con tres volúmenes de etanol frío 99% por inversión y mezcla repetidas.
- Centrifugar la mezcla a 6.000 x g durante 5 min y eliminar completamente los sobrenadores.
- Retire los precipitados de los tubos centrífugos raspando y secando los extractos de EPS durante la noche utilizando un vacío de velocidad.
3. Preparación del medio de fermentación
- Preparación de la cultura básica media VI
- Combine lo siguiente: peptona, 3 g/L; triptona, 3 g/L; Extracto de levadura, 4,5 g/L; mucina, 0,5 g/L; sales biliares No. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2x 6H2O, 4,5 g/l; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO4x 7H2O, 3,0 g/L; MnCl2x 4H2O, 0,32 g/L; FeSO4x 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4x 7H2O, 0,18 g/L; CaCl2x 2H2O, 0,1 g/l; ZnSO4x 7H2O, 0,18 g/L; CuSO4x 5H2O, 0,01 g/L; y NiCl2s6H2O, 0,092 g/L. Ajuste el pH a 6,5 con 1 M HCl.
- Preparar la hemicina y la cisteína como se hace en la sección 2.1 y añadir después de autoclave y enfriamiento.
- Preparar medios de cultivo que contengan diferentes fuentes de carbono con un medio base VI. Antes del autoclave, añadir 8 g/L de fibras Bif EPS a medio VI, compuesto por el grupo VI_Bif. Además, añadir 8 g/L de almidón a medio VI para representar el grupo VI_Starch. Por último, el medio VI sin adición de una fuente de carbono se utiliza como control (grupo VI).
NOTA: Bif EPS y almidón se disuelven primero en agua caliente utilizando un agitador magnético, luego se mezclan con un medio VI preparado. - Autoclave todos los medios a 121 oC durante 15 min y dejar enfriar a RT.
- Transfiera una submuestra (5 ml) de cada medio a los tubos de cultivo en una incubadora anaeróbica, y almacene el medio restante a 4 oC.
4. Preparación de muestras fecales humanas
- Recoger muestras fecales frescas inmediatamente después de la defecación fresca de voluntarios humanos adultos sanos usando recipientes de heces, y posteriormente utilizar para la preparación de lodos.
NOTA: Antes de la recolección de la muestra, todos los voluntarios deben ser examinados para asegurar que no reciban antibióticos, probióticos, o tratamientos prebióticos durante al menos 3 meses antes de donar muestras. Además, todos los donantes deben proporcionar consentimiento informado y por escrito. - Transfiera una muestra fecal fresca (1 g) a 10 ml de PBS anaeróbico de 0,1 M (pH 7,0) en vasos de vidrio y, a continuación, utilice varillas de vidrio para preparar una suspensión del 10% (p/v).
- Utilice un tamiz de 0,4 mM para filtrar la suspensión fecal. A continuación, utilice una submuestra de la suspensión filtrada para inocular los experimentos de fermentación del cultivo por lotes y almacene el resto a -80 oC para análisis posteriores.
NOTA: Los pasos 4.2–4.3 se llevan a cabo en una cámara anaeróbica.
5. Fermentación por lotes in vitro
- Añadir lodos fecales filtrados (500 l) al medio de fermentación preparado en el paso 3.2 dentro de una cámara anaeróbica, luego incubar a 37 oC.
- Recoger 2 ml de muestras fermentadas a 24 h y 48 h en la cámara anaeróbica y luego centrifugar fuera de la cámara a 6.000 x g durante 3 min.
- Transfiera cuidadosamente los sobrenadores a un nuevo tubo centrífugo que se utilizará para el análisis de degradación de polisacáridos y las mediciones de ácidos grasos de cadena corta (SCFA).
- Almacene los gránulos de centrifugación a -80 oC y, posteriormente, utilícelos para la extracción de ADN genómico bacteriano.
6. Degradación de EPS por microbiota fecal humana
- Cargar 0,2 l de sobrenatantes fermentados en placas de aluminio tLC con gel de sílice pre-revestido-60, luego secar con un secador de pelo.
- Desarrollar las placas en 20 ml de una solución de ácido fórmico/n-butanol/agua (6:4:1, v:v:v) y secar con un secador de pelo.
- Remoje las placas en el reactivo de orcinol para teñir, luego seque con un secador de pelo.
- Preparar reactivos de orcinol disolviendo 900 mg de Liquenol en 25 ml de agua destilada y añadiendo 375 ml de etanol. Posteriormente, el ácido sulfúrico concentrado debe añadirse lentamente y mezclar la solución a fondo.
- Caliente las placas a 120 oC durante 3 minutos en un horno de hornear y evalúe la degradación de las EPS midiendo las bandas TLC.
7. Efectos de las EPS en la microbiota intestinal humana
- Congele congele las muestras fecales originales preparadas en el paso 4.3 y las muestras fermentadas preparadas en el paso 5.4.
- Extraiga el ADN genómico bacteriano (ADN) de todas las muestras utilizando un kit de extracción de ADN genómico bacteriano de heces siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Determine las concentraciones de ADN, las integridades y las distribuciones de tamaño utilizando un microespectrofotómetro y una electroforesis de gel de agar.
- Realizar PCR de genes rRNA bacterianos 16S a partir del ADNg extraído utilizando las siguientes imprimaciones delanteras y inversas descritas anteriormente12:
-imprimación de avance (imprimación de código de barras 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-imprimación inversa (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Utilice las siguientes condiciones de ciclor térmico:- 94oC durante 5 min.
- 94oC para 30 s.
- 55oC para 30 s.
- 72oC durante 1 min.
- Repetir 2–4 para 35 ciclos
- 72oC durante 5 min.
- 4 oC mantener hasta retirar del ciclor térmico.
- Llevar a cabo la secuenciación de alto rendimiento de productos de PCR en una empresa de secuenciación de ADN utilizando análisis de comunidad microbiana de ultra alto rendimiento.
- Obtenga secuencias limpias y de alta calidad utilizando la canalización de análisis de secuencias de Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)13.
- Definir unidades taxonómicas operativas (OTU) para secuencias genéticas de rRNA 16S con similitud de nucleótidos superior al 97% utilizando herramientas bioinformáticas como la suite de software Mothur14.
- Elija una secuencia representativa de cada OTU y utilice el clasificador RDP junto con la base de datos taxonómica SILVA para clasificar las secuencias representativas15.
- Calcule la cobertura de Good, las métricas de diversidad alfa (incluido el índice Simpson y Shannon) y la riqueza (número observado de OTU) utilizando las herramientas bioinformáticas16.
8. Efectos de las EPS en la producción de SCFA por microbiota intestinal humana
- Añadir supernatores fermentados (1 ml) preparados en tubos centrífugos de 5,3 a 2 ml.
- Añadir 0,2 ml de ácido metafosfórico al 25% (p/v) de ácido metafosfórico a cada una de las muestras y mezclar a fondo las soluciones mediante vórtice.
- Centrifugar las mezclas a 13.000 x g durante 20 min y transferir los sobrenadores a tubos frescos.
- Concomitantemente, preparar soluciones de 120 mM ácidos acéticos, propónicos, butíricos, isobutíricos, valerico y isovalerico. A continuación, añadir 1 ml de cada ácido preparado a 1,2 ml de 25% (p/v) de ácido metafosfórico y utilizar como cócteles estándar.
- Filtrar las muestras utilizando una membrana de 0,22 m.
- Detectar concentraciones de SCFA mediante cromatografía de gases de alto rendimiento de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente11,17.
NOTA: Se utiliza una columna InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 m) para la cromatografía de gases (GC). A continuación, las concentraciones de SCFA se cuantifican en función de las áreas pico utilizando el método estándar interno de un solo punto en el paquete de software GC Solution.
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Representative Results
La producción de EPS mucoide se pudo observar en cultivos B. longum en placas PYG después de la incubación anaeróbica durante 72 h (Figura1A). La centrifugación de los raspaduras de cultivo, seguida de la precipitación de etanol y el secado, dio lugar a la recolección de EPS similares a la celulosa (Figura1B). Las EPS secas y el almidón soluble se utilizaron entonces como fuentes de carbono para cultivos de fermentación. TLC se utilizó para la separación de oligosacáridos y el análisis de pureza debido a su bajo costo y rápidos resultados de giro18. Aunque la tasa de degradación del almidón por microbiotafecal humana fue más rápida que la de Bif EPS (Figura 2), se observó claramente la degradación de Bif EPS para algunas muestras inoculadas por EPS.
A continuación, se realizó un análisis compositivo comunitario a través de la secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y el análisis de coordenadas principales (PCoA) para investigar los efectos de Bif EPS en la microbiota intestinal humana. Las muestras de los grupos VI_Bif y VI_Starch se agrupan por separado entre sí en el análisis pCoA (Figura3A),lo que indica que la disponibilidad de EPS y almidón moldean diferencialmente las comunidades bacterianas fecales humanas. El tamaño del efecto de análisis discriminante lineal (LEfSe) se utilizó además para distinguir los taxones bacterianos específicos que diferían entre los tratamientos VI_Bif y VI_Starch. Los géneros Collinsella, Coprococcus, Parabacteroidesy Rhodopseudomonas fueron significativamente más abundantes en las muestras VI_Bif que en las muestras VI_Starch (Figura3B). Además, se realizaron mediciones de GC para que varios sCFAs evaluaran su producción tras la adición de diferentes fuentes de carbono. Los SCFA que se midieron a partir de cultivos de fermentación incluyeron ácidos acéticos, propónicos, isobutíricos, butíricos, isovalíricos y valerico. Tras la fermentación durante 24 h y 48 h, cinco de las seis concentraciones de SCFA antes mencionadas fueron similares entre los tratamientos y no estadísticamente diferentes entre los grupos VI_Bif, VI_Starch y VI. Sin embargo, las concentraciones de ácido propiónico fueron significativamente mayores en el grupo VI_Bif que en el grupo VI_Starch (Figura4).
Figura 1: EPS producido por B. longum.
Frozen B. longum fue restaurado en caldo medio de Bifidobacterium y luego rayado en placas PYG, seguido de incubación anaeróbica a 37 oC durante 72 h (A). Las EPS producidas por cultivos bacterianos fueron raspadas de cultivos de placas, precipitadas con etanol y se secaban durante la noche usando un vacío de velocidad (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis TLC de EPS in vitro y degradación del almidón por microbiota intestinal humana.
El análisis de TLC se llevó a cabo en muestras de 0,2 l recogidas a 24 h y 48 h de cada cultivo de fermentación cultivado en condiciones anaeróbicas. VI, VI_Starch, y VI_Bif indican medios VI, MEDIOS VI + suplemento de almidón, y VI medios + suplemento EPS, respectivamente. Los números 1–12 indican muestras bacterianas fecales de los 12 voluntarios que se utilizaron para inocular los experimentos de fermentación. El grupo de control representa el tratamiento sin suplementos de carbono adicionales. Esta figura se modifica de Yin et al. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3: Efectos de la disponibilidad de Bif EPS en comunidades de microbiota intestinal humana.
(A) Gráfica PCoA de la comunidad de microbiotas intestinales diselasdes compositivas basadas en la métrica UniFrac no ponderada. (B) Análisis de LEfSE de taxones bacterianos que eran diferencialmente abundantes entre los grupos de tratamiento. Se utilizó un límite de p < 0.05 para evaluar la importancia estadística de las diferencias taxonómicas bacterianas entre los grupos. Ori indica la microbiota intestinal de las muestras fecales voluntarias. VI_Bif y VI_Starch indican la microbiota intestinal a partir de muestras de fermentación utilizando medios VI con EPS y almidón como sustratos de carbono, respectivamente. VI representa el grupo de control con fermentaciones inoculadas de microbiota intestinal en medios VI sin suplementación de otros carbohidratos. Esta figura se modifica de Yin et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de la disponibilidad de EPS en la producción de SCFA después de 24 h y 48 h de fermentación.
Se detectaron ácidos acéticos, propónicos, isobutíricos, butíricos, isomostéricos y valerico mediante cromatografía de gases. VI_Bif, VI_Starch y VI indican las muestras que se recogieron después del cultivo utilizando VI media + EPS, VI media + almidón, y VI medios, respectivamente. Todas las muestras se midieron por triplicado. Las cifras se generaron utilizando GraphPad Prism Versión 5.01. Los paneles representan concentraciones de ácido orgánico dentro de cada muestra fermentada para A, ácido acético; B, ácido propiónico; C, ácido isobutírico; D, ácido butírico; E, ácido isolado; y F, ácido valerico. Esta figura se modifica de Yin et al.11Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han realizado progresos significativos hacia la comprensión de la composición y las actividades de la microbiota intestinal humana en la última década. Como consecuencia de estos estudios, ha surgido el concepto holobionte, que representa las interacciones entre los huéspedes y las comunidades microbianas asociadas, como entre los seres humanos y su microbiota intestinal19,20. Además, los seres humanos son incluso ahora considerados como superorganismos21, en el que la microbiota intestinal ha sido reconocida como uno de los órganos funcionales en los seres humanos22,23. El cuerpo humano alberga un complejo ecosistema microbiano, que consta de aproximadamente 1013 células microbianas24. Además, los genomas de la microbiota intestinal se consideran genomas auxiliares de los seres humanos que codifican numerosos genes metabólicos que amplían las capacidades metabólicas del huésped4. Sin embargo, los xenobióticos, incluyendo medicamentos terapéuticos y compuestos bioactivos derivados de la dieta, pueden potencialmente alterar la estructura comunitaria del microbioma intestinal y las funciones asociadas5. Cada vez más estudios han indicado que las interacciones entre la microbiota intestinal y los xenobióticos desempeñan un papel importante en la mediación de la toxicidad química y en la causa, o exacerbando, las enfermedades humanas6,7. Por lo tanto, las investigaciones de las interacciones entre los xenobióticos y la microbiota intestinal humana han atraído recientemente una importante atención de investigación.
Los modelos de ratón han sido los métodos más utilizados para investigar las interacciones entre la microbiota y los anfitriones. Sin embargo, las diferencias en la composición y las actividades entre la microbiota intestinal de los seres humanos y los ratones25 pueden dar lugar a un modelado inadecuado de las interacciones humanas a través de estudios de ratones. Sin embargo, las consideraciones de bioética requieren un uso mínimo de ratones. Una alternativa a los modelos in vivo anteriores es la fermentación por lotes, que se puede utilizar para simular la microbiota intestinal humana in vitro26. En consecuencia, se han utilizado experimentos de fermentación para investigar las interacciones entre los xenobióticos y la microbiota intestinal humana. Por ejemplo, Yin et al. 17 han utilizado experimentos de fermentación por lotes para investigar las interacciones entre los polisacáridos y la microbiota intestinal humana. Los resultados de este estudio indican que algunos polisacáridos pueden ser metabolizados por la microbiota intestinal humana, y que los polisacáridos modulan la comunidad bacteriana humana y los metabolitos que producen in vitro, incluyendo los SCFAs. Sin embargo, algunas consideraciones metodológicas son fundamentales para el uso de este protocolo. Por ejemplo, las muestras fecales deben recogerse lo antes posible, y se debe utilizar una cámara anaeróbica para garantizar el crecimiento de anaerobios obligatorios. Esta última consideración es particularmente crítica, porque la exposición al oxígeno puede conducir a la muerte de algunas poblaciones bacterianas intestinales y, por lo tanto, la alteración de la comunidad bacteriana. Además, los xenobióticos se metabolizan en el sistema digestivo superior. Por lo tanto, modelar las interacciones entre los xenobióticos y la microbiota del sistema digestivo inferior es una consideración importante para el modelado in vivo.
Los experimentos de fermentación por lotes tienen claras ventajas sobre los estudios en humanos y animales in vivo porque son más viables y convenientes desde el punto de vista económico. Además, se pueden utilizar para investigar la variación interindividual de las respuestas de la microbiota intestinal humana a la exposición xenobiótica. Además, la fermentación por lotes se puede aplicar fácilmente para manipular comunidades de microbiotas y evaluar sus funciones metabólicas asociadas. Sin embargo, los sistemas de fermentación por lotes sufren de la limitación de la dinámica de estado estático. Investigaciones futuras podrían implementar chemostats biorreactores que permitan la modulación dinámica del pH, la temperatura y la peristalsis, manteniendo al mismo tiempo un suministro constante de nutrientes y la eliminación continua de residuos. Tales actividades permitirían a los experimentos imitar mejor los tracto intestinales in vivo y proporcionar nuevos conocimientos para complementar los de los experimentos de fermentación por lotes. Una limitación adicional de los experimentos de fermentación por lotes es que eliminan todas las interacciones de tejido saqueder de microbioma. Esto podría ser una consideración particularmente importante, ya que algunos xenobióticos (por ejemplo, metanfetamina) pueden ser co-metabolizados por las células humanas y la microbiota intestinal27. Además, estudios recientes han indicado que el metagenoma intestinal (GM) puede regular indirectamente el metabolismo xenobiótico mediante la regulación de la regulación de la regulación de la regulación de la expresión génica del huésped8.
Aunque todavía se necesitan desarrollos de sistemas de fermentación por lotes, estos sistemas pueden ser ampliamente utilizados para el cribado rápido y de alto rendimiento de interacciones entre xenobióticos y microbiota intestinal humana. La dilucidación de los mecanismos subyacentes a la resistencia xenobiótica y el metabolismo en los microbiomas intestinales humanos activos proporcionará información importante sobre la variación inexplicable paciente-paciente en la eficacia y toxicidad de los medicamentos8,9. Además, una comprensión más detallada de cómo las dietas y los componentes alimentarios específicos alteran los metabolismos microbianos y, en consecuencia, afectan a la salud del huésped es el primer paso hacia la realización del objetivo de la medicina personalizada a través de la modulación de la microbiota.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses. Las cifras fueron citadas en Yin et al. 11.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por la National Nature Science Foundation of China (No. 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (No. 2018JJ3200), y el programa de construcción de disciplina característica aplicada en la Universidad de Ciencia e Ingeniería de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia linguística durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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