Summary
Presentert her er en protokoll for den spontane generasjonen av neurospheres beriket i nevrale stamceller fra høy tetthet belagt neurons. Under samme eksperiment, når neurons er belagt med en lavere tetthet, resulterer protokollen også i forlenget primære rotte Nevron kulturer.
Abstract
Primær Nevron kultur er en viktig teknikk innen nevrovitenskap. For å få dypere mekanistisk innsikt i hjernen, er det viktig å ha en robust in vitro-modell som kan utnyttes til ulike nevrobiologi studier. Selv om primære Nevron kulturer (dvs. langsiktige hippocampus kulturer) har gitt forskere med modeller, betyr det ennå ikke representerer kompleksiteten i hjernen nettverket helt. I kjølvannet av disse begrensningene, har en ny modell dukket opp ved hjelp av neurospheres, som bærer en nærmere likhet med hjernevevet. Den nåværende protokollen beskriver plating av høy og lav tetthet av blandede kortikale og hippocampus neurons isolert fra fosteret av embryonale dagen 14-16 Sprague Dawley rotter. Dette gjør det mulig for generering av neurospheres og langsiktige primære Nevron kultur som to uavhengige plattformer for å gjennomføre videre studier. Denne prosessen er svært enkel og kostnadseffektiv, da det minimerer flere trinn og reagenser tidligere anses avgjørende for Nevron kultur. Dette er en robust protokoll med minimale krav som kan utføres med oppnåelige resultater og videre brukes til et mangfold av studier knyttet til nevrovitenskap.
Introduction
Hjernen er en intrikat krets av neuronal og ikke-neuronal celler. I årevis har forskere blitt prøver å få innsikt i dette komplekse maskiner. For å gjøre dette, nevrologer i utgangspunktet til ulike forvandlet nerve-baserte cellelinjer for undersøkelser. Imidlertid har manglende evne til disse klonal cellelinjer til å danne sterke Synaptic tilkoblinger og riktig axons eller dendrites skiftet vitenskapelig interesse for primær Nevron kulturer1,2. Det mest spennende aspektet ved primær Nevron kultur er at det skaper en mulighet til å observere og manipulere levende neurons3. Videre er det mindre komplekst i forhold til nevrale vev, som gjør det til en ideell kandidat for å studere funksjon og transport av ulike neuronal proteiner. Nylig har flere utbygginger innen mikroskopi, Genomics og Proteomikk generert nye muligheter for nevrologer å utnytte Nevron kulturer4.
Primær kulturer har tillatt nevrologer å utforske den molekylære mekanismer bak neural utvikling, analysere ulike nevrale signalering trasé, og utvikle en mer helhetlig forståelse av synapsis. Selv om en rekke metoder har rapportert kulturer fra primære neurons (hovedsakelig fra hippocampus opprinnelse5,6,7), en enhetlig protokoll med et kjemisk definert medium som muliggjør langsiktig kultur neurons er fortsatt nødvendig. Men, neurons belagt på en lav tetthet er oftest observert, som ikke overlever langsiktig, sannsynligvis på grunn av mangel på trofiske støtte8 som er gitt av tilstøtende neurons og gliacellene celler. Noen metoder har selv antydet co-dyrking av de primære neurons med gliacellene celler, karakterisert ved at de gliacellene cellene brukes som en mater lag9. Men gliacellene celler utgjør en masse problemer på grunn av deres overvekst, som noen ganger overstyre neuronal vekst10. Derfor, med tanke på problemene ovenfor, en enklere og mer kostnadseffektiv primære neural kultur protokollen er nødvendig, som kan brukes av både neurobiologists og neurochemists for undersøkelser.
En primær Nevron kulturen er egentlig en form for 2D kultur og representerer ikke plastisitet, romlig integritet, eller heterogenitet av hjernen. Dette har gitt opphav til behovet for en mer troverdig 3D-modell som heter neurospheres11,12. Neurospheres presentere en ny plattform til nevrologer, med en nærmere likhet med den virkelige, in vivo hjernen13. Neurospheres er ikke-tilhenger 3D-klynger av celler som er rike på nevrale stamceller (NSCs), nevrale stamceller (NPCer), neurons, og astrocytter. De er en utmerket kilde for isolering av nevrale stamceller og nevrale stamceller, som kan brukes til å studere differensiering inn i ulike neuronal og ikke-neuronal linjene. Igjen, variasjoner innen neurosphere kulturer produsert ved hjelp av tidligere rapporterte protokoller presenterer en barriere for utformingen av en enhetlig neurosphere kultur protokoll14.
Dette manuskriptet presenterer en protokoll der det er mulig å generere både 2D-og 3D-plattformer av vekslende celle plating tetthet fra en blandet kortikale og hippocampus kultur. Det er observert at innen 7 dager fritt flytende neurospheres er innhentet fra høy tetthet belagt neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo, som ved videre kultur, danner broer og sammenkoblinger gjennom radial gliacellene-lignende utvidelser. Tilsvarende i lav tetthet belagt neurons, en primær Nevron kultur som kan opprettholdes i opptil 30 dager oppnås ved å endre vedlikehold medium to ganger per uke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av den institusjonelle dyreetikk komité CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/møte/APR/2018/1).
1. forberedelse av reagens og medier
- Løsning for Poly-D-lysin (PDL): klargjør PDL-løsninger ved konsentrasjoner av 0,1 mg/mL i deionisert vann og oppbevares i 4 ° c til bruk.
- Dissosiasjon medium: til 1 L sterilt, filtrert deionisert vann, Kombiner følgende komponenter i de respektive konsentrasjonene: natriumklorid (8 mg/mL), kalium klorid (0,4 mg/mL), kalium fosfat enbasisk (0,06 mg/mL), D-glukose (1 mg/mL), natrium fosfat dibasic (0,479 mg/mL) og 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid; 10 mM]. Vortex alle komponentene for å hjelpe riktig miksing og oppbevares i 4 ° c til bruk.
Merk: Bruk dissosiasjon medium i iskald form under dissosiasjon men ved romtemperatur (RT) for vasking og andre formål. - Plating medium: plating medium består av følgende: minimum essensielle medium (MEM) Eagle ' s med Earle ' s balansert salt Solution (BSS; 88,4%), D-glukose (0,6%), hest serum (10%), og penicillin/Streptomycin (1%). Kombiner komponentene i de respektive forholdstallene og utfør prosedyren i en hette under sterile forhold.
Merk: Bruk alltid ferskt forberedt plating medium for å unngå nedbrytning av noen komponent. - Vedlikeholds medium: klargjør vedlikeholds mediet ved å kombinere følgende i de respektive forholdstallene: neurobasal medium (97%), 0,5 mM kommersielt innhentet glutamin prøve, B27 serum fritt supplement (2%), og penicillin/Streptomycin (1%). Kombiner komponentene i de respektive forholdstallene og utfør prosedyren i en hette under sterile forhold. Sørg for at alle komponentene er ferskt tilberedt.
2. utarbeidelse av coverslips
- Ta en 12 mm diameter rundt glass dekkglass og sug den i 1 M saltsyre (HCl) i 4 timer.
- Overfør coverslips i destillert vann ved hjelp av et par tang og virvel det forsiktig å kvitte seg med syre helt.
- Overfør den vasket coverslips for en ekstra runde med rengjøring i et beger som inneholder 100% etanol.
- Før du bruker coverslips, tørk dem godt i laminær hette ved å holde dem på silkepapir.
3. utarbeidelse av Poly-D-lysin belagt plater for Nevron kultur
- Ta 2 24 brønn plater: en for høy tetthet plating og en annen for lav tetthet plating. Åpne de sterile pakkene bare inne i laminær hette.
- Overfør 12 mm sterilt glass coverslips i de 24 brønn platene.
- Pour 300 μL av PDL oppløsning (0,1 mg/mL i deionisert vann) i hver brønn slik at den fullt ut dekker overflaten av coverslips.
- Pakk platene med aluminiumsfolie for å hindre tørking og holde den i CO2 inkubator natten.
- Neste dag (før plating) aspirer PDL og vaskes riktig med 300 μL sterilt deionisert vann to til tre ganger.
- Tilsett 200 μL av ferskt tilberedte plating medium og returnere platene til inkubator til plating.
4. fjerning og halshogging av fosteret
Merk: sterilisere alle kirurgiske instrumenter pakket i aluminiumsfolie i en autoklav ved 121 ° c (15 PSI) i 30 min. Dette inkluderer et par Blunt-end saks, tang, fine tang, to fine saks, og en arterie tang for hele prosedyren.
- For generering neurons og neurospheres, bruk en tidsbestemt-gravid Sprague Dawley rotte og merke dagen med vaginal plugg deteksjon som E0.
Merk: kulturen må utføres mellom E14-E16. - På dagen for kultur, plasserer et sterilt glass Petri plate på is og fyll den med kaldt Hank ' s balansert salt Solution (HBSS).
- Bedøve en E14-E16 gravid rotte med en intraperitoneal (IP) injeksjon av 90 mg ketamin/kg kroppsvekt og 10 mg xylazine/kg, deretter ofre ved å utføre cervical forvridning.
Merk: rotter kan også bli euthanized av en overdose av pentobarbital eller overdose av ketamin med xylazine eller diazepam. - Sterilisere dammen magen ved sprøyting 70% etanol og lage en V-formet kutt i abdominal området ved hjelp av sterile tang og et par Blunt-end saks.
- Ta den embryonale SACs forsiktig på Petri platen med kald HBSS løsning.
Merk: ikke bruk samme tang og saks som nettopp ble brukt for huden, da dette vil forurense de indre organene. Bruk et annet sett med saks/pinsett for de indre organene. - Ta embryo ut av den embryonale SACs i frisk, kald HBSS.
- Halshugge hodet med steril saks.
5. fjerning av hjerne og Disseksjon av cortex med hippocampus
- Før du starter, fyll 90 mm sterile Petri retter med kaldt, sterilt HBSS.
- Overfør hodene i de sterile rettene ved hjelp av steril, sløv-endte dressing tang.
- Under stereomikroskopet, hold hodet fra snute regionen med sterile, taggete tang og fjerne hjernen ved å kutte huden og skallen åpen.
- Samle alle de embryo hjerner på samme måte i HBSS løsningen.
- Fjern alle hjernehinnene fra halvkuler og mellomhjernen ved å holde hjernestammen.
- Forsiktig fjerne intakt halvkuler ligner sopp caps som inneholder hippocampus og cortex.
- Samle halvkuler inneholder cortex og intakt hippocampus i en 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL av dissosiasjon medium.
6. dissosiasjon av kortikale og hippocampus vev i enkelt neurons
- Tillat samlet vev å slå seg ned og aspirer den dissosiasjon medium, slik at 5%-10% av medium i det.
- Tilsett 10 mL friskt dissosiasjon medium til vevet, og gjenta trinn 6,1 to ganger.
- Tilsett 4,5 mL dissosiasjon medium og 0,5 mL 0,25% (1x) Trypsin EDTA-løsning (etylen diamin tetraacetate).
- Hold vevet i inkubator ved 37 ° c i 20 min for fordøyelsen å fortsette.
- Aspirer mediet og tilsett 10 mL dissosiasjon og plating medium etter hverandre til det fordøyd vevet.
- Tillat fordøyd vev å slå seg ned og aspirer den dissosiasjon medium. Tilsett 2,5 mL av plating medium og hell i bunnen av en 90 mm steril tallerken.
- Triturate den fordøyd vev i hjørnet bunnen av fatet ved hjelp av en 1 000 μL pipette spissen å okkupere minimalt volum.
- Pass den oppnådde celle suspensjonen gjennom 70 μm celle sil, unntatt noen biter av vev.
- Bestem tettheten av levedyktige celler ved hjelp av trypan blå fargestoff utelukkelse metoden og telle antall celler i en automatisert celle teller.
- For trypan av blått fargestoff, ta 10 μL av celle fjæringen og 10 μL av 0,4% trypan blå beis, bland godt, og tilsett 10 μL av blandingen i ett av de to vedlagte kamrene i en gangs kammer skred.
- Sett inn lysbildet som inneholder blandingen, i celle telleren, og få lesingen.
Merk: trypan blå fargestoff eksklusjon metoden er basert på prinsippet om at levende celler (på grunn av deres intakt membraner) vil utelukke trypan blå fargestoff og vil dermed vise en klar cytoplasma, sammenlignet med en ikke-levedyktig celle som vil lett ta opp trypan blå og vises blå i farge15.
- Fortynne antall celler innhentet til plate 1,5 x 105 celler/ml for høy tetthet og 20 000 celler/ml for lav tetthet i to separate rør som inneholder 30 ml hvert av plating medium.
- Aspirer den tidligere tilsatt plating medium fra hver brønn og plate 500 μL av celler spredt i plating medium i hver brønn.
- Etter det returnere platene til inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for 4 h.
- Undersøk cellene for overholdelse under mikroskopet 4 h etter plating.
- Hvis det er riktig overholdelse av cellene i begge platene, Erstatt mediet i hver brønn med 500 μL av friskt vedlikeholds medium og ruge ved 37 ° c.
- Kultur disse neurons vokst ved lav tetthet i 30 dager ved å endre vedlikeholdet medium 2x per uke.
- Kultur neurospheres innhentet fra høy tetthet belagt neurons i samme vedlikehold medium ved å overføre dem til ultra-lav feste platene.
- Karakterisere nervecellene og neurospheres ved å immunostaining dem med viktige markører. For immuncytokjemi, først fikse celler/neurospheres med 4% formaldehyd i 30 min på tallerkenen selv, deretter permeabilize cellene med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel i 10 min.
- Legg primære antistoffer for både neurons (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) og neurospheres (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 1:300 konsentrasjoner og ruge over natten ved 4 ° c16.
Merk: Tuj1 (klasse III β-tubulin) og tau er positive markører for primær neurons, mens GFAP (gliacellene fibrillary surt protein) og O4 (oligodendrocyte markør) er negative markører for primære neurons17,18. I tilfelle av neurospheres, Tuj1, GFAP, og Nestin alle tjene som positive markører19,20. - Neste dag, vaske cellene med PBS en eller to ganger og legge passende sekundære antistoffer i PBS ved 1:600 konsentrasjoner ved RT for 2 t.
Merk: anti-Mouse eller anti-Rabbit sekundære antistoffer er valgt avhengig av verts arter av den primære antistoff lagt. Det bør holdes i bakhodet at sekundære antistoffer må bøyes til fluorescens derivater egnet for fluorescens mikroskopi formål. - Vask cellene igjen med PBS en eller to ganger.
- Utfør kjernefysiske farging av cellene med Hoechst 33258 (1 mg/mL lager oppløsning i deionisert vann). Forbered 0,1% Hoechst løsning i PBS fra lager løsningen og legge den til cellene.
- Ruge cellene med 0,1% Hoechst løsning i 30 min, vask deretter igjen med PBS.
- Tilsett 20 μL PBS (eller montering medium) på lysbildet og sakte montere dekkglass inneholder fargede celler over området av lysbildet som inneholder PBS. Forsegle margene på dekkglass med dibutylphthalate polystyren xylen (DPX).
- Utfør avbildning av de faste cellene under et mikroskop ved 10x og 40x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen, en enkel strategi har vært belyst der variabel celle plating tettheten fra to forskjellige nevrale screening plattformer er innhentet. Figur 1a,B illustrerer overholdelse av celler etter 4 h av plating neurons i høy og lav tetthet belagt celler, henholdsvis. På observere riktig overholdelse av neurons som vist i figur 1, ble plating medium erstattet av vedlikeholds medium i hver av brønnene, og dermed returnerte til inkubator ved 37 ° c. Relativt mer celle etterlevelse ble observert i høy tetthet belagt neurons. Etter 24 h av plating, både høy og lav tetthet belagt neurons viste forseggjort neuronal extensions og Synaptic sammenkoblinger, som observert i differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bilder i figur 2a,B.
I figur 3arepresenteres en fase-kontrast bilde av lav tetthet belagt neurons etter 7 dager i kulturen. Her har neurons utviklet en forseggjort Synaptic nettverk bestående av dendrittiske grener. Disse neurons kan videre opprettholdes i opptil 30 dager ved å endre vedlikehold medium hver 3 dager med utviklingen av mer intrikate neuronal nettverk. I figur 3b,C, immunocytochemical farging ble utført for å avdekke neuronal natur lav tetthet kultur neurons av farging med neuronal markører Tuj1 (en markør av differensiert neurons)21 og tau (a markør av axons)22 , henholdsvis. Den røde fargen i figur 3b indikerer tilstedeværelsen av Tuj1 farging, og grønn i figur 3c representerer farging i axons av primære neurons. Renhet av neuronal kulturen er vist ved fravær av farging av ikke-neuronal markører for GFAP av astrocytter (figur 3D) og O4 av Oligodendrocytes (figur 3e). Kjernene vist i blått var farget med Hoechst 33258.
Den høy tetthet belagt neurons etter 7 dager er preget av dannelsen av spontane neurospheres, som observert i figur 4a,B,C,D. Etter 8-10 dager, distinkte broer bestående av radial gliacellene som extensions ble observert mellom neurospheres, som vist i figur 4e. Neurospheres ble rikt utrustet med NPCer, som coexpress markører Nestin og Tuj123. Neurospeheres viser positive flekker av Nestin og tuj, som vist i figur 524. Kjernene vist i blått var farget med Hoechst 33258. Disse neurospheres kan opprettholdes i flere uker ved dyrking dem i Ultra-Low festeplater. I figur 6, levetiden til neurons kultivert for ca 30 dager ble vurdert, og celle levedyktighet ble målt på et intervall på ~ 5 dager ved hjelp av konvensjonelle MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] analysen, der det var fant at neurons viste mer enn 90% levedyktighet selv etter 30 dager med kultur.
Deretter ble prosentandelen av astrocytter i høy og lav tetthet sådd kulturer vurdert. Siden denne metodikken er primært rettet mot dyrking neurons, var det viktig å vurdere om denne metoden støtter fortrinnsrett vekst av neurons over ikke-neuronal celler, spesielt astrocytter. Tilstedeværelsen av en populasjon av astrocytter ble observert i neurosphere høy tetthet seeded kultur, preget av den grønne fargen på GFAP farging i figur 7a; skjønt, betydelig mindre ble observert i forhold til Tuj1 (rød)-beiset neuronal befolkning. Dette ble også bekreftet av de kvantitative dataene i figur 7b, der ~ 17% populasjoner av celler var GFAP-uttrykker, sammenlignet med 83% av befolkningen i Tuj1 uttrykker celler.
Den astrocytic befolkningen ble også undersøkt gjennom GFAP farging, sammenlignet med neuronal befolkning (Tuj1 farging) i lav tetthet seeded celler, for 7 sammenhengende dager. Selv om en signifikant forskjell i totalt celle tall ikke ble observert i løpet av 7 dager, på grunn av lav seeding, ble den astrocytt befolkningen også observert å være svært lav (nesten ingen eller svært lav GFAP farging), med et flertall som neuronal befolkningen (svært høy Tuj1 uttrykk) som observert i figur 8a.
Som vist i figur 8B, ble kvantitativ analyse utført ved å telle befolkningen i astrocytter og neurons innhentet gjennom mikroskopi ved hjelp av cellSens programvare, der bare ~ 2%-3% av astrocytt befolkningen ble først observert. På grunn av mangelen på egnede medier og næringsstoffer for å støtte sin vekst, denne bestanden av astrocytter også langsomt omkom over tid, mens i nærvær av optimale faktorer og Media, neurons raskt tok over hele kulturen.
Som vist i figur 9, ble det observert at på grunn av tilstedeværelsen av NPCer, neurospheres også uttrykt store mengder astrocytter, preget av den sterke grønne SIGNALET av GFAP farging sammen med en sterkere Tuj1 signal. Til slutt, for å observere om disse neurospheres utvidet over tid, etter 1 uke med høy tetthet kultur, noe som peker den lille neurospheres begynte å danne, noen ble overført i Ultra-Low vedlegg plater og deres vekst ble overvåket hver 5 dager for opptil 15 dager.
En levende/døde celle analysen ble også utført ved hjelp calcein AM (grønn) og propidium iodide (rød) for å sjekke helsen til cellene. Det ble observert at den ekspanderende neurospheres viste en stor mengde grønne fluorescens uten røde flekker, indikerer ingen død forekommer i neurospheres i minst opp til 15 dager i kultur, som presenteres i figur 10a. Som vist i figur 10b, ble omfangsrik utvidelse av neurospheres observert ved hver 5 dager i kultur i inntil 15 dager. For å plotte Linjediagrammet som representerer den endelige økningen i volumet av neurospheres (for hver timepoint), ble 50 neurospheres studert, og deres gjennomsnitt ble brukt for å utlede neurosphere volumer ved hver timepoint.
Figur 1 : Representasjon av celle overholdelse etter 4 h av plating. (A) celle overholdelse i høy tetthet belagt neurons. (B) celle overholdelse i lav tetthet belagt neurons. Scale bar i (A, B) er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Celle morfologi av neurons etter 24 h av plating. (A) celle morfologi av høy tetthet belagt neurons. (B) celle morfologi av lav tetthet belagt neurons. Scale barer i (A, B) representerer 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Morfologi og karakterisering av lav tetthet belagt neurons etter 7 dager. (A) fase-kontrast bilde av neurons som viser omfattende spirende. Scale bar representerer 200 μm. overlapp bilder som viser uttrykk for neuronal proteiner (B) Tuj1 (rød) og (C) tau (grønn). Immnunocytochemistry tydelig viser fravær av farging i ikke-neuronal proteiner (D) GFAP (grønn) og (E) O4 (rød). Kjerner ble farget med Hoechst 33258 (blå). Scale barer i (B, C, D, E) representerer 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Dannelse av neurospheres i høy tetthet belagt neurons etter 7 dager. (A-D) Spontant genererte neurospheres etter 7 dager i kultur fra høy tetthet belagt neurons. (E) dannelse av radial gliacellene-lignende utvidelser mellom to nyopprettede neurospheres som indikert av svarte piler. Scale barer i (A, B, C, D, E) representerer 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Karakterisering av de oppnådde neurospheres. Overlay bilde av neurospheres viser uttrykk for neuronal protein Tuj1 (rød) og neural stilk cellen markør Nestin (grønn), som indikerer en NPC-rik befolkning. Kjerner ble farget med Hoechst 33258 (blå). Scale bar representerer 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Celle levedyktighet av primære neurons. Stolpediagrammet representerer celle levedyktigheten til de primære neurons, vurdert ved hjelp av en MTT-analysen i opptil 30 dager på 5 dager intervaller. Feil linjen representerer SD av verdien (* p < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Karakterisering av neurosphere-forming høy tetthet kulturer med neuronal markør Tuj1 og astrocytt markør GFAP. (A) bildet viser høy tetthet seeded celler (i dic modus), som genererer neuropsheres uttrykker både GFAP (for astrocytter) og Tuj1 (for neurons). Kjerner ble farget med Hoechst 33258. Scale bar representerer 20 μm. (B) søylediagram representerer prosentandelen av befolkningen i Tuj1-uttrykker celler og GFAP-uttrykker celler i neurosphere genererer høy tetthet celler. Feil linjen representerer SD (* p < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Karakterisering av lav tetthet belagt celler for primær Nevron kultur med neuronal markør Tuj1 og astrocytt markør GFAP kontinuerlig opp til 7 dager. (A) bildet viser lav tetthet seeded celler i fire forskjellige kanaler (dvs. dic, blå kanal [indikerer kjernefysisk farging av Hoechst 33258], grønn kanal [GFAP farging], og rød kanal [for Tuj1 farging]) for 7 dager kontinuerlig. Scale bar representerer 20 μm. (B) søylediagram representerer prosentandelen av bestander av Tuj1-uttrykker celler til at av GFAP-uttrykker celler i lav tetthet seeded celler for primær Nevron kultur for 7 dager. Feil linjen representerer SD (* p < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Immunostaining av oppnådde neurospheres med GFAP og Tuj1. Bilder av de oppnådde neurospheres er (A) i dic Mode, (B) nucleus farging med Hoechst 33258, (C) astrocytt markør GFAP (grønn), og (D) neuronal markør Tuj1 (rød). Scale bar representerer 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 : Vekst og levende/døde celle analysen av neurospheres over 15 dager. (A) bildet viser veksten av en neurosphere over 15 dager på 5-dagers INTERVALLER i dic modus, så vel som dens farging med calcein am (grønt indikerer levende celler) og PI (propidium iodide med en rød farge indikerer døde celler). Scale bar representerer 20 μm. (B) graf representerer økningen i størrelsen av neurospheres dyrkes i lav tilhørighet plater over en periode på 15 dager ved 5 dagers intervaller. Feil linjen representerer SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver at hvordan ved å endre celle plating tettheten av primære neurons, to variable neuronal plattformer er innhentet. Selv om dette er en enkel metode, må hvert trinn utføres omhyggelig for å oppnå de ønskede resultatene. Andre tidligere metoder har enten rapportert langsiktige primære Nevron kulturer eller neurosphere kulturer. Mest primære Nevron kultur protokoller har involvert dyrking av hippocampus neurons for 3-5 uker, men de fleste har sviktet, som neurons dø og visne bort på grunn av tap av forbindelser. En annen fordel med protokollen er at neurons kan være kultivert uten behov for noen gliacellene mater lag, og dermed opprettholde renhet av neurons.
Flere viktige trinn må imidlertid følges nøye for å oppnå de ønskede resultatene. Først opprettholde sterile forhold hele er helt nødvendig. Det anbefales å utføre de fleste trinn i en laminær hette samt pre-Clean alle plater, instrumenter, og kirurgiske verktøy med 70% alkohol før start; ellers er det en høyere sjanse for svikt på grunn av forurensning av bakterier og sopp. Deretter er det viktig å isolere E14-16 embryo; Derfor bør den vaginal plugg oppdagelsen trinn være nøye utført. Som den embryonale dagen øker, jo høyere sjansene er for forurensning av ikke-neuronal celler. Fullstendig fjerning av hjernehinnene fra halvkuler er ekstremt kritisk for å redusere interferens i kultur av ikke-neuronal celler. Både plating og vedlikehold medium må være ferskt tilberedt med alle komponentene, som hver komponent spiller en viktig rolle. En annen faktor som må holdes i bakhodet er at den primære neurons innhentet må opprettholdes ved å endre vedlikeholdet medium 2x per uke slik at næringsstoffet tilførselen til voksende neurons forblir konstant.
Selv om det ennå ikke har blitt forsøkt, denne protokollen med små modifikasjoner kan også være nyttig i musen embryonale neurons. Hvis de ønskede neurons eller neurospheres ikke er oppnådd etter denne teknikken, er det noen feilsøkingstips som kan være nyttig. For å holde vevet levedyktig, må disseksjon utføres i iskald HBSS. Disseksjon kan også utføres i iskald Krebs buffer i stedet for HBSS buffer. Raskt utføre disseksjon er nøkkelen til å opprettholde vev levedyktighet. Bruk av 10x Trypsin vil føre til overdigestion av vevet. Derfor, 10x Trypsin-EDTA løsning bør fortynnes til 1x i dissosiasjon buffer før fordøyelsen. Tilsetning av iskaldt medium til cellene, inducing fryse-sjokk, bør unngås for enhver pris, og medium etter å ha nådd RT bør brukes i stedet. Viktigst, bør coverslips alltid være belagt med PDL, ellers neurons vil ikke feste til coverslips. I tilfelle noen problemer mens du utfører trituration trinn (dvs. vev ikke fordøye riktig), kan fordøyelsen utføres ved å legge 0,5 mL 1% DNase i 10 min. Hvis høy grad av forurensning av ikke-neuronal celler er oppstått, bør ~ 5 μM cytosin arabinoside (araC) legges for å hindre vekst av ikke-neuronal celler.
Til tross for sine mange fordeler, lider denne teknikken fra noen begrensninger. Det er kjent at denne teknikken spontant genererer neurospheres (selv om den utløsende molekylære mekanismer er ikke kjent); Imidlertid, få tvetydigheter angående denne teknikk være igjen, som det pressepenger av størrelse av det neurospheres dannet og pressepenger av antallet av dager krevde å blankett en nok antallet av neurospheres. Mostly, er størrelsen problemet. Selv om det har blitt observert at neurospheres utvides i volum over tid, den første neurospheres innhentet er av variable størrelser. Selv om nyttig, det gjør det vanskelig å utføre en synkronisert studie. Det som skiller denne neurosphere generasjons protokollen fra andre, er dens robusthet og enkelhet. Det er tidligere rapportert protokoller for dyrking og forplantning av neuropheres som krever spesielle medium krav og kultur forhold, ingen av disse er nødvendig i denne protokollen. I disse tidligere rapporterte protokollene, er det neppe noen ensartethet for de som ønsker å generere neurospheres.
Overall, beskriver denne protokollen en unik strategi for generering av både 2D og 3D neuronal plattformer ved ganske enkelt å endre celle plating tettheten av primære neurons isolert fra embryo av E14-E16 Sprague Dawley rotter. Denne metoden er kostnadseffektiv i forhold til andre metoder, da den kan utføres med et enkelt oppsett og krever mye mindre reagenser og trinn. Det kan gi ulike anvendelser av interesse for nevrologer. Dette kan brukes som screening plattformer for ulike Nevro-terapeutiske fører, observere rollene til ulike neuronal Last proteiner, undersøkelser av mobilnettet trasé i mange nevrodegenerative sykdommer, og mange andre programmer. Den neurospheres kan videre brukes til screening av ulike nevrale differensiering agenter og studere de tidlige stadiene av Neural Development in vitro25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker CSIR-IICB dyr anlegget. G. D. takk ICMR, J. K. og V. G. takker DST Inspire, og D. M. takk DBT, India for deres stipend. S. G. vennlig erkjenner SERBISKE (EPJ/2015/002230) India for å gi økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G.
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
