Summary
Presenteras här är ett protokoll för spontan generering av neurospheres berikas i neurala stamceller från högdensitetspläterade neuroner. Under samma experiment, när nervceller är klädd i en lägre densitet, protokollet resulterar också i långvariga primära råtta neuron kulturer.
Abstract
Primär neuron kultur är en viktig teknik inom neurovetenskap. För att få djupare mekanistiska insikter i hjärnan, är det viktigt att ha en robust in vitro-modell som kan utnyttjas för olika neurobiologi studier. Även primära neuron kulturer (dvs., långsiktiga Hippocampus kulturer) har gett forskare med modeller, det ännu inte representerar komplexiteten i hjärnans nätverk helt. I kölvattnet av dessa begränsningar, en ny modell har dykt upp med hjälp av neurospheres, som bär en närmare likhet med hjärnvävnaden. Det nuvarande protokollet beskriver bordläggningen av höga och låga densiteter av blandade kortikala och Hippocampus nervceller isolerade från embryot från embryonala dag 14-16 Sprague Dawley råttor. Detta gör det möjligt för generering av neurospheres och långsiktig primär neuron kultur som två oberoende plattformar för att genomföra ytterligare studier. Denna process är mycket enkel och kostnadseffektiv, eftersom det minimerar flera steg och reagenser som tidigare bedömts vara väsentliga för neuron kultur. Detta är ett robust protokoll med minimala krav som kan utföras med uppnåeliga resultat och som ytterligare används för en mångfald av studier relaterade till neurovetenskap.
Introduction
Hjärnan är en intrikat krets av neuronala och icke-neuronala celler. I åratal har forskare försökt att få insikt i denna komplexa maskiner. För att göra det, neuroforskare initialt tillgred olika transformerade nervbaserade cellinjer för utredningar. Emellertid, oförmåga dessa klonala cellinjer att bilda starka synaptiska förbindelser och korrekt axoner eller dendriter har skiftat vetenskapligt intresse för primära neuron kulturer1,2. Den mest spännande aspekten av primär neuron kultur är att det skapar en möjlighet att observera och manipulera levande nervceller3. Dessutom är det mindre komplicerat jämfört med neurala vävnad, vilket gör det till en idealisk kandidat för att studera funktion och transport av olika neuronala proteiner. Nyligen har flera utvecklingar inom områdena mikroskopi, genomik och proteomik genererat nya möjligheter för neuroforskare att exploatera neuron kulturer4.
Primär kulturer har tillåtit neuroforskare att utforska molekylära mekanismer bakom neurala utveckling, analysera olika neurala signalering vägar, och utveckla en mer sammanhängande förståelse av Synapsis. Även om ett antal metoder har rapporterat kulturer från primära nervceller (främst från Hippocampus ursprung5,6,7), ett enhetligt protokoll med ett kemiskt definierat medium som möjliggör långsiktig kultur av nervceller är fortfarande behövs. Emellertid, nervceller klädd i en låg densitet är oftast observeras, som inte överlever långsiktiga, sannolikt på grund av bristen på trofiska stöd8 som tillhandahålls av angränsande nervceller och gliaceller. Vissa metoder har även föreslagit samtidig odling av den primära nervceller med gliaceller celler, varvid gliaceller används som en matar skikt9. Emellertid, gliaceller utgör en hel del problem på grund av deras överväxt, som ibland åsidosätter den neuronala tillväxten10. Därför, med tanke på de problem som ovan, en enklare och mer kostnadseffektiv primära neurala kultur protokoll krävs, som kan användas av både neurobiologer och neurokemister för utredningar.
En primär neuron kultur är i huvudsak en form av 2D-kultur och representerar inte plasticitet, rumslig integritet, eller heterogenitet i hjärnan. Detta har gett upphov till behovet av en mer trovärdig 3D-modell som kallas neurospheres11,12. Neurospheres presentera en ny plattform för neuroforskare, med en närmare likhet med den verkliga, in vivo hjärnan13. Neurospheres är icke-anhängare 3D-kluster av celler som är rika på neurala stamceller (NSCs), neurala progenitorceller (NPCs), nervceller, och astrocyter. De är en utmärkt källa för isolering av neurala stamceller och neurala progenitorceller, som kan användas för att studera differentiering till olika neuronala och icke-neuronala linjer. Återigen, variationer inom neurosphere kulturer produceras med hjälp av tidigare rapporterade protokollen utgör ett hinder för utformningen av en enhetlig neurosphere Culture Protocol14.
Detta manuskript presenterar ett protokoll där det är möjligt att generera både 2D-och 3D-plattformar genom alternerande cellplätering tätheter från en blandad kortikal och Hippocampus kultur. Det observeras att inom 7 dagar fritt flytande neurospheres erhålls från högdensitetspläterade neuroner isolerade från E14-E16 Sprague Dawley råtta embryo, som på ytterligare kultur, bilda broar och sammanlänkningar genom radiella Glial-liknande förlängningar. På samma sätt, i lågdensitetspläterade neuroner, en primär neuron kultur som kan upprätthållas i upp till 30 dagar erhålls genom att ändra underhålls mediet två gånger per vecka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden som involverar djur godkändes av den institutionella djur etikkommittén vid CSIR-Indian Institute of kemisk biologi (IICB/AEC/möte/apr/2018/1).
1. reagens och förberedelse av media
- Poly-D-lysin (PDL) lösning: Förbered PDL lösningar vid koncentrationer av 0,1 mg/mL i avjoniserat vatten och förvara i 4 ° c tills användning.
- Dissociation medium: till 1 L sterilt, filtrerat avjoniserat vatten, kombinera följande komponenter i respektive koncentration: natriumklorid (8 mg/mL), kaliumklorid (0,4 mg/mL), kaliumfosfat monobasisk (0,06 mg/mL), D-glukos (1 mg/mL), natriumfosfat dibasiskt (0,479 mg/ml), och 1 M Hepes [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic syra; 10 mm]. Vortex alla komponenter för att underlätta korrekt blandning och förvara i 4 ° c tills användning.
Obs: Använd dissociation medium i iskall form under dissociation men vid rumstemperatur (RT) för tvättning och andra ändamål. - Plätering medium: plätering medium består av följande: minsta väsentliga medium (MEM) Eagle ' s med Earle ' s balanserade saltlösning (BSS; 88,4%), D-glukos (0,6%), Horse serum (10%), och penicillin/streptomycin (1%). Kombinera komponenterna i respektive nyckeltal och utför proceduren inuti en huva under sterila förhållanden.
Obs: Använd alltid nyberedd plätering medium för att undvika nedbrytning av någon komponent. - Underhålls medium: Förbered underhålls mediet genom att kombinera följande i respektive nyckeltal: neurobasal medium (97%), 0,5 mM kommersiellt erhållna glutamin prov, B27 serum-Free supplement (2%), och penicillin/streptomycin (1%). Kombinera komponenterna i respektive nyckeltal och utför proceduren inuti en huva under sterila förhållanden. Se till att alla komponenter är nyberedda.
2. beredning av täckglas
- Ta en 12 mm diameter runt glas täckglasburk och Blötlägg den i 1 M saltsyra (HCl) för 4 h.
- Överför täckglas i destillerat vatten med hjälp av ett par tång och snurra den försiktigt för att bli av med syran helt.
- Överför de tvättade täckglåren för ytterligare en rengörings runda i en bägare som innehåller 100% etanol.
- Innan du använder täckglas, torka dem väl i laminärt huven genom att hålla dem på silkespapper.
3. beredning av Poly-D-Lysine belagda plattor för neuron kultur
- Ta 2 24 bra tallrikar: en för hög densitet plätering och en annan för lågdensitetplätering. Öppna endast de sterila paketen inuti laminarkåpan.
- Överför 12 mm av sterila glas täckband i 24 väl plattorna.
- Häll 300 μL PDL-lösning (0,1 mg/mL i avjoniserat vatten) i varje brunn så att den helt täcker ytan på täckglas.
- Linda plattorna med aluminiumfolie för att förhindra torkning och hålla den i CO2 inkubator över natten.
- Nästa dag (före plätering), aspirera på PDL lösningen och tvätta ordentligt med 300 μL sterilt avjoniserat vatten två till tre gånger.
- Tillsätt 200 μL nypreparerat pläteringsmedium och returnera plattorna till inkubatorn tills plätering.
4. avlägsnande och halshuggning av fostret
Obs: sterilisera alla kirurgiska instrument förpackade i aluminiumfolie i en autoklav vid 121 ° c (15 psi) för 30 min. Detta inkluderar ett par trubbig-end saxar, pinps, fina pinps, två fina sax, och en artär pinps för hela förfarandet.
- För att generera nervceller och neurosfärer, använda en tidsinställd gravid Sprague Dawley råtta och markera dagen med vaginal plugg upptäckt som E0.
Observera: kulturen måste utföras mellan E14-E16. - På dagen för kulturen, placera en steril glas Petri tallrik på is och fylla den med Cold Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS).
- Anesthetize en E14-E16 gravid råtta med en intraperitoneal (i.p.) injektion av 90 mg ketamin/kg kroppsvikt och 10 mg xylazin/kg, sedan offra genom att utföra cervikal dislokation.
Obs: råttor kan också euthanized av en överdos av pentobarbital eller överdosering av ketamin med xylazin eller diazepam. - Sterilisera dammen buk genom att spraya 70% etanol och göra en V-formad skära i buken med hjälp av sterila Pinkett och ett par trubbiga-end sax.
- Ta de embryonala säckar noggrant på petriskplattan med kallt Hbss lösning.
Obs: Använd inte samma pinps och sax som bara användes för huden, eftersom detta kommer att förorta de inre organen. Använd en annan uppsättning saxar/tång för de inre organen. - Ta embryona ur de embryonala blåsor i färskt, kallt HBSS.
- Halshugga huvudet med steril sax.
5. avlägsnande av hjärna och dissektion av cortex med Hippocampus
- Före start, Fyll 90 mm sterila petriskålar med kallt, sterilt HBSS.
- Överför huvuden i de sterila rätterna med hjälp av sterila, trubbiga förband pinps.
- Under stereomikroskopet, håll huvudet från nos regionen med steril, tandad tång och ta bort hjärnan genom att skära huden och skalle öppen.
- Samla alla embryohjärnor på samma sätt i HBSS-lösningen.
- Ta bort alla hjärnhinnorna från hjärnhalvorna och mellanhjärnan genom att hålla hjärnstammen.
- Ta försiktigt bort intakt halvklot som liknar svamp mössor som innehåller hippocampus och cortex.
- Samla in de halvklot som innehåller cortex och intakt Hippocampus i ett 15 mL koniskt rör innehållande 10 mL dissociationmedium.
6. dissociation av kortikala och Hippocampus vävnad i enstaka nervceller
- Låt de insamlade vävnaderna att bosätta sig och aspirera dissociation mediet, lämnar 5%-10% av mediet i den.
- Tillsätt 10 mL färskt dissociationmedium till vävnaden och upprepa steg 6,1 två gånger.
- Tillsätt 4,5 mL dissociationsmedium och 0,5 mL 0,25% (1x) trypsin EDTA (etylendiamintetraacetat) lösning.
- Förvara vävnaden i inkubatorn vid 37 ° c i 20 minuter för att matsmältningen ska fortsätta.
- Aspirera mediet och tillsätt 10 mL dissociation och plätering medium i följd till smält vävnader.
- Låt smälta vävnader att bosätta sig och aspirera dissociation mediet. Tillsätt 2,5 mL plätering medium och häll i basen av en 90 mm steril maträtt.
- Triturera den smälta vävnader i hörnet basen av skålen med hjälp av en 1 000 μL pipett spets att ockupera den minimala volymen.
- Passera den erhållna cellsuspensionen genom 70 μm cell SIL, exklusive alla bitar av vävnad.
- Bestäm tätheten av livskraftiga celler med hjälp av trypan Blue Dye uteslutnings metod och räkna antalet celler i en automatiserad cell räknare.
- För trypan Blue Dye uteslutnings metod, ta 10 μL av cellsuspensionen och 10 μL av 0,4% trypan blå fläck, blanda grundligt, och tillsätt 10 μL av blandningen i en av de två slutna kamrarna i engångskammaren diabilder.
- Sätt in bilden som innehåller blandningen i cell räknaren och få avläsningen.
Anmärkning: den trypan Blue Dye uteslutningsmetoden är baserad på principen att levande celler (på grund av deras intakt membran) kommer att utesluta trypan blått färgämne och kommer därför att visa en klar cytoplasman, jämfört med en icke-livskraftig cell som lätt kommer att ta upp trypan blå och visas blått i färg15.
- Späd antalet celler som erhålls till plattan 1,5 x 105 celler/ml för hög densitet och 20 000 celler/ml för låg densitet i två separata rör innehållande 30 ml vardera av pläteringsmedlet.
- Aspirera den tidigare tillsatta plätering mediet från varje brunn och plattan 500 μL av celler dispergerade i plätering medium i varje brunn.
- Efter det returnera plattorna till inkubatorn vid 37 ° c och 5% CO2 för 4 h.
- Undersök cellerna för följsamhet under mikroskopet 4 h efter plätering.
- Om det finns korrekt följsamhet av cellerna i båda plattorna, Byt ut mediet i varje brunn med 500 μL av färskt underhålls medium och inkubera vid 37 ° c.
- Kultur dessa nervceller odlas vid låg densitet i 30 dagar genom att ändra underhålls mediet 2x per vecka.
- Odla de neurosfärer som erhålls från de högdensitetspläterade neuronerna i samma underhålls medium genom att överföra dem till de ultra-låga fästplattorna.
- Karakterisera nervceller och neurosfärer genom att immun färgning dem med viktiga markörer. För immunocytokemi, först fixa cellerna/neurospheres med 4% formaldehyd för 30 min på plattan själv, sedan permeabilize cellerna med 0,1% icke-joniska rengöringsmedel för 10 min.
- Tillsätt primära antikroppar för båda neuronerna (anti-Tuj1, GFAP, O4, Tau) och neurospheres (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 1:300 koncentrationer och inkubera över natten vid 4 ° c16.
Anmärkning: den Tuj1 (klass III β-tubulin) och Tau är positiva markörer för den primära nervceller, medan gfap (Glial hjärn sura protein) och O4 (oligodendrocyte markör) är negativa markörer för primära nervceller17,18. När det gäller neurospheres, Tuj1, gfap, och nestin alla tjäna som positiva markörer19,20. - Nästa dag, tvätta cellerna med PBS en eller två gånger och tillsätt lämpliga sekundära antikroppar i PBS vid 1:600 koncentrationer vid RT för 2 h.
Anmärkning: anti-mus eller anti-kanin sekundära antikroppar väljs beroende på värdarter av den primära antikroppen tillsätts. Det bör hållas i åtanke att de sekundära antikropparna måste konjugeras till fluorescensderivat som lämpar sig för fluorescensmikroskopi. - Tvätta cellerna igen med PBS en eller två gånger.
- Utför nukleär färgning av cellerna med Hoechst 33258 (1 mg/mL stamlösning i avjoniserat vatten). Förbered 0,1% Hoechst lösning i PBS från stamlösning och tillsätt den till cellerna.
- Inkubera cellerna med 0,1% Hoechst lösning i 30 min, tvätta sedan igen med PBS.
- Tillsätt 20 μL PBS (eller monteringsmedel) på bilden och montera långsamt täckglaset som innehåller de färgade cellerna över det område i bilden som innehåller PBS. Täta marginalerna på täckslip med dibutylftalat polystyren xylen (DPX).
- Utför avbildning av de fasta cellerna under ett Mikroskop vid 10X och 40x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det här protokollet har en enkel strategi klarlagts där densiteter för variabel cell beläggning från två olika neurala screening-plattformar erhålls. Figur 1a,B illustrerar adherencen av celler efter 4 h av plätering av neuronerna i hög-och lågdensitetspläterade celler, respektive. På observation av korrekt vidhäftning av nervceller som visas i figur 1, pläteringsmediet ersattes av underhålls medium i varje brunnar och därmed återvände till inkubatorn vid 37 ° c. Jämförelsevis mer cellföljsamhet observerades i högdensitetspläterade neuroner. Efter 24 h plätering, både hög och lågdensitetpläterade neuroner visade utarbeta neuronala förlängningar och synaptiska sammanlänkningar, som observerats i differential interferens kontrast (DIC) bilder i figur 2A,B.
I figur 3arepresenteras en faskontrast bild av lågdensitetspläterade neuroner efter 7 dagar i kulturen. Här har nervceller utvecklat en utarbetad synaptiska nätverk bestående av dendritiska grenar. Dessa nervceller kan underhållas ytterligare i upp till 30 dagar genom att ändra underhålls mediet var 3 dagar med utvecklingen av mer intrikata neuronala nätverk. I figur 3b,C, immunocytokemisk färgning utfördes för att avslöja neuronala natur låg densitet kultur nervceller genom färgning med neuronala markörer Tuj1 (en markör för differentierade nervceller)21 och Tau (en markör för axoner)22 , respektive. Den röda färgen i figur 3b indikerar närvaron av Tuj1 färgning, och grön i figur 3c representerar färgning i axonerna av primära nervceller. Renhet av den neuronala kulturen visas av frånvaron av färgning av icke-neuronala markörer för GFAP av astrocyter (figur 3D) och O4 av oligodendrocyter (figur 3e). De kärnor som visas i blått färgas med Hoechst 33258.
De högdensitetspläterade neuronerna efter 7 dagar kännetecknas av bildandet av spontana neurosfärer, som observerats i figur 4a,B,C,D. Efter 8-10 dagar, distinkta broar bestående av radiella gliaceller som förlängningar observerades mellan neurospheres, som framgår av figur 4E. Neurosfärerna begåvades rikt med NPCs, som coexpress markörer Nestin och Tuj123. Den neurospeheres visar positiv färgning av Nestin och tuj, som visas i figur 524. De kärnor som visas i blått färgas med Hoechst 33258. Dessa neurospheres kan bibehållas i flera veckor genom odling av dem i Ultra-låga fästplattor. I figur 6, den livslängd av nervceller odlade i ca 30 dagar bedömdes, och cellernas lönsamhet mättes med ett intervall på ~ 5 dagar med hjälp av konventionella MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid] analys, där det var fann att nervceller visade mer än 90% lönsamhet även efter 30 dagar av kultur.
Därefter bedömdes andelen astrocyter i de höga och lågdensitetsseedade kulturerna. Eftersom denna metod är främst inriktad på odling av nervceller, var det viktigt att bedöma om denna metod stöder preferens tillväxt av nervceller över icke-neuronala celler, särskilt astrocyter. Närvaron av en population av astrocyter observerades i den neurosfär-bildande hög densitet seedade kulturen, präglad av den gröna färgen på GFAP färgning i figur 7a; men, signifikant mindre observerades jämfört med Tuj1 (röd)-färgade neuronala befolkningen. Detta bekräftades också på nytt genom de kvantitativa uppgifterna i diagram 7b, där ~ 17% av cellerna var gfap-uttryck, jämfört med 83% av befolkningen i Tuj1 som uttrycker celler.
Den astrocytic befolkningen var också undersökts genom GFAP färgning, jämfört med neuronala befolkningen (Tuj1 färgning) i låg densitet seedade celler, för 7 kontinuerliga dagar. Även om en signifikant skillnad i totala cell antalet inte observerades under loppet av 7 dagar, på grund av låg seeding, var astrocytpopulationen också observerats för att vara mycket låg (nästan ingen eller mycket låg GFAP färgning), med en majoritet är den neuronala befolkningen (mycket högt Tuj1 uttryck) som observerats i figur 8a.
Som framgår av figur 8butfördes kvantitativ analys genom att räkna populationen av astrocyter och neuroner som erhållits genom mikroskopi med hjälp av cellsens programvara, där endast ~ 2%-3% av astrocytpopulationen först observerades. På grund av bristen på lämpliga medier och näringsämnen för att stödja dess tillväxt, denna population av astrocyter också långsamt under tiden, medan det i närvaro av optimala faktorer och media, nervceller tog snabbt över hela kulturen.
Som visas i figur 9, det konstaterades att på grund av närvaron av NPC, neurospheres uttryckte också höga mängder av astrocyter, präglas av den starka gröna signalen av gfap färgning tillsammans med en starkare Tuj1 signal. Slutligen, för att observera om dessa neurospheres expanderat över tiden, efter 1 vecka av hög densitet kultur, vid vilken punkt de små neurospheres började bildas, några överfördes i ultra-låg fästplattor och deras tillväxt övervakades var 5 dagar för upp till 15 dagar.
En levande/död cell analysen utfördes också med hjälp av calcein am (grön) och propidiumjodid jodid (röd) för att kontrollera hälsan hos cellerna. Det konstaterades att den expanderande neurospheres visade en stor mängd grön fluorescens utan rödfärgning, vilket tyder på att ingen död förekommer i neurospheres under åtminstone upp till 15 dagar i kulturen, som presenteras i figur 10a. Som framgår av figur 10B, observerades en voluminös expansion av neurosfärerna vid var 5: de dagar i kulturen i upp till 15 dagar. För att rita linjediagrammet som representerar den eventuella ökningen av volymen av neurospheres (för varje timepoint), 50 neurospheres studerades, och deras medelvärden användes för att härleda neurosphere volymerna vid varje timepoint.
Figur 1 : Representation av cell följsamhet efter 4 h plätering. (A) cell följsamhet i Högdensitetspläterade neuroner. Bcell följsamhet i Lågdensitetspläterade neuroner. Skalstapeln i (A, B) är 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Cellmorfologi av nervceller efter 24 h plätering. (A) cellmorfologi av högdensitetspläterade neuroner. (B) cellmorfologi av lågdensitetspläterade neuroner. Skalstreck i (A, B) representerar 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Morfologi och karaktärisering av lågdensitetspläterade neuroner efter 7 dagar. (A) faskontrast bild av nervceller som visar omfattande Sprouting. Skalstapeln motsvarar 200 μm. överlägg bilder som visar uttryck för neuronala proteiner (B) Tuj1 (röd) och (C) Tau (grön). Immnunocytochemistry visar tydligt frånvaro av färgning i icke-neuronala proteiner (D) gfap (grön) och (E) O4 (röd). Kärnor färgas med Hoechst 33258 (blå). Skalstreck i (B, C, D, E) representerar 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bildandet av neurospheres i högdensitetspläterade neuroner efter 7 dagar. (a-D) Spontant genererade neurospheres efter 7 dagar i kulturen från högdensitetspläterade neuroner. Ebildande av radiella glialliknande förlängningar mellan två nybildade neurosfärer som indikeras av svarta pilar. Skalstreck i (A, B, C, D, E) motsvarar 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Karaktärisering av de erhållna neurosfärerna. Overlay bild av neurospheres visar uttryck för neuronala protein Tuj1 (röd) och neural stamcells markör nestin (grön), vilket indikerar en NPC-rik population. Kärnor färgas med Hoechst 33258 (blå). Skalstapeln representerar 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Cellernas livskraft primära nervceller. Stapeldiagrammet representerar cellernas livskraft i primär nervceller, bedömas med hjälp av en MTT-analys i upp till 30 dagar med 5 dagars mellanrum. Felstapel representerar SD av värdet (* p < 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Karakterisering av neurosphere-Forming hög densitet kulturer med neuronala markör Tuj1 och astrocyt markör GFAP. (A) bilden visar hög densitet seedade celler (i DIC-läge), som genererar neuropsheres uttrycker både gfap (för astrocyter) och Tuj1 (för nervceller). Kärnor färgas med Hoechst 33258. Skalstapeln representerar 20 μm. (B) stapeldiagrammet representerar andelen av befolkningen i Tuj1-uttrycker celler och gfap-uttrycker celler i neurosfären genererar hög densitet celler. Error bar representerar SD (* p < 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Karakterisering av lågdensitetspläterade celler för primär neuron kultur med neuronala markör Tuj1 och astrocyt markör GFAP kontinuerligt upp till 7 dagar. (A) bilden visar de låg densitet seedade celler i fyra olika kanaler (dvs, DIC, blå kanal [indikerar nukleär färgning av Hoechst 33258], grön kanal [gfap färgning], och röd kanal [för Tuj1 färgning]) för 7 dagar kontinuerligt. Skalstapeln representerar 20 μm. (B) stapeldiagrammet representerar det procentuella förhållandet mellan populationer av Tuj1-uttryckningsceller som för gfap-uttryckningsceller i de lågdensitetsseedade cellerna för primär neuron kultur under 7 dagar. Error bar representerar SD (* p < 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Immunofärgning av erhållna neurosfärer med GFAP och Tuj1. Bilder av de erhållna neurosfärerna är (a) i DIC-läge, (B) kärna färgning med Hoechst 33258, (C) astrocyt markör gfap (grön), och (D) neuronala markör Tuj1 (röd). Skalstapeln representerar 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 : Tillväxt och levande/död cell analys av neurospheres över 15 dagar. (A) bilden visar tillväxten av en neurosphere över 15 dagar vid 5-dagars intervall i DIC-läge, samt dess färgning med calcein am (grön indikerar levande celler) och PI (propidium jodid med en röd färg indikerar döda celler). Skalstapeln representerar 20 μm. (B) grafen representerar ökningen av storleken på neurosfärer som odlas i låg följnings plattor under en period av 15 dagar med 5 dagars mellanrum. Error bar representerar SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver att hur genom att förändra cell bordläggningen tätheter av primära nervceller, två variabla neuronala plattformar erhålls. Även om detta är en enkel metod, måste varje steg noggrant utföras för att uppnå önskat resultat. Andra tidigare metoder har antingen rapporterat långsiktiga primära neuron kulturer eller neurosphere kulturer. De flesta primära neuron kultur protokoll har involverat odling av hippocampus nervceller för 3-5 veckor, men de flesta har misslyckats, som nervceller dör och vissna bort på grund av förlust av anslutningar. En annan fördel med protokollet är att nervceller kan odlas utan behov av någon gliaceller matar skikt, därav bibehålla renhet av nervceller.
Dock måste flera kritiska steg följas noggrant för att uppnå önskat resultat. För det första är det absolut nödvändigt att upprätthålla sterila förhållanden i hela. Det rekommenderas att utföra de flesta steg i en laminär huva samt pre-Rengör alla plattor, instrument och kirurgiska verktyg med 70% alkohol innan du börjar; Annars, det finns en större chans att misslyckas på grund av kontaminering av bakterier och svampar. Därefter är det viktigt att isolera E14-16 embryon; Därför bör det vaginala pluggen detektionssteget noggrant utföras. Som den embryonala dagen ökar, desto större är chanserna för förorening av icke-neuronala celler. Fullständigt avlägsnande av hjärnhinnorna från hjärnhalvorna är oerhört viktigt för att minska inblandning i kulturen av icke-neuronala celler. Både plätering och underhålls medium måste vara nyberedda med alla komponenter, eftersom varje komponent spelar en viktig roll. En annan faktor som måste hållas i åtanke är att den primära nervceller som erhålls måste upprätthållas genom att ändra underhålls mediet 2x per vecka så att näringstillförseln till prolifererande nervceller förblir konstant.
Även om det ännu inte har försökt, kan detta protokoll med smärre ändringar också vara användbara i mus embryonala nervceller. Om de önskade nervceller eller neurospheres inte erhålls efter denna teknik, det finns några felsökningstips som kan vara till hjälp. För att hålla vävnaderna livskraftiga måste dissektion utföras i iskallt HBSS. Dissektion kan också utföras i iskall Krebs buffert istället för HBSS buffert. Att snabbt utföra dissektion är nyckeln till att bibehålla vävnadens lönsamhet. Användning av 10X trypsin kommer att leda till övernedbrytning av vävnaden. Därför bör 10X trypsin-EDTA lösning spädas till 1x i dissociation buffert före matsmältningen. Tillsats av iskall medium till cellerna, inducerande frys-chock, bör undvikas till varje pris, och medium efter att ha nått RT bör användas i stället. Viktigast av allt, täckglas bör alltid vara belagd med PDL, annars nervceller kommer inte att fästa på täckglas. I händelse av svårigheter när du utför sönderdelning steg (dvs vävnad inte smälta ordentligt), kan matsmältningen utföras genom att tillsätta 0,5 ml 1% DNase för 10 min. Om höga grader av kontaminering av icke-neuronala celler påträffas, ~ 5 μM cytosin arabinoside (araC) bör tillsättas för att förhindra tillväxt av icke-neuronala celler.
Trots sina många fördelar, denna teknik lider av några begränsningar. Det är känt att denna teknik spontant genererar neurospheres (även om de utlösande molekylära mekanismerna inte är kända); men, några oklarheter om denna teknik kvarstår, såsom den exakta storleken på de neurosfärer bildas och exakt antal dagar som krävs för att bilda ett tillräckligt antal neurospheres. Oftast är storleken problemet. Även om det har observerats att neurospheres expandera i volym över tid, de initiala neurospheres erhålls är av varierande storlek. Även användbart, det gör det svårt att utföra en synkroniserad studie. Det som skiljer detta neurosphere generation protokoll från andra är dess robusthet och enkelhet. Det finns tidigare rapporterade protokoll för odling och förökning av neuropheres som kräver särskilda medel krav och odlingsförhållanden, varav ingen krävs i detta protokoll. I dessa tidigare rapporterade protokoll, det finns knappast någon enhetlighet för dem som vill generera neurospheres.
Sammantaget beskriver detta protokoll en unik strategi för generering av både 2D och 3D neuronala plattformar genom att helt enkelt ändra cell plätering tätheter av primära nervceller isolerade från embryon från E14-E16 Sprague Dawley rats. Denna metod är kostnadseffektiv jämfört med andra metoder, eftersom den kan utföras med en enkel uppsättning och kräver mycket mindre reagenser och steg. Det kan ge olika tillämpningar av intresse för neuroforskare. Detta kan användas som screening plattformar för olika neuro-terapeutiska leder, Observera rollerna för olika neuronala Last proteiner, undersökningar av cellulära vägar i många neurodegenerativa sjukdomar, och många andra tillämpningar. Den neurospheres kan ytterligare användas för screening av olika neurala differentierande agenter och studera de tidiga stadierna av neurala utveckling in vitro-25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar CSIR-IICB Animal Facility. G. D. tack ICMR, J. K. och V. G. tack DST Inspire, och D. M. tack DBT, Indien för deras Fellowships. S. G. Vänligen erkänner SERB (EMR/2015/002230) Indien för att ge finansiellt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G.
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
