Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.
Abstract
Primaire neuron cultuur is een essentiële techniek op het gebied van de neurowetenschappen. Om diepere mechanistische inzichten in de hersenen te krijgen, is het essentieel om een robuust in vitro model te hebben dat kan worden misbruikt voor verschillende neurobiologie studies. Hoewel primaire neuron culturen (dat wil zeggen, lange termijn hippocampal culturen) hebben wetenschappers voorzien van modellen, het is nog niet de complexiteit van het hersen netwerk volledig vertegenwoordigen. In het kielzog van deze beperkingen, een nieuw model is ontstaan met behulp van neuro sferen, die een nauwere gelijkenis met het hersenweefsel draagt. Het huidige protocol beschrijft de beplating van hoge en lage dichtheid van gemengde corticale en hippocampal neuronen geïsoleerd van het embryo van embryonale dag 14-16 Sprague Dawley ratten. Dit maakt het mogelijk voor de generatie van neuro sferen en de lange termijn primaire neuron cultuur als twee onafhankelijke platforms om verdere studies uit te voeren. Dit proces is zeer eenvoudig en kosteneffectief, omdat het minimaliseert verschillende stappen en reagentia eerder beschouwd als essentieel voor neuron cultuur. Dit is een robuust protocol met minimale vereisten die kunnen worden uitgevoerd met haalbare resultaten en verder worden gebruikt voor een verscheidenheid aan studies met betrekking tot neurowetenschappen.
Introduction
De hersenen is een ingewikkelde circuits van neuronale en niet-neuronale cellen. Al jaren proberen wetenschappers inzicht te verwerven in deze complexe machines. Om dit te doen, neurowetenschappers aanvankelijk toevlucht genomen tot verschillende getransformeerde zenuw-gebaseerde cellijnen voor onderzoeken. Echter, het onvermogen van deze klonale cellijnen om sterke synaptische verbindingen en goede axonen of dendrites te vormen hebben de wetenschappelijke belangstelling verschoven naar primaire neuron culturen1,2. Het meest opwindende aspect van de primaire neuron cultuur is dat het een kans creëert om levende neuronen3te observeren en te manipuleren. Bovendien, het is minder complex in vergelijking met zenuwweefsel, waardoor het een ideale kandidaat voor het bestuderen van de functie en het vervoer van verschillende neuronale eiwitten. Onlangs hebben verschillende ontwikkelingen op het gebied van microscopie, Genomics en proteomica nieuwe mogelijkheden voor neurowetenschappers opgeleverd om neuron culturen4te exploiteren.
Primaire culturen hebben neurowetenschappers toegestaan om de moleculaire mechanismen achter neurale ontwikkeling te verkennen, verschillende neurale signalerings trajecten te analyseren en een meer samenhangend begrip van Synapsis te ontwikkelen. Hoewel een aantal methoden hebben gerapporteerd culturen van primaire neuronen (meestal uit de hippocampal oorsprong5,6,7), een uniform protocol met een chemisch gedefinieerd medium dat de lange termijn cultuur van neuronen maakt is nog steeds nodig. Echter, neuronen verguld met een lage dichtheid worden meestal waargenomen, die niet overleven op lange termijn, waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan trofische ondersteuning8 die wordt geleverd door de aangrenzende neuronen en gliacellen. Sommige methoden hebben zelfs voorgesteld co-culturing van de primaire neuronen met gliacellen, waarbij de gliacellen worden gebruikt als een feeder Layer9. Echter, gliacellen vormen een heleboel problemen als gevolg van hun overmatige groei, die soms de neuronale groei10overschrijven. Vandaar, gezien de bovenstaande problemen, een eenvoudigere en meer kosteneffectieve primaire neurale cultuur protocol is vereist, die kan worden gebruikt door zowel neuro biologen en neuro chemici voor onderzoeken.
Een primaire neuron cultuur is in wezen een vorm van 2D cultuur en vertegenwoordigt niet de plasticiteit, ruimtelijke integriteit, of heterogeniteit van de hersenen. Dit heeft aanleiding gegeven tot de noodzaak van een geloofwaardiger 3D-model genaamd neuro sferen11,12. Neuro sferen presenteren een nieuw platform aan neurowetenschappers, met een nauwere gelijkenis met de echte, in vivo hersenen13. Neuro sferen zijn niet-aanhankelijke 3D-clusters van cellen die rijk zijn aan neurale stamcellen (NSCs), neurale voorlopercellen (Npc's), neuronen en astrocyten. Ze zijn een uitstekende bron voor de isolatie van neurale stamcellen en neurale voorlopercellen, die kunnen worden gebruikt om differentiatie te bestuderen in verschillende neuronale en niet-neuronale kilometerstanden. Opnieuw, variabiliteit binnen neurosphere culturen geproduceerd met behulp van de eerder gerapporteerde protocollen presenteert een barrière voor de formulering van een uniforme neurosphere Culture protocol14.
Dit manuscript presenteert een protocol waarin het mogelijk is om zowel 2D-als 3D-platforms te genereren door de dichtheden van celplating te wisselen van een gemengde corticale en hippocampal-cultuur. Het is waargenomen dat binnen 7 dagen vrij-zwevende neuro sferen worden verkregen uit hoge dichtheid vergulde neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo, die bij verdere cultuur, vormen bruggen en interconnecties door middel van radiale glial-achtige extensies. Evenzo, in de lage dichtheid vergulde neuronen, een primaire neuron cultuur die kan worden gehandhaafd voor maximaal 30 dagen wordt verkregen door het wijzigen van het onderhouds medium twee keer per week.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures met betrekking tot dier werden goedgekeurd door de Commissie voor institutionele dierenethiek van het CSIR-Indisch Instituut voor chemische biologie (IICB/AEC/Meeting/apr/2018/1).
1. voorbereiding van het reagens en de media
- Poly-D-Lysine (PDL) oplossing: bereid PDL-oplossingen voor in concentraties van 0,1 mg/mL in gedeïoniseerd water en bewaar deze in 4 °C tot het gebruik.
- Dissociatie medium: tot 1 L steriel, gefilterd gedeïoniseerd water, de volgende componenten in de respectieve concentraties combineren: natriumchloride (8 mg/mL), kaliumchloride (0,4 mg/mL), kalium fosfaat monobasisch (0,06 mg/mL), D-glucose (1 mg/mL), dibasisch natriumfosfaat (0,479 mg/mL) en 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur; 10 mM]. Vortex alle componenten om het juiste mengen te helpen en op te slaan in 4 °C tot gebruik.
Opmerking: gebruik het dissociatie medium in ijskoude vorm tijdens dissociatie, maar bij kamertemperatuur (RT) voor wassen en andere doeleinden. - Plating medium: beplating medium bestaat uit het volgende: minimaal Essential medium (MEM) Eagle's met Earle's uitgebalanceerde zoutoplossing (BSS; 88,4%), D-glucose (0,6%), paarden serum (10%), en penicillaire/streptomycine (1%). Combineer de componenten in de respectievelijke verhoudingen en voer de procedure in een afzuigkap uit onder steriele omstandigheden.
Opmerking: gebruik altijd vers bereid beplating medium om degradatie van een component te voorkomen. - Onderhouds medium: bereid het onderhouds medium voor door het volgende te combineren in de respectieve verhoudingen: neurobasal medium (97%), 0,5 mM commercieel verkregen glutamine monster, B27 serum-vrij supplement (2%), en penicillaire/streptomycine (1%). Combineer de componenten in de respectievelijke verhoudingen en voer de procedure in een afzuigkap uit onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle onderdelen vers worden bereid.
2. voorbereiding van de dekstroken
- Neem een ronde glazen afdekplaat met een diameter van 12 mm en dompel deze in 1 M zoutzuur (HCl) gedurende 4 uur.
- Breng de afdek stroken in gedistilleerd water met behulp van een paar tang en zwenk het zachtjes om het zuur volledig te ontdoen.
- Breng de gewassen dekstroken over voor een extra reinigings ronde in een bekerglas met 100% ethanol.
- Voordat u de dekstroken gebruikt, droog ze goed in de laminaire kap door ze op tissuepapier te houden.
3. bereiding van poly-D-Lysine gecoate platen voor neuron cultuur
- Neem 2 24 goed platen: een voor hoge dichtheid plating en een andere voor lage dichtheid beplating. Open de steriele pakketten alleen in de laminaire kap.
- Breng de 12 mm steriele glazen afdekplaten in de 24-pits.
- Giet 300 μL PDL-oplossing (0,1 mg/mL in gedeïoniseerd water) in elke put, zodat deze volledig het oppervlak van de dekstroken bedekt.
- Wikkel de platen met aluminiumfolie om uitdroging te voorkomen en houd het 's nachts in de CO2 -incubator.
- De volgende dag (voor het beplating), aspireren de PDL oplossing en was goed met 300 μL steriel gedeïoniseerd water twee tot drie keer.
- Voeg 200 μL vers bereide beplating medium toe en keer de platen terug naar de incubator tot het beplating.
4. verwijdering en onthoofding van de foetus
Opmerking: Steriliseer alle chirurgische instrumenten verpakt in aluminiumfolie in een autoclaaf bij 121 °C (15 psi) gedurende 30 min. Dit omvat een paar stompe-end schaar, Tang, fijne Tang, twee fijne schaar, en een slagader Tang voor de gehele procedure.
- Voor het genereren van neuronen en neuro sferen, gebruik een getimede-zwangere Sprague Dawley rat en markeer de dag met vaginale plug detectie als E0.
Opmerking: de cultuur moet worden uitgevoerd tussen E14-e16. - Op de dag van de cultuur, plaats een steriele glazen Petri plaat op ijs en vul hem met de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Cold Hank.
- Anesthetiseer een E14-e16 zwangere rat met een intraperitoneale (i.p.) injectie van 90 mg ketamine/kg lichaamsgewicht en 10 mg xylazine/kg, dan offeren door het uitvoeren van cervicale dislocatie.
Opmerking: ratten kunnen ook worden geëerd door een overdosis van pentobarbital of overdosering van ketamine met xylazine of diazepam. - Steriliseer de buik van de moeder door het spuiten van 70% ethanol en maak een V-vormige snede in de buikstreek met behulp van steriele Tang en een paar stompe-end schaar.
- Neem de embryonale zakjes voorzichtig op de Petri plaat met koude HBSS-oplossing.
Opmerking: gebruik niet dezelfde Tang en schaar die alleen voor de huid zijn gebruikt, omdat dit de inwendige organen zal verontreinigen. Gebruik een andere set schaar/Tang voor de inwendige organen. - Neem de embryo's uit de embryonale zakjes in verse, koude HBSS.
- Onthapitate het hoofd met steriele schaar.
5. verwijdering van de hersenen en dissectie van de cortex met Hippocampus
- Vul voordat u begint 90 mm steriele Petri schaaltjes met koude, steriele HBSS.
- Breng de koppen in de steriele gerechten met behulp van steriele, stompe-ended dressing Tang.
- Houd onder de stereomicroscoop het hoofd van de snuit regio met steriele, geserkestreerde Tang en verwijder de hersenen door de huid en de schedel open te snijden.
- Verzamel alle embryo hersenen op dezelfde manier in de HBSS-oplossing.
- Verwijder alle hersenvliezen van de hemisferen en de buik door het vasthouden van de hersenstam.
- Verwijder voorzichtig de intacte hemisferen die lijken op champignon caps die de hippocampus en cortex bevatten.
- Verzamel de hemisferen met cortex en intact Hippocampus in een conische buis van 15 mL met 10 mL dissociatie medium.
6. dissociatie van corticale en hippocampale weefsel in enkelvoudige neuronen
- Laat de verzamelde weefsels te vestigen en aspireren het dissociatie medium, waardoor 5%-10% van medium in het.
- Voeg 10 mL vers dissociatie medium toe aan het weefsel en herhaal stap 6,1 tweemaal.
- Voeg 4,5 mL dissociatie medium en 0,5 mL 0,25% (1x) trypsine EDTA (ethyleen diamine tetraacetaat) oplossing toe.
- Houd het weefsel gedurende 20 minuten in de incubator bij 37 °C, zodat de spijsvertering doorgaat.
- Zuig het medium op en voeg opeenvolgend 10 mL dissociatie-en beplating medium toe aan de verteerde weefsels.
- Laat de verteerde weefsels te vestigen en aspireren de dissociatie medium. Voeg 2,5 mL beplating medium toe en giet in de basis van een 90 mm steriele schaal.
- De verteerde weefsels in de hoek bodem van de schaal met een pipetpunt van 1.000 μL tritureren om het minimale volume te bezetten.
- Passeer de verkregen celsuspensie via de celzeef van 70 μm, met uitzondering van stukjes weefsel.
- Bepaal de dichtheid van levensvatbare cellen met behulp van de trypan Blue Dye-uitsluitings methode en Tel het aantal cellen in een geautomatiseerd cellen teller.
- Voor trypan Blue Dye uitsluitings methode, neem 10 μL van de celsuspensie en 10 μL van 0,4% trypan blauwe vlek, meng grondig, en voeg 10 μL van het mengsel in een van de twee ingesloten kamers van de wegwerp kamer dia's.
- Plaats de dia met het mengsel in de celteller en haal de meting op.
Opmerking: de trypan Blue Dye uitsluitings methode is gebaseerd op het principe dat levende cellen (als gevolg van hun intacte membranen) trypaanse blauwe kleurstof uitsluiten en dus een duidelijk cytoplasma vertonen, in vergelijking met een niet-levensvatbare cel die gemakkelijk trypan blauw zal innemen en blauw zal verschijnen in kleur15.
- Verdun het aantal cellen dat is verkregen op plaat 1,5 x 105 cellen/ml voor hoge dichtheid en 20.000 cellen/ml voor lage dichtheid in twee afzonderlijke buisjes die 30 ml elk van het beplating medium bevatten.
- Aspirate het eerder toegevoegde beplating medium van elke put en plaat 500 μL cellen gedispergeerd in plating medium in elke put.
- Daarna retourneer de platen naar de incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 4 uur.
- Onderzoek de cellen voor hechting onder de Microscoop 4 h na het bekleden.
- Als de cellen in beide platen goed worden nageleefd, vervang dan het medium in elk goed met 500 μL vers onderhouds medium en incuberen bij 37 °C.
- Cultuur deze neuronen geteeld bij lage dichtheid voor 30 dagen door het veranderen van het onderhouds medium 2x per week.
- Cultuur de neuro sferen verkregen uit de met hoge dichtheid geplateerde neuronen in hetzelfde onderhouds medium door ze over te brengen naar de ultra-lage bevestigings platen.
- Karakteriseren de neuronen en de neuro sferen door ze te immunokleuring met belangrijke markers. Voor immunocytochemie, eerste fix de cellen/neurospheres met behulp van 4% formaldehyde voor 30 min op de plaat zelf, vervolgens permeabilize de cellen met 0,1% niet-ionische wasmiddel gedurende 10 min.
- Voeg primaire antilichamen toe voor beide neuronen (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) en neuro sferen (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 1:300 concentraties en incuberen 's nachts bij 4 °C16.
Opmerking: de Tuj1 (klasse III β-tubulin) en tau zijn positieve markers voor de primaire neuronen, terwijl GFAP (glial fibrillair zuur eiwit) en O4 (oligodendrocyte marker) negatieve markers zijn voor primaire neuronen17,18. In het geval van neuro sferen, Tuj1, GFAp en nestin dienen allemaal als positieve markers19,20. - De volgende dag de cellen met PBS één of twee keer wassen en passende secundaire antilichamen in PBS toevoegen bij 1:600-concentraties bij RT gedurende 2 uur.
Opmerking: de anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen worden geselecteerd afhankelijk van de gastheer soorten van het primaire antilichaam toegevoegd. Er moet in gedachten worden gehouden dat de secundaire antilichamen moeten worden geconjugeerd aan fluorescentie derivaten die geschikt zijn voor fluorescentiemicroscopie doeleinden. - Was de cellen een of twee keer opnieuw met PBS.
- Voer kern kleuring van de cellen uit met Hoechst 33258 (1 mg/mL stockoplossing in gedeïoniseerd water). Bereid 0,1% Hoechst oplossing in PBS uit de stockoplossing en voeg deze toe aan de cellen.
- Inincuberen de cellen met 0,1% Hoechst oplossing voor 30 min, dan weer wassen met PBS.
- Voeg 20 μL PBS (of afdekmedium) op de dia toe en monteer de Afdeklijst langzaam met de gekleurde cellen over het gebied van de dia die PBS bevat. Sluit de marges van de dekslip af met dibutylftalaatpolystyreen xyleen (DPX).
- Uitvoeren van Imaging van de vaste cellen onder een microscoop bij 10x en 40x vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol is een eenvoudige strategie opgehelderd waarin variabele celplating dichtheden van twee verschillende neurale screenings platforms worden verkregen. Figuur 1a,B illustreert de hechting van cellen na 4 h van het beplating van de neuronen in respectievelijk hoge en lage dichtheid vergulde cellen. Bij het observeren van de juiste hechting van de neuronen zoals weergegeven in Figuur 1, werd het beplating medium vervangen door het onderhouds medium in elk van de putjes en keerde het daardoor terug naar de incubator bij 37 °c. Relatief meer celhechting werd waargenomen in de hoge dichtheid vergulde neuronen. Na 24 h van plating, zowel hoge en lage dichtheid vergulde neuronen toonde uitgebreide neuronale uitbreidingen en synaptische interconnecties, zoals waargenomen in de differentiële interferentie contrast (DIC) beelden in Figuur 2a,B.
In Figuur 3awordt een fase-contrastafbeelding van de laagdichtheids cellen na 7 dagen in de cultuur weergegeven. Hier, de neuronen hebben een uitgebreide synaptische netwerk bestaande uit dendritische takken ontwikkeld. Deze neuronen kunnen verder worden gehandhaafd voor maximaal 30 dagen door het veranderen van het onderhouds medium elke 3 dagen met de ontwikkeling van meer ingewikkelde neuronale netwerken. In Figuur 3b,C, werd immunocytochemische kleuring uitgevoerd om de neuronale aard van cultuur neuronen met lage dichtheid te onthullen door kleuring met neuronale markers Tuj1 (een marker van gedifferentieerde neuronen)21 en tau (een marker van axonen)22 , respectievelijk. De rode kleur in Figuur 3b geeft de aanwezigheid van Tuj1 kleuring aan en groen in figuur 3c representeert vlekken in de axonen van primaire neuronen. Zuiverheid van de neuronale cultuur wordt aangetoond door de afwezigheid van kleuring van niet-neuronale markers voor GFAP van astrocyten (figuur 3D) en O4 van oligodendrocyten (figuur 3e). De in het blauw getoonde kernen werden gekleurd met Hoechst 33258.
De hoge dichtheid geplateerde neuronen na 7 dagen worden gekenmerkt door de vorming van spontane neuro sferen, zoals waargenomen in figuur 4a,B,C,D. Na 8-10 dagen werden verschillende bruggen, bestaande uit radiale gliacellen achtige verlengingen, waargenomen tussen neurosferen, zoals te zien in figuur 4e. De neuro sferen waren rijkelijk begiftigd met Npc's, die coexpress markers Nestin en Tuj123. De neuro speheres vertonen positieve kleuring van Nestin en tuj, zoals weergegeven in Figuur 524. De kernen getoond in blauw werd gekleurd met Hoechst 33258. Deze neurosferen kunnen enkele weken worden gehandhaafd door ze te kweken in uiterst lage bevestigings platen. In Figuur 6werd de levensduur van neuronen gekweekt voor ongeveer 30 dagen geëvalueerd, en de levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten met een interval van ~ 5 dagen met behulp van de conventionele MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromide] Assay, waarin het werd gevonden dat de neuronen toonde meer dan 90% levensvatbaarheid zelfs na 30 dagen van cultuur.
Vervolgens werd het percentage astrocyten in de geseede culturen met hoge en lage dichtheid beoordeeld. Aangezien deze methodologie voornamelijk gericht is op het kweken van neuronen, was het belangrijk om te beoordelen of deze methode de preferentiële groei van neuronen boven niet-neuronale cellen ondersteunt, met name astrocyten. De aanwezigheid van een populatie van astrocyten werd waargenomen in de neurosphere-vormende hoge dichtheid geseede cultuur, gekenmerkt door de groene kleur van GFAP-kleuring in figuur 7A; Hoewel, significant minder werd waargenomen in vergelijking met de Tuj1 (rood)-bevlekt neuronale populatie. Dit werd ook bevestigd door de kwantitatieve gegevens in figuur 7b, waarbij ~ 17% populaties cellen waren GFAP-uitdrukken, vergeleken met 83% van de bevolking in Tuj1 uitdrukken van cellen.
De astrocytische populatie werd ook onderzocht door GFAP-kleuring, vergeleken met neuronale populatie (Tuj1 kleuring) in geseede cellen met lage dichtheid, gedurende 7 opeenvolgende dagen. Hoewel een significant verschil in het totale aantal cellen niet werd waargenomen in de loop van 7 dagen, werd de populatie van de astrocyten ook zeer laag waargenomen (bijna geen of zeer lage GFAP-kleuring), waarbij de meerderheid de neuronale populatie was (zeer hoge Tuj1 uitdrukking) zoals waargenomen in figuur 8a.
Zoals weergegeven in figuur 8b, werd kwantitatieve analyse uitgevoerd door de populatie van astrocyten en neuronen verkregen door middel van microscopie te tellen met behulp van de cellsens software, waarbij slechts ~ 2%-3% van de astrocyten populatie in eerste instantie werd waargenomen. Vanwege het gebrek aan geschikte media en voedingsstoffen om de groei te ondersteunen, is deze populatie van astrocyten ook langzaam in de loop van de tijd verdwenen, terwijl in de aanwezigheid van optimale factoren en media de neuronen snel de hele cultuur overnamen.
Zoals getoond in Figuur 9, werd opgemerkt dat als gevolg van de aanwezigheid van npc's, de neuro sferen ook uitgedrukt hoge hoeveelheden astrocyten, gekenmerkt door het sterke groene signaal van GFAp kleuring samen met een sterkere Tuj1 signaal. Tot slot, om te observeren of deze neuro sferen na verloop van tijd uitgebreid, na 1 week van high-density cultuur, op welk punt de kleine neuro sferen begon te vormen, een paar werden overgebracht in ultra-lage bevestigings platen en hun groei werd gecontroleerd om de 5 dagen voor maximaal 15 dagen.
Een levende/dode celassay werd ook uitgevoerd met calceïne am (groen) en propidium jodide (rood) om de gezondheid van de cellen te controleren. Er werd opgemerkt dat de uitbreidende neurosferen een grote hoeveelheid groene fluorescentie vertoonden zonder rode kleuring, wat duidt op geen dood in de neurosferen gedurende ten minste maximaal 15 dagen in de cultuur, zoals weergegeven in figuur 10A. Zoals getoond in figuur 10B, werd de volumineuze expansie van de neuro sferen op elke 5 dagen in de cultuur gedurende maximaal 15 dagen waargenomen. Voor het uitzetten van de lijngrafiek die de uiteindelijke toename van het volume van neuro sferen (voor elk tijdpunt), 50 neuro sferen werden bestudeerd, en hun gemiddelden werden gebruikt voor het afleiden van de neurosphere volumes op elk tijdpunt.
Figuur 1 : Weergave van celhechting na 4 h van beplating. A) celhechting in hoge dichtheid geplateerde neuronen. (B) hechting van de cel in lage dichtheid geplateerde neuronen. Schaalbalk in (A, B) is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Celmorfologie van neuronen na 24 h van beplating. A) celmorfologie van de met hoge dichtheid geplateerde neuronen. B) celmorfologie van geplateerde neuronen met lage dichtheid. Schaalbalken in (A, B) vertegenwoordigen 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Morfologie en karakterisering van lage dichtheid geplateerde neuronen na 7 dagen. (A) fase-contrast beeld van neuronen die uitgebreid kiemen vertonen. Schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm. overlay-afbeeldingen met expressie voor neuronale eiwitten (B) Tuj1 (rood) en (C) tau (groen). Immnunocytochemie toont duidelijk de afwezigheid van kleuring in niet-neuronale eiwitten (D) GFAP (groen) en (E) O4 (rood). Nuclei werden bevlekt met Hoechst 33258 (blauw). Schaal staven in (B, C, D, E) vertegenwoordigen 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Vorming van neurosferen in hoge dichtheid vergulde neuronen na 7 dagen. (a-D) Spontaan gegenereerde neuro sferen na 7 dagen in de cultuur van de hoge dichtheid vergulde neuronen. E) vorming van radiale gliale-achtige verlengingen tussen twee nieuw gevormde neurosferen zoals aangegeven door zwarte pijlen. Schaalbalken in (A, B, C, D, E) vertegenwoordigen 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Karakterisering van de verkregen neurosferen. Overlay afbeelding van de neuro sferen tonen expressie voor neuronale eiwit Tuj1 (rood) en neurale stam cel marker nestin (groen), wat duidt op een NPC-rijke populatie. Nuclei werden bevlekt met Hoechst 33258 (blauw). Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : De levensvatbaarheid van de cellen van primaire neuronen. Het staafdiagram vertegenwoordigt de levensvatbaarheid van de cellen van de primaire neuronen, beoordeeld met behulp van een MTT-test voor maximaal 30 dagen met intervallen van 5 dagen. Foutbalk staat voor SD van de waarde (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 : Karakterisering van neurosphere-vormende hoge dichtheids culturen met neuronale marker Tuj1 en astrocyten marker GFAP. (A) het beeld toont hoge dichtheid geseede cellen (in dic-modus), die neuropsheres genereert die zowel GFAP (voor astrocyten) als Tuj1 (voor neuronen) uitdrukken. Nuclei werden bevlekt met Hoechst 33258. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm.B) staafdiagram vertegenwoordigt het percentage van de populatie van Tuj1-uitdrukken cellen en GFAP-uitdrukken cellen in de neurosphere genereren van hoge dichtheid cellen. Foutbalk staat voor SD (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8 : Karakterisering van lage dichtheid vergulde cellen voor primaire neuron cultuur met neuronale marker Tuj1 en astrociet marker GFAP continu tot 7 dagen. A) het beeld toont de geseede cellen met lage dichtheid in vier verschillende kanalen (d.w.z. dic, blauw kanaal [duidt op nucleaire kleuring door Hoechst 33258], groen kanaal [GFAP kleuring] en rood kanaal [voor Tuj1 kleuring]) gedurende 7 dagen continu. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. (B) het staafdiagram vertegenwoordigt de procentuele verhouding van de populaties van Tuj1-uitdrukken van cellen tot die van GFAp-uitdrukken van cellen in de cellen met lage dichtheid voor de primaire neuron cultuur gedurende 7 dagen. Foutbalk staat voor SD (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9 : Immunokleuring van verkregen neurosferen met GFAP en Tuj1. Beelden van de verkregen neurosferen zijn (a) in de dic-modus, (B) Nucleus kleuring met behulp van Hoechst 33258, (C) astrocyten marker GFAP (groen) en (D) neuronale marker Tuj1 (rood). Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10 : Groei en levende/dode celassay van neuro sferen gedurende 15 dagen. (A) afbeelding toont de groei van een neurosphere over 15 dagen bij 5-daagse intervallen in de dic-modus, evenals de kleuring met calceïne am (groen duidt op levende cellen) en Pi (propidium jodide met een rode kleur geeft dode cellen aan). Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. (B) grafiek staat voor de toename van de grootte van neuro sferen geteeld in lage hechting platen over een periode van 15 dagen op 5 dag intervallen. Foutbalk staat voor SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft dat hoe door het veranderen van de celplating dichtheden van primaire neuronen, twee variabele neuronale platformen worden verkregen. Hoewel dit een eenvoudige methode is, moet elke stap nauwgezet worden uitgevoerd om de gewenste resultaten te bereiken. Andere voorgaande methoden hebben ofwel gemeld op lange termijn primaire neuron culturen of neurosphere culturen. De meeste primaire neuron cultuur protocollen hebben betrokken de kweek van hippocampal neuronen voor 3-5 weken, maar de meeste hebben gefaald, als de neuronen sterven en verdorren weg als gevolg van verlies van verbindingen. Een ander voordeel van het protocol is dat de neuronen kunnen worden gekweekt zonder de noodzaak voor een gliacellen feeder laag, vandaar het behoud van de zuiverheid van de neuronen.
Echter, verschillende kritische stappen moeten zorgvuldig worden gevolgd om de gewenste resultaten te verkrijgen. Ten eerste is het absoluut noodzakelijk om steriele omstandigheden te behouden. Het wordt geadviseerd om de meeste stappen uit te voeren in een laminaire kap, evenals pre-clean alle platen, instrumenten, en chirurgische gereedschappen met 70% alcohol voordat u begint; anders is er een grotere kans op falen als gevolg van besmetting door bacteriën en schimmels. Vervolgens is het belangrijk om E14-16 embryo's te isoleren; Vandaar, de vaginale plug detectie stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd. Naarmate de embryonale dag toeneemt, hoe groter de kans op besmetting door niet-neuronale cellen. Volledige verwijdering van hersenvliezen van de hersenhelften is uiterst belangrijk om interferentie in de cultuur te verminderen door niet-neuronale cellen. Zowel de plating als het onderhouds medium moeten vers worden bereid met alle componenten, omdat elk onderdeel een essentiële rol speelt. Een andere factor die in gedachten moet worden gehouden is dat de primaire neuronen verkregen moeten worden gehandhaafd door het veranderen van het onderhouds medium 2x per week zodat de voedingsstoffen toevoer naar de prolifererende neuronen constant blijft.
Hoewel het nog niet is geprobeerd, dit protocol met kleine wijzigingen kan ook nuttig zijn in de muis embryonale neuronen. Als de gewenste neuronen of neuro sferen niet worden verkregen na deze techniek, er zijn een paar tips voor het oplossen van problemen die nuttig kunnen zijn. Om de weefsels levensvatbaar te houden, moet het dissectie worden uitgevoerd in ijskoude HBSS. De dissectie kan ook worden uitgevoerd in ijskoude Krebs-buffer in plaats van HBSS-buffer. Snel uitvoeren van de dissectie is de sleutel tot het behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel. Het gebruik van 10x trypsine zal leiden tot oververte ring van het weefsel. Daarom moet 10x trypsine-EDTA-oplossing worden verdund tot 1x in dissociatie buffer voorafgaand aan de spijsvertering. De toevoeging van ijskoud medium aan de cellen, inducerende Vries schok, moet ten alle kosten worden vermeden en in plaats daarvan moet medium na het bereiken van RT worden gebruikt. Belangrijker nog, de dekstroken moeten altijd worden bekleed met PDL, anders zullen de neuronen niet hechten aan de dekstroken. In geval van moeilijkheden tijdens het uitvoeren van de trituratie stap (d.w.z. weefsel dat niet goed verteerd is), kan de spijsvertering worden uitgevoerd door 0,5 mL 1% DNase gedurende 10 minuten toe te voegen. Als hoge mate van besmetting door niet-neuronale cellen worden aangetroffen, ~ 5 μM Cytosine uracilarabinoside (araC) moet worden toegevoegd om te voorkomen dat de groei van niet-neuronale cellen.
Ondanks de verschillende voordelen heeft deze techniek te kampen met enkele beperkingen. Het is bekend dat deze techniek spontaan neurosferen genereert (hoewel de triggering moleculaire mechanismen niet bekend zijn); echter, weinig onduidelijkheden met betrekking tot deze techniek blijven, zoals de exacte grootte van de gevormde neuro sferen en exacte aantal dagen nodig om een voldoende aantal neuro sferen te vormen. Meestal is de grootte het probleem. Hoewel geconstateerd is dat neuro sferen in volume uitbreiden na verloop van tijd, de initiële neuro sferen verkregen zijn van variabele grootte. Hoewel nuttig, het maakt het moeilijk om een gesynchroniseerde studie uit te voeren. Wat onderscheidt dit neurosphere Generation Protocol van anderen is de robuustheid en eenvoud. Er zijn eerder gerapporteerde protocollen voor het kweken en propageren van neuropheres die speciale medium vereisten en cultuuromstandigheden vereisen, geen van die is vereist in dit protocol. In deze eerder gerapporteerde protocollen, er is nauwelijks uniformiteit voor degenen op zoek naar het genereren van neuro sferen.
Over het algemeen beschrijft dit protocol een unieke strategie voor het genereren van zowel 2D-als 3D-neuronale platformen door eenvoudigweg de celbeplating dichtheden van primaire neuronen te wijzigen die geïsoleerd zijn van embryo's van E14-e16 Sprague Dawley Rats. Deze methode is kostenbesparend in vergelijking met andere methoden, omdat deze kan worden uitgevoerd met een eenvoudige set-up en veel minder reagentia en stappen vereist. Het kan verschillende toepassingen van belang voor neurowetenschappers bieden. Dit kan worden gebruikt als screening platforms voor verschillende neuro-therapeutische leads, observeren van de rollen van verschillende neuronale lading eiwitten, onderzoeken van cellulaire trajecten in vele neurodegeneratieve ziekten, en vele andere toepassingen. De neuro sferen kunnen verder worden gebruikt voor de screening van verschillende neurale differentiërende middelen en het bestuderen van de vroege stadia van neurale ontwikkeling in vitro25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken CSIR-IICB Animal Facility. G. D. Bedankt ICMR, J. K. en V. G. Thank DST INSPIRE, en D. M. Thanks DBT, India voor hun Fellowships. S. G. erkent SERB (EMR/2015/002230) India om financiële steun te verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G.
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
