インビボ免疫蛍光局在化(IVIL)法は、生体内腫瘍標的化とexvivo免疫染色の組み合わせを用いて、生体内の腫瘍学的目的のための抗体および抗体コンジュゲートの生体内生分解を調べるために使用することができる。メソッド。
モノクローナル抗体(mAbs)は、がんの検出、診断、治療において重要なツールです。それらは、腫瘍形成におけるタンパク質の役割を解明するために使用され、腫瘍の検出および特徴付けを可能にする癌バイオマーカーに向けられ、免疫エフェクター細胞を活性化するためにmAbsまたは抗体薬物コンジュゲートとして癌治療に使用することができ、阻害するシグナル伝達経路、または特定の抗原を運ぶ細胞を直接殺す。新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の臨床的進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍微小環境の複雑さおよび不均一性によって損なわれる。したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、生体腫瘍微小環境との抗体ベースコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。ここでは、生体内生理的および病理学的条件における抗体ベースの治療薬および診断の相互作用を研究するための新しいアプローチとして、生体内免疫蛍光局所化(IVIL)について説明する。この技術では、治療または診断抗原特異的抗体を生体内に静脈内注射し、単離腫瘍中の二次抗体を用いて局所的なex vivoを投与する。したがって、IVILは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生体分布を反映する。2つのIVILアプリケーションは、乳癌の分子イメージングのための抗体ベースの造影剤の生体分布およびアクセシビリティを評価する記載されている。このプロトコルは、将来のユーザーが独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を適応することを可能にします。
モノクローナル抗体(mAb)は、B細胞によって分泌され、免疫系の主要な機能を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの大きな糖タンパク質(約150 kDa)であり、生物学的機能を同定し阻害するか、または破壊、細菌またはウイルス病原体、および癌細胞1上の異常なタンパク質発現を認識することができる。抗体は、その特異的なエピトープからフェムトモラー濃度まで非常に高い親和性を有し、生物医学2において非常に有望なツールを作ることができる。ミルシュタインとケーラー(1984年にノーベル賞を受賞)によるハイブリドーマ技術の開発により、mAbsの生産が可能になりました3.その後、ヒトmAbsはファージディスプレイ技術またはトランスジェニックマウス株を用いて生成され、新規研究ツールおよび治療薬としての使用に革命を起こし、4,5.
がんは世界的な健康問題であり、予防、検出、治療のための新しいアプローチの必要性を生み出す主な死因6である。現在までに、mAbsは腫瘍形成における遺伝子およびそのタンパク質の役割の駆除を可能にし、癌バイオマーカーに対して指示された場合、患者の層形成のための腫瘍検出および特徴付けを可能にすることができる。がん治療では、二重特異性mAbs、抗体薬物コンジュゲート、およびより小さな抗体断片が治療薬として開発され、および治療有効性を高める標的薬物送達のために7.さらに、抗体は、蛍光誘導手術、光音響(PA)イメージング、超音波(米国)分子イメージング、臨床的に使用される陽電子放出などの分子イメージングモダリティに対する造影剤のバイオマーカーターゲティングに役立ちます。断層撮影(PET)または単一光子発光体コンピュータ断層撮影(SPECT)8.最後に、抗体は、標的治療9に対する患者の階層化および応答モニタリングを可能にするセラノスティック剤としても使用することができる。したがって、新しいmAbsは、がんの検出、診断、および治療において重要な役割を果たし始めています。
新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の重要な進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍環境の複雑さのために無効にすることができる。抗体相互作用は、エピトープの種類、すなわち、線形か立体構造10のいずれに依存する。抗原の認識に加えて、抗体は、抗原を発現する標的細胞に到達するために、血管壁、基底膜、腫瘍間質などの自然な障壁を克服する必要があります。抗体は、可変フラグメントメント抗原結合(Fab)ドメインを介してだけでなく、さらにオフサイト相互作用につながる一定結晶性断片(Fc)を介して組織と相互作用する11。標的化はまた、腫瘍血管化およびリンパ系12、13における腫瘍バルクおよび不均一性全体の腫瘍マーカーの不均一発現によっても複雑である。さらに、腫瘍微小環境は、腫瘍細胞を支えるがん関連線維芽細胞、抗腫瘍免疫反応を抑制する腫瘍免疫細胞、酸素や栄養素の輸送をサポートする腫瘍内皮で構成されています。抗体ベースの治療薬または診断の浸透、分布、および入手可能性を妨げる。全体的に、これらの考慮事項は、治療または診断の有効性を制限し、治療応答を減少させることができ、腫瘍抵抗性をもたらす可能性があります。
したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、腫瘍微小環境内における抗体ベースのコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。現在、前臨床試験において、腫瘍研究モデルにおけるマーカー発現は、腫瘍セクション14の免疫蛍光(IF)染色によりexvivoを分析する。標準的なIF染色は、一次マーカー特異的抗体で行われ、その後、動物から単離された生体内腫瘍組織スライス上の二次蛍光標識抗体によって強調表示される。この技術は、組織固定時のマーカーの静的位置を強調し、抗体ベースの治療薬または診断が生理学的条件でどのように分配または相互作用するかについての洞察を提供しない。PET、SPECT、米国、およびPAによる分子イメージングは、生きている前臨床モデル8、15における抗体共役造影剤分布に関する情報を提供することができる。これらのイメージングモダリティは非侵襲的なので、縦方向の研究を行うことができ、時間に敏感なデータをグループあたり最小限の数の動物で収集することができます。しかし、これらの非侵襲的な分子イメージングアプローチは十分に敏感ではなく、細胞レベルでの抗体分布の局在化のための十分な分解能を有していない。さらに、一次抗体の物理的および生物学的特性は、造影剤16の結合によって劇的に変化してもよい。
抗体ベースの治療と診断が腫瘍環境内でどのように相互作用するかを考慮し、高分解能細胞および細胞下分布を得るために、生体内の生理的および病理学的状態を考慮するために非共役抗体のプロファイルは、抗原特異的抗体が生体内に静脈内に注入される生体内免疫蛍光局在化(IVIL)とみなされるIFアプローチを提案する。抗体ベースの治療または診断は、一次抗体として作用し、機能性血管内を循環し、高精度で生きている腫瘍環境で標的タンパク質に結合する。一次抗体を用いて生体内の腫瘍を単離した後、二次抗体を用いて蓄積および保持された抗体コンジュゲートを局所化する。このアプローチは、蛍光標識抗体17を注入する前述のIF機関学アプローチに類似している。しかし、ここで、非共役抗体の使用は、抗体修飾によって誘導される生体分布特性の潜在的な変化を回避する。さらに、蛍光二次抗体のex vivoアプリケーションは、組織の収集および処理中に蛍光シグナルの損失の可能性を回避し、蛍光シグナル強度の増幅を提供する。当社のラベリングアプローチは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生分解に反映され、新規診断および治療薬の開発に重要な洞察を提供することができます。
ここでは、乳癌検出のための分子イメージングアプローチに対する抗体ベースの造影剤の生体分布とアクセシビリティを研究する前の研究で適用されたIVIL法の2つの応用例について述べた。まず、抗体近赤外色素コンジュゲート(近赤外蛍光色素に結合した抗B7-H3抗体、indocyanine green、B7-H3-ICG)および蛍光および光音響分子に対するアイソタイプ制御剤(Iso-ICG)の生体分布イメージングは18を探索される。このアプリケーションのメソッドは、プロトコルで説明されています。次に、netrin-1に対する立体構造に敏感な抗体の生体分布結果は、典型的には従来のIFイメージングでは検出できない、超音波分子イメージングと共に使用され、代表的な結果19に定量され、提示される。このプロトコルペーパーの結論では、読者は、独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を採用して快適に感じるべきです。
この方法には、いくつかの重要な手順があり、実装を成功させるために潜在的な変更が必要です。まず、抗体/抗体コンジュゲート静脈内注射の投与量およびタイミングは、特定の用途に合わせて調整されなければならない。一般に、抗体コンジュゲートが一般的に使用される方法、すなわち、治療用抗体または抗体ベースの造影剤の一致する用量と一致する用量を使用すべきである。また、…
The authors have nothing to disclose.
ディスカッションと機器の使用に関して、アンドリュー・オルソン博士(スタンフォード神経科学顕微鏡サービス)に感謝します。ユルゲン・K・ウィルマン博士の指導に感謝します。本研究は、NIH R21EB022214助成金(KEW)、NIH R25CA118681研修助成(KEW)、およびNIH K99EB023279(KEW)によって支援されました。スタンフォード神経科学顕微鏡検査サービスはNIH NS069375によってサポートされました。
Animal Model | |||
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
Animal Handling Supplies | |||
27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Tissue Collection | |||
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Antibodies | |||
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
Reagents | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Supplies | |||
Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
Software | |||
FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |