Summary
这项工作描述了一个强大和直接的方法,以检测和量化内分泌大麻素2-阿拉基诺诺甘醇(2-AG)在C.elegans。我们通过同位素稀释和液相色谱-电喷雾电化-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)制备并用于2-AG定量的分析化标准。
Abstract
本工作提出了一种通过液相色谱-电喷雾电化-串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)定性和定量分析2-阿拉基诺诺基甘油(2-AG)的分析标准的方法。内分泌大麻素是调节多种生物的多种生物过程的保存脂质中介物。在C.elegans中,2-AG被发现具有不同的作用,包括调节达瑙形成和胆固醇代谢。本报告描述了一种克服与2-AG量化所需的去化标准的成本和稳定性相关的困难的方法。标准合成程序简单,可在任何实验室进行,无需有机合成专业知识或特殊设备。此外,还描述了Folch从C.elegans文化中提取分离标准的方法的修改。最后,描述了一种使用稳定等位标记模拟1-AG-d5检测2-AG的定量和分析方法,在快速色谱运行中提供了可靠的结果。该程序可用于研究 2-AG 在C. elegan 中的多重作用,同时也适用于不同生物体中代谢物的其他研究。
Introduction
内分泌大麻素调节多种生物过程中的多种生物过程,并保存脂质中介1。首次发现且特征最良好的内分泌大麻素是安丹酰胺(阿拉基诺诺醇酰胺,AEA)和2-阿拉奇诺诺基甘油(2-AG)。内分泌大麻素起许多关键作用,包括那些参与大脑奖励系统以及毒瘾,记忆,情绪和代谢过程2。AEA和2-AG仅在需要时合成,寿命短,通过运输蛋白再摄入和水解3降解。
使用动物模型,如Caenorhabditis elegans (C. elegans)已成为研究各种生物过程,包括凋亡、 细胞信号、 细胞周期、 细胞极性、 基因调控、 代谢、 老化、和性别决定4,5。此外,C. elegans是研究多不饱和脂肪酸 (PUFAs) 生理作用的极佳模型。AEA已在C.elegans中被识别,并在饮食限制6下减少。这种缺陷通过膳食限制机制延长线虫的寿命,这种机制可以通过补充内分泌大麻素来抑制。最近,人们发现2-AG和AEA在管制C.elegans7的胆固醇贩运方面起着基础性作用。更重要的是,它确定,补充外源性2-AG可以拯救牛逮捕,这是由在尼曼-皮克C1型C.elegans突变体中胆固醇贩运受损引起的。
为了更好地了解2-AG与线虫中胆固醇贩运和其他生物过程的关系(即单胺能信号、异位信号和运动),研究这种内源代谢物及其表现至关重要受某些环境和饮食条件影响8、9、10、11、12、13。因此,必须设计和优化一种检测和量化C.elegan中内源性2-AG的方法,这种方法对于不同领域的科学家来说都很简单,特别是那些研究线虫行为的人。内分泌大麻素。
2008 年,Lethonen 和同事使用 LC-MS 分析方法14成功识别了C. elegan 的2-AG 和 AEA。2011年,他们成功地将这项技术推广到其他内分泌大麻素15。最近的研究已经表明,其他分析方法已经成功地检测和量化了C.elegans中的内分泌大麻素,包括质谱和GC-MS 16、17、18,并且它有另据报道,类似的分析方法可以扩展到其他型号19。
以前报告用于量化生物样品中2-AG的分析方法通常涉及使用商业上获取的脱化标准,并要求购买20、21。用于内分泌大麻素的LC-MS/MS定量的许多分析标准可从不同供应商获得。然而,它们价格昂贵,敏感,并且随着时间的推移变得氧化,因为存在多个双键。这些标准最常见的版本是基于八度脱化的阿拉奇酮酸,适合通过同位素稀释LC-MS/MS14,22定量。此外,这些标准大多被替换为甘油的位置2,使它们在大多数条件下不稳定,因为它们容易发生丙基迁移19,23。
为了克服与这些去水标准的成本和稳定性相关的困难,提出了一种方便而简单的方法来准备基于甘油-d5的分析标准。准备五角星标准的顺序需要三步程序,结果为标准的1-AG-d5,这是稳定的,不进行丙基迁移(在旨在合成2个单酸甘油时的主要问题)。
这里的主要目标是展示一种简单且可重复的方法,用于研究C.elegans中的2-AG,包括分析化标准的综合、线虫样品的制备和提取,以及LC-MS/MS的分析(图1)).这种合成程序在没有精密的有机合成知识或特殊设备的情况下是可以实现的,因此适合不同领域的科学家,他们正在研究在内分泌素影响下对C.elegans的行为。该方法还可以扩展到其他研究模型,使其适用于不同的目标。此处报告的标准已应用于成功开发一种快速可靠的色谱方法,以便以可重现的方式有效检测和定量 2-AG。
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Protocol
1. 1-AG-d5准备
注:为了获得1-AG-d5作为定量检测的内部标准,请遵循如下详细协议。
- 差分保护
- 为了只保护原发性酒精,首先使用巴斯德移液器在10 mL反应管中加入38毫克甘油-d8,然后加入磁搅拌器。
- 使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 5 mL 无水二氯甲烷 (DCM),并用干 N2填充管,产生惰性大气。
- 使用装满蒸馏乙酸乙酸的浅德瓦尔烧瓶准备浴缸。
- 将密封反应管放入浴缸内,在乙酸乙酯中缓慢加入液体N2,直至溶剂冷冻,使其冷却。
注意:液体在室温 (RT) 下剧烈沸腾,接触眼睛和皮肤时可引起严重烧伤。 - 使用汉密尔顿注射器加入54毫克无水胶氨酸。
注意:科利丁是挥发性的,有非常强烈和令人不快的气味。 - 加入70毫克的三丁基甲基硅酸盐,并在-78°C下在磁搅拌器上搅拌整个溶液3小时。
- 3小时后,在RT处保持反应温暖,再搅拌12小时。
- 加入2 mL的盐水来淬火反应。
- 使用分离漏斗用2mL蒸馏二氯甲烷提取溶液3倍,每次节省有机提取物。
- 将三种有机提取物混合,在硫酸钠上干燥。
- 在真空旋转蒸发器中小心地在减压下蒸发二氯甲烷,以避免溶剂投影。
- 使用硅胶作为固定相和10%增加己酸/乙酸梯度,从100%己化,从100%乙酸乙酯完成,用100%乙酸乙酯完成,通过柱色谱法净化粗糙混合物。
- 在真空旋转蒸发器中结合含产品馏分,在减压下去除溶剂,获得纯1-O、3-O-bis-(TBDMS)甘油-d5作为无色液体。
- 酯
- 使用巴斯德移液器将 10 mg 的 1-O、3-O-bis(TBDMS)-甘油-d5(以前合成)添加到 10 mL 反应管中,并添加磁性搅拌器。
- 使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 2 mL 无水二氯甲烷,并用干 N2填充管,产生惰性大气。
- 使用冰浴将溶液冷却至 0°C。
- 使用多体积可调微管器加入36毫克的阿激酸,搅拌。
- 加入15毫克4-二甲基氨基甲酰胺,搅拌。
- 使用多体积可调微管器加入15毫克的N,N'-二丙丙二丙二溴二酯,搅拌。
- 让混合物在0°C下反应3小时。
- 3小时后,在RT处保持反应温暖,再搅拌12小时。
- 加入2 mL的水来淬火反应。
- 使用分离漏斗用2 mL蒸馏二氯甲烷(DCM)提取有机溶液3倍。
- 将三种有机提取物放入同一管中,将其干燥到硫酸钠上。
- 在真空旋转蒸发器中小心地在减压下蒸发二氯甲烷,以避免溶剂投影。
- 使用硅胶作为固定相和10%增加己酸/乙酸乙酯梯度,从100%己酸开始,用50%己酸/50%乙酸乙酯完成,通过柱色谱法净化粗糙混合物。
- 在真空旋转蒸发器中结合含产品馏分,在减压下去除溶剂,获得纯1-O-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5作为黄色液体。
- 取消保护
- 使用巴斯德移液器将 15 毫克 1-O、3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5(以前合成)添加到 10 mL 反应管中,并添加磁性搅拌器。
- 使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 2 mL 无水 THF,并用干燥的 N2填充管,产生惰性大气。
- 使用冰浴将溶液冷却至 0°C。
- 使用汉密尔顿注射器在THF中加入1M四丁二醇氟化溶液的150μL滴液。
- 让反应温暖到RT,搅拌1小时。
- 1小时后,加入2 mL的水来淬火反应。
- 使用分离漏斗用2mL蒸馏二氯甲烷提取溶液3倍。
- 将三种有机提取物混合,在硫酸钠上干燥。
- 在真空旋转蒸发器中,在减压下蒸发二氯甲烷,以获得纯1-AG-d5作为黄色液体。
- 通过在硅胶 60 F254预涂层铝板上执行的薄层色谱,监控所有反应。使用 4-甲醛乙醇溶液染色后,在 254 nm UV 灯下可视化带。
2. 标准库存和测量解决方案的准备
- 在 ACN 的 1 mL 中溶解 1 mg 的内部标准 1-AG-d5和声波 1 分钟,以获得 1,000 ppm 标准库存溶液。
- 要制备用于蠕虫定量的 1,000 ppb 溶液,首先准备 10 ppm 溶液:使用汉密尔顿注射器获取 10 μL 的库存溶液,并通过添加 990 μL 的 ACN 将其稀释至 1 mL 的最终体积。
- 从使用汉密尔顿注射器从步骤 2.2 中生产的溶液中取 100 μL,通过加入 900 μL 的 ACN 将其稀释至 1 mL 的最终体积,以获得用于定量的 1,000 ppb 溶液。
- 在每个步骤之间进行 1 分钟的声波,以确保完全溶解。将溶液储存在-78°C,以保持标准的浓度和完整性。使用标准溶液后,在关闭小瓶之前流一些氮气,以防止氧化。
3. C. elegans的生长和维持
注:用大肠杆菌OP50播种线虫生长培养基(NGM)琼脂板,并在这些板上繁殖蠕虫。
- 混合 3 克 NaCl 与 17 克琼脂。
- 加入2.5克肽,然后加入975 mL的H2O。
- 高压灭菌50分钟,然后冷却烧瓶至55°C。
- 混合: 1 m L 的 1 M CaCl2,1 m MgSO4的 1 m L, 25 mL 的 1 M KH2PO4缓冲液 (所有这些都以前已灭武), 和 1 mL 的 5 mg/mL 胆固醇在乙醇.
- 在保持无菌环境的同时,将 NGM 溶液放入 60 mm Petri 板中,将板的容量填充到其体积的三分之二。将盘子储存在 4°C。
- 将大肠杆菌培养物从-80°C甘油储存到LB琼脂板上。让它在37°C的板上过夜。
- 拿起单个菌落,在37°C下用搅拌在37°C处接种100 mL的液体LB。
注: 没有必要检查 O.D.,因为此应变可以在此时间达到静止相位。 - 拆下存储的 NGM 板,取下层流罩中的盖子,然后保持打开状态,以便从板中蒸发多余的水分。
- 盘子干燥后,使用巴斯德移液器向板中心添加 100 μ0 μL 的 OP50大肠杆菌,而不会扩散。
- 离开OP50大肠杆菌草坪在RT或37°C下生长8小时。
- 加入通过次氯酸盐处理或"漂白"获得的所需数量的蠕虫胚胎(第4节)。
注:在添加蠕虫之前,将板冷却到 RT。
4. 用于同步C elegans培养的漂白技术
- 种子和块蠕虫到6厘米NGM板。
- 让蠕虫生长2-3天,以获得足够的鸡蛋和肉汁成人在盘子里。
- 一旦有足够的鸡蛋/成人,将5 mL的M9倒在盘子上。
- 使用玻璃移液器将蠕虫转移到 15 mL 离心管中。
- 在 2,000 x g下将管离心 2 分钟,然后将蠕虫颗粒。
- 吸出大部分M9,避免蠕虫颗粒的干扰。
- 添加 3 mL 漂白溶液(NaOH:NaOCl:H2O)的 2:1:1 比率)。
- 轻轻反转以混合溶液5分钟或直到完整的成年蠕虫数量减少。
注意:请勿漂白超过5分钟。 - 在 2,000 x g下离心 1 分钟,吸吸大部分漂白溶液,而不会干扰蠕虫颗粒。
- 加入 15 mL 的 M9 并混合均匀。
- 在 2000 x g下再次离心 1 分钟。
- 吸出大部分M9,而不会干扰蠕虫颗粒。
- 重复步骤 4.10-4.12 一次或两次。
- 加入5 mL的新鲜M9和搅拌。
- 让鸡蛋在温柔的摇动下孵化过夜。
5. 蠕虫样品制备
- 让通过漂白程序获得的N2胚胎在M9缓冲液(15mL离心管中的5 mL)在20°C处孵化过夜。
- 在2000 x g下离心管2分钟,收获同步L1。
- 使用 M9 缓冲液 1x 清洗蠕虫,然后量化活 L1 蠕虫的数量。
- 将大约 10,000 种蠕虫播种到 NGM 板(直径 10 厘米),其中 1 mL 的 OP50大肠杆菌(以前干燥)。
- 在20°C下孵育板48小时,直到蠕虫到达L4级。
- 在15 mL离心管中用冷M9缓冲液收获蠕虫,洗涤1次,然后将其转移到1.5 mL管中。
- 在2000 x g下离心1分钟,消除大部分上清液,将管浸入液氮中,并储存在-80°C。
6. 脂质提取
- 在冰上解冻大约100 μL的属于N2的冷冻蠕虫颗粒,加入1.3 mL的甲醇,并将样品声波4分钟。
- 加入2.6 mL的氯仿和1.3 m KCl/0.08 M H3PO4,最终比例为1:2:1,内部标准1-AG-d5的1,000ppb,以及丁酸羟基甲苯作为抗氧化剂,最终浓度为50微克/mL。
- 将样品涡旋1分钟,在超声波水浴中声波15分钟。
- 将样品涡旋2倍1分钟,在2000 x g下离心10分钟,以诱导相分离。
- 收集下相并将其收集在干净的管中,在氮气下干燥,并将固体残留物重新悬浮在 100 μL 的 ACN 中。
7. HPLC-MS/MS的内分泌大麻素分析
- 使用液相色谱与ESI三四极极质谱仪相结合,检测和量化线虫样品中的2-AG。
- 对于倒相 HPLC 使用以下比率:从 0.0-0.5 分钟 H2O:ACN (40:60),0.5-6.5 分钟 H2O:ACN (40:60) 到 (25:75), 6 .5-7.5 分钟 H2O:ACN (25:75), 7.5-8.0 分钟 H2O:ACN (25:75) 到 (40:60), 8.0-12.0 分钟 H2O:ACN (40:60)。
- 将柱温度保持在 40°C,并将自动进样器托盘温度设置为 10°C。
- 设置以下电化条件:正电子模式;干燥气体 (N2) 温度 = 300 °C;干燥气体流速= 10 L/min;雾化器压力 = 10 UA;和帽子。电压 = 4 千伏。
- 对于反毒检测,使用具有以下转换的 MRM:2AG 的 379.2 m/z 到 289.2 m/z;和 384.2 m/z 到 289.2 m/z 的 1-AG-d5。
8. 蠕虫内分泌大麻素定量
- 使用已解内部标准 1-AG-d5并计算 Anlyante 与内部标准的峰值面积比率。
- 使用以下转换:2-AG 的 384.2 m/z 到 287.2 m/z;和 379.2 m/z 到 287.2 m/z 的 1-AG-d5。
- 使用标准的浓度值,通过与被解标准的峰值面积比进行比较,计算内源性2-AG的浓度。
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Representative Results
一个同位素标记的模拟成功地合成了从市售的d8-甘油和阿拉奇酮酸使用3步合成方法(图2,图3)。这些步骤简单明了,不需要精密的设备、特殊控制的条件或昂贵的试剂。因此,这种方法是健壮的,可以成功地扩展到合成含有不同脂肪酸的甘油酯。
1-AG-d5采用核磁光谱结构特征。1H NMR 显示特征倍数为 5.44 ppm 至 4.93 ppm,该特性倍数为 5.44 ppm 至 4.93 ppm,该特性与 2.40 ppm 的八个乙烯基质子集成,与 α 位置的两个质子相相对应。在2D NMR 中,还可以看到甘油部分的五个分量可分配 2.9 ppm 到 2.7 ppm 的多倍。
化学合成的1-AG-d5在C.elegans样品中用作内部标准。该标准在提取前被添加到样品中,然后用从Folch24改编的简单方法提取与内源性脂质。此修改方法提供了较高的标准回收值,如 HPLC 量化所示。
该方法针对 2-AG 的转换 1) 384.2 m/z 到 287.2 m/z 到 287.2 m/z,对于 1-AG-d5,对 1-AG-d 5 进行了优化,其中甘油分子丢失(图 4)。使用校准曲线计算了标准检测(LOD)和定量(LOQ)的极限,结果值分别为5ppb和16.6ppb。标准的保留时间是 6.8 分钟。
使用HPLC-MS/MS(图5)用化学合成的1-AG-d5成功地检测和量化了来自C.elegans样品的2-AG内源性。
由于样品1和3中分离标准的原始浓度为1,000ppb,因此从峰值面积比中,可以计算出样品1的内源浓度为340ppb,样品3为360ppm,平均产生350 ppm(表 1)。
图1:合成、蠕虫采样和定量摘要。为了成功地量化内源性2-AG,有必要使用三步序列合成其解释的模拟。之后,它被添加到蠕虫样本中,由HPLC-MS/MS提取和分析。作为内部标准,1-AG-d5的合成物是用于量化内源代谢物的工具。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:获得1-AG-d5的综合方案。使用三步法获得10mg的脱氧模拟,涉及1)保护甘油-d-d8,2)用阿沙地酸消融,3)脱保护。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:异构标记2-AG模拟的化学结构。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:用于量化1-AG-d5和2-AG的选定碎片。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:1-AG-d5和1-AG的HPLC色谱图作为蠕虫样品中的纯标准和内部标准。可以分析保留时间,并看到 1) 蠕虫似乎没有内源性 1-AG 和 2) 它只有 2 AG,但标准 1-AG-d5仍将作为通过同位素稀释量化的良好分析标准。2AG 的转换为:2AG 的 384.2 m/z 到 287.2 m/z,1-AG-d5的 379.2 m/z 到 287.2 m/z。请点击此处查看此图的较大版本。
1-AG-d5 | 2-AG | 比率 (2-AG/1-AG-d5) | |
示例 1 | 71964.74 | 210616.08 | 0.34 |
示例 3 | 74311.36 | 205648.43 | 0.36 |
表1:标准与内源性2-AG的峰值面积比。两个分离样品的峰值区域分别为2-AG和1-AG-d5之间的商数计算,这两个样本在提取前都添加了分离标准。
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Discussion
内分泌大麻素是一类脂质,在C.elegans7中涉及对种黄的调节。更具体地说,多不饱和脂肪酸(PUFAs)的合成对胆固醇贩运和蠕虫的生殖发育非常重要。据此间透露,2-AG是一种含有内分泌大麻素的甲壳类酸,负责使达尔幼虫在胆固醇代谢受损的蠕虫中恢复其正常周期。
鉴于最近发现的2-AG在提高胆固醇贩运和其他生物过程的重要性,以及对脂质如何影响这一过程知之甚少,有必要为这种内分泌大麻素提供可靠的检测方法。成功开发这种简单而强大的合成方法,以获得去化模拟1-AG-d5是该协议的关键步骤。
所报告的量化单基甘油的大多数方法都涉及使用商业上可用的分析标准,这些标准在常规储存条件下通常昂贵且不稳定。这使得他们不方便研究人员谁需要大量的标准和新鲜库存。对于预算较低的实验室,它们也无法访问。然而,这种方法克服了这一障碍,建议使用更容易访问的起始材料合成标准。
值得注意的是,与其他报告的方法相反(使用在许多条件下遭受丙基迁移的2替代单酸甘油的脱硫分析标准,以便看到两个色谱峰并影响相对通过同位素稀释25定量,该方法有效地使用1替代脱硫分析标准,这是一个单一的异构体,不进行电原迁移。
合成方法简单明了,无需任何复杂的条件,因此非常适合任何设备、预算和反应物的实验室。这也是一个简单的技术,可供任何在现场工作的科学家使用,而无需在有机合成方面进行特殊培训。蠕虫样品制备是常规方法,无进一步并发症。最后,获得最终样品的脂质提取方法是从Folch的协议24中修改,允许更好的恢复值,因为它不需要色谱柱纯化。
关键步骤是确保样品制备和脂质提取充分进行,以实现标准的良好和可检测的回收。同样重要的是,1) 每月生产新鲜库存解决方案,以保持标准条件,2) 通过 NMR 光谱或 LC-MS 检查标准是否仍然纯净且未经过氧化或降解。该技术的唯一局限性取决于其扩展到其他研究,这些研究的内源性2-AG浓度可能低于所提出的LOQ。在这种情况下,应修改方法以确保浓度介于限制之间。
在协议失效的情况下,1)没有明显的色谱信号的标准或2)标准提取后的回收值低于预期,建议重复样品制备和脂质提取。由于合成途径涉及合成一个受保护的脱硫甘油构建基块,最后在最后一步与阿奇西酮酸一起囊化,因此此方法可以扩展到其他单基甘油的脱硫标准的合成,二环醇、磷脂和结构相关的代谢物。
总之,这个新程序描述了一种简单易行的检测和量化2-AG的方法,这将有助于解决一些未回答的问题,关于这种内分泌大麻素在C.elegans中的作用。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家科学与技术发展协会(ANPCyT,PICT,2014-3693年)的研究赠款的支持。J.F.d.L.、G.P.和B.H.C.是来自CONICET的研究员。D.D.M.和G.R.L.是CONICET研究事业的成员。我们感谢冈萨洛·兰贝托(INMET)的LC-MS/MS分析和有益的讨论。拉米罗·奥尔特加和玛丽亚·索莱达·卡萨索拉拉来自阿根廷罗萨里奥国立罗萨里奥国立体育学院,国际学院。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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