Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.
Abstract
Primäre Neuronenkultur ist eine wesentliche Technik auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Um tiefere mechanistische Einblicke in das Gehirn zu gewinnen, ist es wichtig, ein robustes In-vitro-Modell zu haben, das für verschiedene neurobiologische Studien genutzt werden kann. Obwohl primäre Neuronenkulturen (d.h. langfristige Hippocampuskulturen) Wissenschaftlern Modelle geliefert haben, stellt sie die Komplexität des Gehirnnetzwerks noch nicht vollständig dar. Im Gefolge dieser Einschränkungen ist ein neues Modell entstanden, das Neurosphären verwendet, die eine engere Ähnlichkeit mit dem Gehirngewebe aufweisen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Beschichtung von hohen und niedrigen Dichten gemischter kortikaler und hippocampaler Neuronen, die aus dem Embryo des embryonalen Tages 14-16 Sprague Dawley Ratten isoliert wurden. Dies ermöglicht die Erzeugung von Neurosphären und langfristige primäre Neuronenkultur als zwei unabhängige Plattformen, um weitere Studien durchzuführen. Dieser Prozess ist extrem einfach und kostengünstig, da er mehrere Schritte und Reagenzien minimiert, die bisher als wesentlich für die Neuronenkultur galten. Dies ist ein robustes Protokoll mit minimalen Anforderungen, das mit erreichbaren Ergebnissen durchgeführt und weiter für eine Vielzahl von Studien im Zusammenhang mit Neurowissenschaften verwendet werden kann.
Introduction
Das Gehirn ist eine komplizierte Schaltung von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen. Seit Jahren versuchen Wissenschaftler, Einblicke in diese komplexe Maschinerie zu gewinnen. Dazu griffen Neurowissenschaftler zunächst zu verschiedenen transformierten nervenbasierten Zelllinien für Untersuchungen. Jedoch, die Unfähigkeit dieser klonalen Zelllinien starke synaptische Verbindungen und richtige Axone oder Dendriten haben wissenschaftliches Interesse an primären Neuronenkulturen verschoben1,2. Der aufregendste Aspekt der primären Neuronenkultur ist, dass es eine Gelegenheit schafft, lebende Neuronen zu beobachten und zu manipulieren3. Darüber hinaus ist es weniger komplex im Vergleich zu Neuronengewebe, was es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung der Funktion und des Transports von verschiedenen neuronalen Proteinen macht. In jüngster Zeit haben mehrere Entwicklungen in den Bereichen Mikroskopie, Genomik und Proteomik neue Möglichkeiten für Neurowissenschaftler geschaffen, Neuronenkulturen auszunutzen4.
Primäre Kulturen haben es Neurowissenschaftlern ermöglicht, die molekularen Mechanismen hinter der neuronalen Entwicklung zu erforschen, verschiedene neuronale Signalwege zu analysieren und ein kohärenteres Verständnis der Synapse zu entwickeln. Obwohl eine Reihe von Methoden Kulturen aus primären Neuronen berichtet haben (meist aus dem hippocampalen Ursprung5,6,7), ist ein einheitliches Protokoll mit einem chemisch definierten Medium, das eine langfristige Kultur von Neuronen ermöglicht, noch benötigt werden. Jedoch, Neuronen mit geringer Dichte plattiert werden am häufigsten beobachtet, die nicht langfristig überleben, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an trophischen Unterstützung 8, die von den benachbarten Neuronen und Gliazellen zur Verfügung gestellt wird. Einige Methoden haben sogar vorgeschlagen, die primären Neuronen mit Gliazellen zu kultivieren, wobei die Gliazellen als Feederschicht9verwendet werden. Jedoch, Gliazellen stellen eine Menge Probleme aufgrund ihrer Überwucherung, die manchmal das neuronale Wachstum überschreiben10. Unter Berücksichtigung der oben genannten Probleme ist daher ein einfacheres und kostengünstigeres primäres neuronales Kulturprotokoll erforderlich, das sowohl von Neurobiologen als auch von Neurochemikern für Untersuchungen verwendet werden kann.
Eine primäre Neuronenkultur ist im Wesentlichen eine Form der 2D-Kultur und stellt nicht die Plastizität, räumliche Integrität oder Heterogenität des Gehirns dar. Dies hat dazu geführt, dass ein glaubwürdigeres 3D-Modell namens Neurosphären11,12benötigt wird. Neurosphären stellen Neurowissenschaftlern eine neue Plattform dar, mit einer engeren Ähnlichkeit mit dem realen, in vivo Gehirn13. Neurosphären sind nicht anhaftende 3D-Cluster von Zellen, die reich an neuronalen Stammzellen (NSCs), neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), Neuronen und Astrozyten sind. Sie sind eine ausgezeichnete Quelle für die Isolierung von neuronalen Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen, die verwendet werden können, um Die Differenzierung in verschiedene neuronale und nicht-neuronale Linien zu untersuchen. Auch hier stellt die Variabilität innerhalb der Neurosphärenkulturen, die mit den zuvor gemeldeten Protokollen erzeugt werden, ein Hindernis für die Formulierung eines einheitlichen Neurosphärenkulturprotokolls14dar.
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll dar, in dem es möglich ist, sowohl 2D- als auch 3D-Plattformen zu erzeugen, indem Zellverdichtungen aus einer gemischten kortikalen und hippocampalen Kultur abwechselnd werden. Es wird beobachtet, dass innerhalb von 7 Tagen frei schwebende Neurosphären aus hochdichten, plattierten Neuronen gewonnen werden, die aus dem E14-E16 Sprague Dawley Ratte Embryo isoliert sind, die nach weiterer Kultur Brücken und Verbindungen durch radiale glialartige Erweiterungen bilden. In ähnlicher Weise wird in den niedrigdichten, plattierten Neuronen eine primäre Neuronenkultur erhalten, die bis zu 30 Tage lang aufrechterhalten werden kann, indem das Pflegemedium zweimal pro Woche gewechselt wird.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden von der Institutional Animal Ethics Committee of CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1) genehmigt.
1. Reagenz- und Medienzubereitung
- Poly-D-Lysin(PDL)-Lösung: Bereiten Sie PDL-Lösungen in Konzentrationen von 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor und lagern Sie sie in 4 °C bis zur Anwendung.
- Dissoziationsmedium: Bis 1 L steriles, gefiltertes entionisiertes Wasser, kombinieren Sie die folgenden Komponenten in den jeweiligen Konzentrationen: Natriumchlorid (8 mg/ml), Kaliumchlorid (0,4 mg/ml), Kaliumphosphat monobasic (0,06 mg/ml), D-Glucose (1 mg/ml), Natriumphosphatdibasis (0,479 mg/ml) und 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure; 10 mM]. Vortex alle Komponenten, um das richtige Mischen zu unterstützen und lagern in 4 °C bis zum Gebrauch.
HINWEIS: Verwenden Sie das Dissoziationsmedium in eiskalter Form während der Dissoziation, aber bei Raumtemperatur (RT) zum Waschen und anderen Zwecken. - Beschichtungsmedium: Beschichtungsmedium besteht aus folgenden: Minimal-Essential Medium (MEM) Eagle es mit Earle es Balanced Salt Solution (BSS; 88.4%), D-Glucose (0.6%), Horse Serum (10%) und Penicillin/Streptomycin (1%). Kombinieren Sie die Komponenten in den jeweiligen Verhältnissen und führen Sie den Eingriff innerhalb einer Haube unter sterilen Bedingungen durch.
HINWEIS: Verwenden Sie immer frisch zubereitetes Beschichtungsmedium, um den Abbau einer Komponente zu vermeiden. - Erhaltungsmedium: Bereiten Sie das Pflegemedium vor, indem Sie die folgenden Indizien in den jeweiligen Verhältnissen kombinieren: neurobasales Medium (97%), 0,5 mM kommerziell erhaltene Glutaminprobe, B27 serumfreier Zusatz (2%) und Penicillin/Streptomycin (1%). Kombinieren Sie die Komponenten in den jeweiligen Verhältnissen und führen Sie den Eingriff innerhalb einer Haube unter sterilen Bedingungen durch. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten frisch zubereitet sind.
2. Herstellung von Deckellipsen
- Nehmen Sie einen runden Glasdeckel von 12 mm und tränken Sie ihn in 1 M Salzsäure (HCl) für 4 h.
- Übertragen Sie die Abdeckungen in destilliertem Wasser mit einem Paar Zangen und wirbeln Sie es sanft, um die Säure vollständig loszuwerden.
- Die gewaschenen Deckel für eine zusätzliche Reinigungsrunde in ein Becherglas mit 100% Ethanol geben.
- Vor der Verwendung der Abdeckungen, trocknen Sie sie gut in der laminaren Haube, indem Sie sie auf Tissue-Papier zu halten.
3. Herstellung von Poly-D-Lysin beschichteten Platten für die Neuronenkultur
- Nehmen Sie zwei 24 Well-Platten: eine für hochdichte Beschichtung und eine andere für die Beschichtung mit geringer Dichte. Öffnen Sie die sterilen Päckchen nur in der laminaren Haube.
- Übertragen Sie die 12 mm sterilen Glasabdeckungen in die 24 Brunnenplatten.
- Gießen Sie 300 l PDL-Lösung (0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser) in jeden Brunnen, so dass er die Oberfläche der Abdeckungen vollständig abdeckt.
- Wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie, um eine Trocknung zu verhindern, und bewahren Sie sie über Nacht im CO2-Inkubator auf.
- Am nächsten Tag (vor der Beschichtung) die PDL-Lösung ansaugen und zwei- bis dreimal mit 300 l sterilem entionisiertem Wasser richtig waschen.
- Fügen Sie 200 l frisch zubereitetes Beschichtungsmedium hinzu und geben Sie die Platten bis zur Beschichtung in den Inkubator zurück.
4. Entfernung und Enthauptung des Fötus
HINWEIS: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, die in Aluminiumfolie in einem Autoklaven verpackt sind, bei 121 °C (15 psi) für 30 min. Dazu gehören eine stumpfe Endschere, Zange, feine Zange, zwei feine Schere und eine Arteriezange für den gesamten Eingriff.
- Zur Erzeugung von Neuronen und Neurosphären, verwenden Sie eine zeitschwangere Sprague Dawley Ratte und markieren Sie den Tag mit vaginalen Stecker-Erkennung als E0.
HINWEIS: Die Kultur muss zwischen E14-E16 durchgeführt werden. - Legen Sie am Tag der Kultur eine sterile Glas-Petriplatte auf Eis und füllen Sie sie mit kalter Hank es Balanced Salt Solution (HBSS).
- Anästhetisieren Sie eine E14-E16 schwangere Ratte mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von 90 mg Ketamin/kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin/kg, dann Opfern durch Durchführung zervikaler Dislokation.
HINWEIS: Ratten können auch durch eine Überdosierung von Pentobarbital oder eine Überdosierung von Ketamin mit Xylazin oder Diazepam eingeschläfert werden. - Sterilisieren Sie den Bauch des Damms, indem Sie 70% Ethanol sprühen und einen V-förmigen Schnitt im Bauchbereich mit sterilen Zangen und einer stumpfen Schere machen.
- Nehmen Sie die embryonalen Säcke vorsichtig auf der Petriplatte mit kalter HBSS-Lösung.
HINWEIS: Verwenden Sie nicht die gleichen Zangen und Scheren, die nur für die Haut verwendet wurden, da dies die inneren Organe kontaminieren wird. Verwenden Sie einen anderen Satz Schere/ Zangen für die inneren Organe. - Nehmen Sie die Embryonen aus den embryonalen Säcken in frischen, kalten HBSS.
- Enthaupten Sie den Kopf mit einer sterilen Schere.
5. Entfernung des Gehirns und Zerlegung des Kortex mit Hippocampus
- Vor dem Start 90 mm sterile Petrischalen mit kalten, sterilen HBSS füllen.
- Übertragen Sie die Köpfe in den sterilen Gerichten mit sterilen, stumpfen Verbandszangen.
- Halten Sie unter dem Stereomikroskop den Kopf aus dem Schnauchbereich mit sterilen, gezackten Zangen und entfernen Sie das Gehirn, indem Sie die Haut und den Schädel öffnen.
- Sammeln Sie alle Embryo-Gehirne auf die gleiche Weise in der HBSS-Lösung.
- Entfernen Sie alle Meningen aus den Hemisphären und Mittelhirn durch Halten des Hirnstamms.
- Entfernen Sie vorsichtig die intakten Hemisphären, die Pilzkappen ähneln, die den Hippocampus und den Kortex enthalten.
- Sammeln Sie die Hemisphären, die Kortex und intakten Hippocampus enthalten, in einem 15 ml konischen Röhrchen, das 10 ml Dissoziationsmedium enthält.
6. Dissoziation von kortikalem und hippocampalem Gewebe in einzelne Neuronen
- Lassen Sie die gesammelten Gewebe sich absetzen und saugen Sie das Dissoziationsmedium an, so dass 5%-10% des Mediums darin bleiben.
- Fügen Sie dem Gewebe 10 ml frisches Dissoziationsmedium hinzu und wiederholen Sie Schritt 6.1 zweimal.
- 4,5 ml Dissoziationsmedium und 0,5 ml 0,25 % (1x) Trypsin EDTA (Ethylendiamintetraacetat) hinzufügen.
- Halten Sie das Gewebe im Inkubator bei 37 °C für 20 min für die Verdauung fort.
- Das Medium ansaugen und 10 ml Dissoziation und Beschichtungsmedium nacheinander in das verdauliche Gewebe geben.
- Lassen Sie das verdaute Gewebe sich absetzen und das Dissoziationsmedium ansaugen. 2,5 ml Beschichtungsmedium hinzufügen und in die Basis einer 90 mm sterilen Schale gießen.
- Trituieren Sie das verdaute Gewebe in der Eckbasis der Schale mit einer 1.000 l Pipette Spitze, um das minimale Volumen zu besetzen.
- Passieren Sie die erhaltene Zellsuspension durch das 70-m-Zellsieb, ausgenommen Gewebestücke.
- Bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen mithilfe der Trypan-Blue-Farbstoff-Ausschlussmethode und zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem automatisierten Zellzähler.
- Bei der Trypan-Blue-Farbstoff-Ausschlussmethode 10 l der Zellsuspension und 10 l 0,4% Trypan-Blaufleck nehmen, gründlich mischen und 10 l der Mischung in eine der beiden geschlossenen Kammern der Einwegkammerschlitten geben.
- Setzen Sie die Folie, die die Mischung enthält, in den Zellzähler ein und erhalten Sie den Messwert.
ANMERKUNG: Die Trypan-Blue-Farbstoff-Ausschlussmethode basiert auf dem Prinzip, dass lebende Zellen (aufgrund ihrer intakten Membranen) Trypan-Blaufarbstoff ausschließen und somit ein klares Zytoplasma aufweisen, verglichen mit einer nicht lebensfähigen Zelle, die leicht Trypanblau aufnehmen und blau in Farbe15.
- Verdünnen Sie die Anzahl der Zellen, die bis zur Platte 1,5 x 105 Zellen/ml für hohe Dichte und 20.000 Zellen/ml für niedrige Dichte in zwei separaten Rohren mit je 30 ml des Beschichtungsmediums erhalten wurden.
- Aspirieren Sie das zuvor hinzugefügte Beschichtungsmedium aus jedem Brunnen und Platte 500 l der Zellen in Beschichtungsmedium in jedem Brunnen dispergiert.
- Danach die Platten bei 37 °C und 5%CO2 für 4 h in den Inkubator zurück.
- Untersuchen Sie die Zellen auf Haftung unter dem Mikroskop 4 h nach der Beschichtung.
- Wenn die Zellen in beiden Platten ordnungsgemäß haften, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 l frisches Pflegemedium und inkubieren Sie bei 37 °C.
- Kultur diese Neuronen wuchs bei geringer Dichte für 30 Tage durch Änderung der Wartung Medium 2x pro Woche.
- Kultur die Neurosphären aus den hochdichten plattierten Neuronen im gleichen Erhaltungsmedium erhalten, indem sie auf die ultra-niedrigen Befestigungsplatten übertragen.
- Charakterisieren Sie die Neuronen und die Neurosphären, indem Sie sie mit wichtigen Markern immunstainieren. Für die Immunzytochemie fixieren Sie zunächst die Zellen/Neurosphären mit 4% Formaldehyd für 30 min auf der Platte selbst, dann permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% nichtionischem Reinigungsmittel für 10 min.
- Fügen Sie primäre Antikörper für beide Neuronen (Anti-Tuj1, GFAP, O4, Tau) und Neurosphären (Anti-Nestin, GFAP, Tuj1) in phosphatgepufferter Salin (PBS) bei 1:300 Konzentrationen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C16.
HINWEIS: Die Tuj1 (Klasse III -Tubulin) und Tau sind positive Marker für die primären Neuronen, während GFAP (glial fibrillary acidic protein) und O4 (Oligodendrozytenmarker) negative Marker für die primären Neuronensind 17,18. Bei Neurosphären dienen Tuj1, GFAP und Nestin als positive Marker19,20. - Am nächsten Tag die Zellen ein- oder zweimal mit PBS waschen und bei 1:600 Konzentrationen bei RT für 2 h geeignete sekundäre Antikörper in PBS hinzufügen.
HINWEIS: Die Sekundärantikörper gegen Die Maus oder Anti-Rabbit werden je nach der Wirtsart des hinzugefügten primären Antikörpers ausgewählt. Es ist zu beachten, dass die sekundären Antikörper mit Fluoreszenzderivaten konjugiert werden müssen, die für Fluoreszenzmikroskopiezwecke geeignet sind. - Waschen Sie die Zellen ein- oder zweimal erneut mit PBS.
- Führen Sie die kerntechnische Färbung der Zellen mit Hoechst 33258 (1 mg/ml-Stammlösung in entionisiertem Wasser) durch. 0,1% Hoechst-Lösung in PBS aus der Stammlösung vorbereiten und den Zellen hinzufügen.
- Die Zellen mit 0,1% Hoechst-Lösung 30 min bebrüten, dann wieder mit PBS waschen.
- Fügen Sie 20 L PBS (oder Montagemedium) auf dem Dia hinzu und montieren Sie langsam den Deckelschlupf mit den gebeizten Zellen über dem Bereich des Dias, der PBS enthält. Versiegeln Sie die Ränder des Deckslips mit Dibutylphthalatpolystyrolxylol (DPX).
- Bildgebung der festen Zellen unter dem Mikroskop mit 10- und 40-facher Vergrößerung.
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Representative Results
In diesem Protokoll wurde eine einfache Strategie erläutert, bei der variable Zellbeschichtungsdichten von zwei verschiedenen neuronalen Screening-Plattformen erhalten werden. Abbildung 1A,B zeigt die Adhärenz von Zellen nach 4 h Der Beschichtung der Neuronen in hoch- bzw. niedrigdichten plattierten Zellen. Bei Der Beobachtung der korrekten Einhaltung der Neuronen gemäß Abbildung 1wurde das Beschichtungsmedium durch ein Pflegemedium in jedem der Brunnen ersetzt und damit bei 37 °C zum Inkubator zurückgeführt. Vergleichsweise mehr Zelladhärenz wurde in den hochdichten, verdichteten Neuronen beobachtet. Nach 24 h Beschichtung zeigten sowohl hoch- als auch niedrigdichte plattierte Neuronen aufwendige neuronale Erweiterungen und synaptische Verbindungen, wie in den Differential Interferenzkontrast(DIC)-Bildern in Abbildung 2A,Bbeobachtet.
In Abbildung 3Awird ein Phasenkontrastbild der niederdichten, verdichteten Neuronen nach 7 Tagen in der Kultur dargestellt. Hier haben die Neuronen ein ausgeklügeltes synaptisches Netzwerk entwickelt, das aus dendritischen Zweigen besteht. Diese Neuronen können für bis zu 30 Tage weiter gepflegt werden, indem das Pflegemedium alle 3 Tage mit der Entwicklung von komplizierteren neuronalen Netzwerken geändert wird. In Abbildung 3B,Cwurde eine immunzytochemische Färbung durchgeführt, um die neuronale Natur von Neuronen mit niedriger Dichte zu offenbaren, indem sie mit neuronalen Markern Tuj1 (ein Marker differenzierter Neuronen)21 und Tau (ein Marker von Axonen) gefärbt wurden22 , bzw. Die rote Farbe in Abbildung 3B zeigt das Vorhandensein von Tuj1-Färbung an, und Grün in Abbildung 3C stellt Färbung in den Axonen der primären Neuronen dar. Die Reinheit der neuronalen Kultur zeigt sich in der Abwesenheit von Färbungen von nicht-neuronalen Markern für GFAP von Astrozyten (Abbildung 3D) und O4 von Oligodendrozyten (Abbildung 3E). Die blau dargestellten Kerne waren mit Hoechst 33258 befleckt.
Die hochdichten, plattierten Neuronen nach 7 Tagen sind durch die Bildung spontanerNeurosphären gekennzeichnet, wie in Abbildung 4A,B,C,Dbeobachtet. Nach 8-10 Tagen wurden verschiedene Brücken, die aus radialen glialen Erweiterungen bestehen, zwischen Neurosphären beobachtet, wie in Abbildung 4Ezu sehen ist. Die Neurosphären waren reich mit NPCs ausgestattet, die die Marker Nestin und Tuj123koexpressen. Die Neurospehere zeigen eine positive Färbung von Nestin und Tuj, wie in Abbildung 524dargestellt. Die blau dargestellten Kerne waren mit Hoechst 33258 befleckt. Diese Neurosphären können mehrere Wochen lang aufrechterhalten werden, indem sie in ultraniedrigen Befestigungsplatten kultiviert werden. In Abbildung 6wurde die Langlebigkeit der für etwa 30 Tage kultivierten Neuronen bewertet, und die Zelllebensfähigkeit wurde in einem Intervall von 5 Tagen mit dem herkömmlichen MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid]-Assay gemessen, in dem es fand heraus, dass die Neuronen auch nach 30 Tagen Kultur mehr als 90% Lebensfähigkeit zeigten.
Als nächstes wurde der Anteil der Astrozyten in den Kulturen mit hoher und niedriger Dichte bewertet. Da diese Methode in erster Linie auf die Kultivierung von Neuronen abzielt, war es wichtig zu beurteilen, ob diese Methode das bevorzugte Wachstum von Neuronen gegenüber nicht-neuronalen Zellen, insbesondere Astrozyten, unterstützt. Das Vorhandensein einer Population von Astrozyten wurde in der Neurosphärebildenden Kultur mit hoher Dichte beobachtet, die durch die grüne Farbe der GFAP-Färbung in Abbildung 7Agekennzeichnet ist; Im Vergleich zur Tuj1(rot)-gefärbten neuronalen Population wurde jedoch deutlich weniger beobachtet. Dies wurde auch durch die quantitativen Daten in Abbildung 7Bbestätigt, in denen 17% der Zellpopulationen GFAP-exzessient waren, verglichen mit 83% der Population in Tuj1-exemitten Zellen.
Die astrozytische Population wurde auch durch GFAP-Färbung untersucht, im Vergleich zur neuronalen Population (Tuj1 Färbung) in samenarmen Zellen mit geringer Dichte, für 7 kontinuierliche Tage. Obwohl ein signifikanter Unterschied in der Gesamtzellzahl im Laufe von 7 Tagen nicht beobachtet wurde, aufgrund der geringen Aussaat, wurde auch die Astrozytenpopulation als sehr gering (fast keine oder sehr niedrige GFAP-Färbung) beobachtet, wobei die Mehrheit die neuronale Population (sehr hohen Tuj1-Ausdruck) wie in Abbildung 8Abeobachtet.
Wie in Abbildung 8Bdargestellt, wurde eine quantitative Analyse durchgeführt, indem die Population von Astrozyten und Neuronen, die durch Mikroskopie mit Hilfe der CellSens-Software gewonnen wurden, gezählt wurde, bei der zunächst nur 2 %-3% der Astrozytenpopulation beobachtet wurden. Aufgrund des Mangels an geeigneten Medien und Nährstoffen, um sein Wachstum zu unterstützen, ging diese Population von Astrozyten auch langsam im Laufe der Zeit zugrunde, während in Gegenwart von optimalen Faktoren und Medien, die Neuronen schnell die gesamte Kultur übernahmen.
Wie in Abbildung 9dargestellt, wurde beobachtet, dass aufgrund der Anwesenheit von NPCs die Neurosphären auch hohe Mengen an Astrozyten ausdrückten, die durch das starke grüne Signal der GFAP-Färbung zusammen mit einem stärkeren Tuj1-Signal gekennzeichnet waren. Schließlich, um zu beobachten, ob diese Neurosphären im Laufe der Zeit erweitert, nach 1 Woche der Hochdichte Kultur, an dem Punkt begann die kleinen Neurosphären zu bilden begann, wurden einige in ultra-niedrigen Befestigungsplatten übertragen und ihr Wachstum wurde alle 5 Tage für bis zu 15 Tage.
Ein Leben/Totzell-Test wurde auch mit Calcein AM (grün) und Propidiumjodid (rot) durchgeführt, um die Gesundheit der Zellen zu überprüfen. Es wurde beobachtet, dass die expandierenden Neurosphären eine große Menge an grüner Fluoreszenz ohne rote Färbung zeigten, was darauf hindeutet, dass in den Neurosphären mindestens bis zu 15 Tage in der Kultur ein Tod auftritt, wie in Abbildung 10Adargestellt. Wie in Abbildung 10Bdargestellt, wurde die voluminöse Ausdehnung der Neurosphären an allen 5 Tagen in der Kultur für bis zu 15 Tage beobachtet. Um das Liniendiagramm darzustellen, das die letztendliche Zunahme des Volumens von Neurosphären (für jeden Zeitpunkt) darstellt, wurden 50 Neurosphären untersucht, und ihre Durchschnittswerte wurden verwendet, um die Neurosphärenvolumina zu jedem Zeitpunkt abzuleiten.
Abbildung 1 : Darstellung der Zellhaftung nach 4 h Beschichtung. (A) Zellhaftung in hochdichten Neuronen. (B) Zellhaftung in niederdichten neuronen. Die Maßstabsleiste in (A,B) beträgt 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Zellmorphologie von Neuronen nach 24 h Beschichtung. (A) Zellmorphologie der hochdichten neuronenden Neuronen. (B) Zellmorphologie von niederdichten neuronenden Neuronen. Maßstabsbalken in (A, B) stellen 20 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Morphologie und Charakterisierung von niedrigdichten, verdichteten Neuronen nach 7 Tagen. (A) Phasenkontrastbild von Neuronen, die eine ausgedehnte Keimung zeigen. Maßstabsleiste steht für 200 m. Overlay-Bilder, die den Ausdruck für neuronale Proteine zeigen (B) Tuj1 (rot) und (C) tau (grün). Die Immnunozytochemie zeigt deutlich das Fehlen von Färbung in nicht-neuronalen Proteinen (D) GFAP (grün) und (E) O4 (rot). Nuclei wurden mit Hoechst 33258 (blau) befleckt. Maßstabsbalken in (B, C, D, E) stellen 20 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Bildung von Neurosphären in hochdichten, plattierten Neuronen nach 7 Tagen. (A-D) Spontan erzeugte Neurosphären nach 7 Tagen in der Kultur aus den hochdichten, plattierten Neuronen. (E) Bildung von radialen glialartigen Erweiterungen zwischen zwei neu gebildeten Neurosphären, wie durch schwarze Pfeile angezeigt. Maßstabsbalken in (A, B, C, D, E) stellen 200 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Charakterisierung der erhaltenen Neurosphären. Overlay-Bild der Neurosphären, die die Expression des neuronalen Proteins Tuj1 (rot) und des neuronalen Stammzellmarkers Nestin (grün) zeigen, was auf eine NPC-reiche Population hinweist. Nuclei wurden mit Hoechst 33258 (blau) befleckt. Die Maßstabsleiste steht für 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Zelllebensfähigkeit von Primärneuronen. Das Stabdiagramm stellt die Zelllebensfähigkeit der primären Neuronen dar, die mit einem MTT-Assay für bis zu 30 Tage in Abständen von 5 Tagen bewertet werden. Fehlerleiste stellt SD des Wertes (*p < 0,05) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7 : Charakterisierung von neurosphärenbildenden Hochdichtekulturen mit neuronaischem Marker Tuj1 und Astrozytenmarker GFAP. (A) Das Bild zeigt hochdichte Samenzellen (im DIC-Modus), die Neuropshere erzeugen, die sowohl GFAP (für Astrozyten) als auch Tuj1 (für Neuronen) exezieren. Nuclei wurden mit Hoechst 33258 befleckt. Der Maßstabsbalken stellt 20 m (B) Balkendiagramm e.V. für den Prozentsatz der Population von Tuj1-exezierenden Zellen und GFAP-exezierenden Zellen in der Neurosphäre dar, die Zellen mit hoher Dichte erzeugen. Fehlerleiste steht für SD (*p < 0.05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8 : Charakterisierung von plattierten Zellen mit geringer Dichte für die primäre Neuronenkultur mit neuronagem Marker Tuj1 und Astrozytenmarker GFAP kontinuierlich bis zu 7 Tage. (A) Das Bild zeigt die zellenschwachen Samen in vier verschiedenen Kanälen (z.B. DIC, blauer Kanal [zeigt kerntechnische Färbung durch Hoechst 33258], grüner Kanal [GFAP-Färbung] und roter Kanal [für Tuj1-Färbung]) 7 Tage ununterbrochen. Der Maßstabsbalken stellt 20 m (B) Das Balkendiagramm stellt das prozentuale Verhältnis der Populationen von Tuj1-exemitten Zellen zu dem von GFAP-exemitten Zellen in den Samenzellen mit niedriger Dichte für die primäre Neuronenkultur für 7 Tage dar. Fehlerleiste steht für SD (*p < 0.05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9 : Immunostainierung von erhaltenen Neurosphären mit GFAP und Tuj1. Bilder der erhaltenen Neurosphären sind (A) im DIC-Modus, (B) Kernfärbung mit Hoechst 33258, (C) Astrozytenmarker GFAP (grün) und (D) neuronalen Marker Tuj1 (rot). Die Maßstabsleiste steht für 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10 : Wachstum und Leben/Tote Zell-Assay von Neurosphären über 15 Tage. (A) Das Bild zeigt das Wachstum einer Neurosphäre über 15 Tage im 5-Tage-Rhythmus im DIC-Modus sowie deren Färbung mit Calcein AM (grün zeigt lebende Zellen) und PI (Propidiumjodid mit roter Farbe zeigt abgestorbene Zellen). Maßstabsbalken steht für 20 m. (B) Diagramm stellt die Zunahme der Größe von Neurosphären dar, die in Niedrighaftungsplatten über einen Zeitraum von 15 Tagen in 5-Tage-Intervallen angebaut werden. Fehlerleiste steht für SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, dass durch die Änderung der Zellbeschichtungdichten von primären Neuronen zwei variable neuronale Plattformen erhalten werden. Obwohl dies eine einfache Methode ist, muss jeder Schritt sorgfältig ausgeführt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Andere frühere Methoden haben entweder langfristige primäre Neuronenkulturen oder Neurosphärenkulturen berichtet. Die meisten primären NeuronenkulturProtokolle haben die Kultivierung von Hippocampus-Neuronen für 3-5 Wochen beteiligt, aber die meisten haben versagt, da die Neuronen sterben und verdorglos aufgrund des Verlusts von Verbindungen. Ein weiterer Vorteil des Protokolls ist, dass die Neuronen kultiviert werden können, ohne dass eine Glia-Feeder-Schicht erforderlich ist, wodurch die Reinheit der Neuronen erhalten bleibt.
Es müssen jedoch mehrere kritische Schritte sorgfältig befolgt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Erstens ist die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen durchgängig absolut notwendig. Es wird empfohlen, die meisten Schritte in einer laminaren Haube sowie vorreinigen alle Platten, Instrumente, und chirurgische Werkzeuge mit 70% Alkohol vor dem Start durchzuführen; Andernfalls besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass durch die Kontamination durch Bakterien und Pilze verfällt. Als nächstes ist es wichtig, E14-16-Embryonen zu isolieren; Daher sollte der vaginale Steckererkennungsschritt sorgfältig durchgeführt werden. Mit zunehmendem Embryonaltag steigt die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch nicht-neuronale Zellen. Vollständige Entfernung von Meningen aus den Hemisphären ist extrem wichtig, um Störungen in der Kultur durch nicht-neuronale Zellen zu reduzieren. Sowohl beschichtungs- als auch wartungsmittel müssen mit allen Komponenten frisch zubereitet werden, da jedes Bauteil eine wesentliche Rolle spielt. Ein weiterer Faktor, der im Auge behalten werden muss, ist, dass die primären Neuronen erhalten werden müssen, indem das Erhaltungsmedium 2x pro Woche geändert wird, so dass die Nährstoffversorgung der sich ausbreitenden Neuronen konstant bleibt.
Obwohl es noch nicht versucht wurde, kann dieses Protokoll mit leichten Änderungen auch bei embryonalen Neuronen der Maus nützlich sein. Wenn die gewünschten Neuronen oder Neurosphären nicht nach dieser Technik erhalten werden, gibt es ein paar Tipps zur Fehlerbehebung, die hilfreich sein können. Um das Gewebe lebensfähig zu halten, muss die Zerlegung in eiskaltem HBSS durchgeführt werden. Die Sezierung kann auch im eiskalten Krebspuffer anstelle des HBSS-Puffers durchgeführt werden. Die schnelle Durchführung der Sezierung ist der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Gewebelebensfähigkeit. Verwendung von 10x Trypsin führt zu einer Überverdauung des Gewebes. Daher sollte die 10x Trypsin-EDTA-Lösung vor der Verdauung auf 1x im Dissoziationspuffer verdünnt werden. Die Zugabe von eiskaltem Medium zu den Zellen, die Frostschock induzieren, sollte um jeden Preis vermieden werden, und Mittel nach Erreichen RT sollte stattdessen verwendet werden. Am wichtigsten ist, dass die Abdeckungen immer mit PDL beschichtet werden sollten, da sonst die Neuronen nicht an den Abdeckungen befestigt werden. Im Falle von Schwierigkeiten bei der Durchführung der Triturierung Schritt (d.h. Gewebe nicht richtig verdauen), Verdauung kann durch Zugabe von 0,5 ml von 1% DNase für 10 min durchgeführt werden. Wenn ein hohes Maß an Kontamination durch nicht-neuronale Zellen auftritt, sollte ein Zytosin-Arabinosid (araC) hinzugefügt werden, um das Wachstum nicht-neuronaler Zellen zu verhindern.
Trotz seiner vielfältigen Vorteile leidet diese Technik unter einigen Einschränkungen. Es ist bekannt, dass diese Technik spontan Neurosphären erzeugt (obwohl die auslösenden molekularen Mechanismen nicht bekannt sind); Allerdings bleiben nur wenige Unklarheiten in Bezug auf diese Technik, wie die genaue Größe der gebildeten Neurosphären und die genaue Anzahl der Tage, die erforderlich sind, um eine ausreichende Anzahl von Neurosphären zu bilden. Meistens ist die Größe das Problem. Obwohl beobachtet wurde, dass Neurosphären im Laufe der Zeit im Volumen expandieren, sind die erhaltenen anfänglichen Neurosphären von variabler Größe. Obwohl nützlich, macht es schwierig, eine synchronisierte Studie durchzuführen. Was dieses Neurosphären-Generierungsprotokoll von anderen unterscheidet, ist seine Robustheit und Einfachheit. Es gibt früher gemeldete Protokolle für die Kultivierung und Ausbreitung von Neuropheren, die spezielle mittlere Anforderungen und Kulturbedingungen erfordern, von denen keines in diesem Protokoll erforderlich ist. In diesen zuvor berichteten Protokollen gibt es kaum Einegleichmäßigkeit für diejenigen, die Neurosphären erzeugen wollen.
Insgesamt beschreibt dieses Protokoll eine einzigartige Strategie für die Erzeugung von 2D- und 3D-Neuronalplattformen, indem einfach die Zellbeschichtungsdichten von primär neuronen, die aus Embryonen von E14-E16 Sprague Dawley-Ratten isoliert sind, verändert werden. Diese Methode ist im Vergleich zu anderen Methoden kostengünstig, da sie mit einer einfachen Einrichtung durchgeführt werden kann und viel weniger Reagenzien und Schritte erfordert. Es kann verschiedene Anwendungen von Interesse für Neurowissenschaftler bieten. Dies kann als Screening-Plattformen für verschiedene neurotherapeutische Leads verwendet werden, die Beobachtung der Rollen von verschiedenen neuronalen Ladungsproteinen, Untersuchungen von zellulären Bahnen in vielen neurodegenerativen Erkrankungen, und viele andere Anwendungen. Die Neurosphären können weiter für das Screening verschiedener neuronaler Differenzierungsmittel und die Untersuchung der frühen Stadien der neuronalen Entwicklung in vitro25,26verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken CSIR-IICB Tieranlage. G. D. dankt ICMR, J. K. und V. G. danken DST Inspire und D. M. bei DBT, Indien für ihre Stipendien. S. G. würdigt SERB (EMR/2015/002230) Indien für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
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