Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Syntese av en Deuterert standard for kvantifisering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

Published: September 21, 2019 doi: 10.3791/59882
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,3
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

Summary

Dette arbeidet beskriver en robust og grei metode for å oppdage og kvantifisere endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deuterert standard oss forberedt og brukes for kvantifisering av 2-AG ved isotopanrikning fortynning og flytende kromatografi-electrospray ionisering-tandem Mass massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Dette arbeidet presenterer en metode for å utarbeide en analytisk standard for å analysere 2-arachidonoyl glyserol (2-AG) kvalitativt og kvantitativt av flytende kromatografi-electrospray ionisering-tandem Mass massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids er bevart lipid meglere som regulerer flere biologiske prosesser i en rekke organismer. I C. elegans, 2-AG har blitt funnet å ha ulike roller, inkludert modulering av dauer dannelse og kolesterol metabolisme. Denne rapporten beskriver en metode for å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnader og stabilitet i deuterert standarder som kreves for 2-AG kvantifisering. Prosedyren for syntese av standarden er enkel og kan utføres i ethvert laboratorium, uten behov for Organisk syntese ekspertise eller spesialutstyr. Dessuten, en modifisering av Folch ' metoden å ekstra det deuterert målestokk fra C. elegans kulturen er beskrevet. Til slutt, en kvantitativ og analytisk metoden å merker 2-AG benytter det stabile isotopically benevnt analog 1-AG-d5 er beskrevet, hvilke skaffer pålitelig resultater inne en rask-kromatografiske løpe. Fremgangsmåten er nyttig for å studere flere roller av 2-AG i C. elegans samtidig som gjelder for andre studier av metabolitter i ulike organismer.

Introduction

Endocannabinoids regulere flere biologiske prosesser i en rekke organismer og er bevart lipid meglere1. Den første oppdaget og mest godt preget endocannabinoids er anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) og 2-arachidonoyl glyserol (2-AG). Endocannabinoids spiller mange kritiske roller, inkludert de som er involvert i hjerne belønningssystemer, samt narkotikaavhengighet, minne, humør og metabolske prosesser2. AEA og 2-AG er bare syntetisert ved behov og har kortlevetid spenn, og de er degradert gjennom transport protein reopptak og hydrolyse3.

Bruken av dyremodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) har blitt viktig å studere det store utvalget av biologiske prosesser inkludert apoptose, celle signalering, celle syklus, celle polaritet, gen regulering, metabolisme, aldring, og sex besluttsomhet4,5. I tillegg er C. elegans en utmerket modell for å studere de fysiologiske rollene til flerumettede fettsyrer (fuf). AEA har blitt identifisert i C. elegans og er redusert under kosttilskudd restriksjon6. Denne mangelen forlenger levetiden til nematode gjennom et kosttilskudd Begrensnings mekanisme som kan undertrykkes av tilskudd med endocannabinoid. Nylig ble det oppdaget at 2-AG og AEA spille fundamentale roller i regulering av kolesterol handel i C. elegans7. Enda viktigere var det fastslått at tilskudd med eksogene 2-AG kan redde dauer arrest, som er forårsaket av nedsatt kolesterol handel i Niemann-Pick type C1 C. elegans mutanter.

For å få en bedre forståelse av 2-AG forhold til kolesterol handel og andre biologiske prosesser i nematode (dvs. monoaminergic signalering, Nociception og bevegelse), er det avgjørende å studere denne endogene metabolitten og hvordan det er påvirket under visse miljø-og diett forhold8,9,10,11,12,13. Derfor er det viktig å designe og optimalisere en metode for å oppdage og kvantifisere endogene 2-AG i C. elegans som er enkel å bruke for forskere i ulike felt, spesielt de som studerer nematode atferd i forhold til dette endocannabinoid.

I 2008 lyktes Lethonen og kollegaer i å identifisere 2-AG og AEA i C. elegans ved hjelp av LC-MS analytiske metoder14. I 2011 klarte de å utvide denne teknikken til andre endocannabinoids15. Nyere arbeid har vist andre analytiske metoder som har lykkes i å oppdage og kvantifisere endocannabinoids i C. elegans, inkludert Mass massespektrometri og GC-MS16,17,18, og det har også blitt rapportert at lignende analytiske metoder kan utvides til andre modeller19.

Tidligere rapportert analytiske metoder som brukes for kvantifisere 2-AG i biologiske prøver vanligvis innebære bruk av deuterert standarder som er kommersielt ervervet og krever tilgjengelighet for kjøpet20,21. Mange analytiske standarder for LC-MS/MS kvantifisering av endocannabinoids er kommersielt tilgjengelig fra ulike tilbydere. Likevel, de er dyre, er følsomme, og blir oksidert over tid, på grunn av tilstedeværelsen av flere doble obligasjoner. De vanligste versjonene av disse standardene er basert på oktav-deuterert arachidonic syre og er egnet for kvantifisering av isotop fortynning LC-MS/MS14,22. Også de fleste av disse standardene er erstattet i posisjon 2 av glyserol, noe som gjør dem ustabile under de fleste forhold siden de er utsatt for acyl migrasjon19,23.

For å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnader og stabilitet i disse deuterert standarder, en praktisk og enkel metode er presentert for å utarbeide en analytisk standard basert på glyserol-d5. Sekvensen for å forberede Penta-deuterert standard krever en tre-trinns prosedyre som resulterer i standard 1-AG-d5, som er stabil og ikke gjennomgår acyl migrasjon (Hovedproblemet når satsing å syntetisere 2-monoacylglycerols).

Hovedmålet her er å vise en enkel og reproduserbar metode for å studere 2-AG i C. elegans, inkludert syntese av analytiske deuterert standard, utarbeidelse og ekstraksjon av nematode prøvene, og analyse av LC-MS/MS (figur 1 ). Denne syntetiske prosedyren er oppnåelig uten sofistikert Organisk syntese kunnskap eller spesialutstyr, noe som gjør det egnet for forskere fra ulike felt som studerer C. elegans oppførsel under endocannabinoid innflytelse. Metoden kan også utvides til andre studie modeller, noe som gjør det nyttig for ulike mål. Standarden, utarbeidet som rapportert her, har blitt brukt for å lykkes utvikle en rask og pålitelig kromatografiske metode som gjør det mulig for effektiv påvisning og kvantifisering av 2-AG i en reproduserbar måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.1-AG-d5 forberedelse

Merk: for å få 1-AG-d5 som en deuterert intern standard for kvantifisering analyser, følg protokollen som beskrevet nedenfor.

  1. Differensial beskyttelse
    1. For å bare beskytte primære alkoholer, først legge 38 mg glyserol-d8 til en 10 ml reaksjons rør ved hjelp av en Pasteur pipette og legge til en magnetisk rører.
    2. Tilsett 5 mL vannfri diklormetan (DCM) ved hjelp av et 5 mL Hamilton sprøyte, og fyll røret med tørr N2 for å gi en inert atmosfære.
    3. Forbered et bad ved hjelp av en grunne Dewar kolbe fylt med destillert etanol acetate.
    4. Fit hermetisk lukket reaksjon tube inne i badekaret og avkjøle det ved langsomt å legge flytende N2 til etanol acetate til løsemiddel er frosset.
      FORSIKTIG: væske er voldsomt koker ved romtemperatur (RT) og kan forårsake alvorlige brannskader når du kontakter øyne og hud.
    5. Tilsett 54 mg vannfri collidine med en Hamilton-sprøyte.
      FORSIKTIG: Collidine er flyktig og har en veldig sterk og ubehagelig duft.
    6. Tilsett 70 mg tert-butyldimethylsilyl klorid og rør hele oppløsningen for 3 timer ved-78 ° c på en magnetisk rører.
    7. Etter 3 h, la reaksjonen å varme på RT og holde omrøring for en ekstra 12 h.
    8. Tilsett 2 mL saltlake for å slukke reaksjonen.
    9. Pakk løsningen 3x med 2 mL destillert diklormetan ved hjelp av en skille trakt, lagre organisk ekstrakt hver gang.
    10. Kombiner de tre organiske ekstrakter og tørk dem over natriumsulfat.
    11. Fordampe diklormetan under redusert trykk i en vakuum roterende fordamper nøye for å unngå løsemiddel anslag.
    12. Rens råolje blandingen ved kolonne kromatografi ved hjelp av silica gel som den stasjonære fase og en 10% økende Heksan/etanol acetate gradient, fra 100% Heksan og etterbehandling med 100% etanol acetate.
    13. Kombiner produktet inneholder fraksjoner og fjerne løsemiddel under redusert trykk i en vakuum roterende fordamper for å få den rene 1-O, 3-O-BIS-(TBDMS) glyserol-d5 som en fargeløs væske.
  2. Esterification
    1. Tilsett 10 mg av 1-O, 3-O-BIS (TBDMS)-glyserol-d5 (tidligere syntetisert) til en 10 ml reaksjons rør ved hjelp av en Pasteur pipette og legge til en magnetisk stirrer.
    2. Tilsett 2 mL vannfritt diklormetan med en 5 mL Hamilton sprøyte, og fyll slangen med tørr N2 for å gi en inert atmosfære.
    3. Cool løsningen til 0 ° c ved hjelp av et is bad.
    4. Tilsett 36 mg arachidonic syre ved hjelp av en multi-volum justerbar micropipette og rør.
    5. Tilsett 15 mg 4-dimethylaminopyridine og rør.
    6. Legg 15 mg N, N'-diisopropylcarbodiimide ved hjelp av en multi-volum justerbare micropipette og røre.
    7. La blandingen reagere ved 0 ° c i 3 timer.
    8. Etter 3 h, la reaksjonen å varme på RT og holde omrøring for en ekstra 12 h.
    9. Tilsett 2 mL vann for å slukke reaksjonen.
    10. Pakk ut den organiske løsningen 3x med 2 mL destillert diklormetan (DCM) ved hjelp av en skille trakt.
    11. Plasser de tre organiske ekstrakter i samme rør og tørk dem over natriumsulfat.
    12. Fordampe diklormetan under redusert trykk i en vakuum roterende fordamper nøye for å unngå løsemiddel anslag.
    13. Rens råolje blandingen ved kolonne kromatografi ved hjelp av silica gel som den stasjonære fase og en 10% økende Heksan/etanol acetate gradient, fra 100% Heksan og etterbehandling med 50% Heksan/50% etanol acetate.
    14. Kombiner produkt-inneholdende fraksjoner og fjerne løsemiddel under redusert trykk i en vakuum roterende fordamper for å få den rene 1-O, 3-O-BIS (TBDMS) -2-AG-d5 som en gulaktig væske.
  3. Deprotection
    1. Tilsett 15 mg av 1-O, 3-O-BIS (TBDMS) -2-AG-d5 (tidligere syntetisert) til en 10 ml reaksjons rør med en Pasteur pipette og tilsett en magnetisk rører.
    2. Tilsett 2 mL vannfri THF ved hjelp av en 5 mL Hamilton-sprøyte, og fyll slangen med tørr N2 for å gi en inert atmosfære.
    3. Cool løsningen til 0 ° c ved hjelp av et is bad.
    4. Tilsett 150 μL dråpevis av 1 M tetrabutylammoniumfluorid fluor løsning i THF ved hjelp av en Hamilton-sprøyte.
    5. La reaksjonen varmes til RT og rør i 1 time.
    6. Etter 1 time, tilsett 2 mL vann for å slukke reaksjonen.
    7. Pakk ut løsningen 3x med 2 mL destillert diklormetan ved hjelp av en skille trakt.
    8. Kombiner de tre organiske ekstrakter og tørk dem over natriumsulfat.
    9. Fordampe diklormetan under redusert trykk i en vakuum roterende fordamper for å få den rene 1-AG-d5 som en gulaktig væske.
  4. Overvåk alle reaksjoner med tynt lag kromatografi utført på silica gel 60 F254 pre-belagt aluminiumsplater. Visualiser bandene under en 254 NM UV lampe etter farging med en ethanolic løsning av 4-anisaldehyde.

2. utarbeidelse av standardlager-og måleløsninger

  1. Løs opp 1 mg av den interne standarden 1-AG-d5 i 1 ml ACN og sonikere i 1 min for å få den standardlager løsningen på 1 000 ppm.
  2. For å klargjøre 1 000 ppb oppløsning som brukes til kvantifisering i ormer, klargjør du først en 10 ppm-løsning: ta 10 μL av lager løsningen ved hjelp av en Hamilton-sprøyte og fortynne den til et endelig volum på 1 mL ved å tilsette 990 μL av ACN.
  3. Ta 100 μL fra løsningen som ble produsert i trinn 2,2 ved hjelp av en Hamilton-sprøyte, og fortynne den til et endelig volum på 1 mL ved å legge til 900 μL av ACN for å få den 1 000 ppb løsningen som brukes til kvantifisering.
  4. Sonikere for 1 min mellom hvert trinn for å sikre fullstendig oppløseliggjøringen. Oppbevar løsningene ved-78 ° c for å opprettholde konsentrasjonen og integriteten til standardene. Etter at standardløsningen er brukt, må du strømme litt nitrogen før du lukker hetteglasset for å hindre oksidasjon.

3. vekst og vedlikehold av C. elegans

Merk: Seed den nematode vekstmedium (NGM) agar plater med E. coli OP50 og spre ormer på disse platene.

  1. Bland 3 g av NaCl med 17 g agar.
  2. Tilsett 2,5 g peptone, legg deretter til 975 mL av H2O.
  3. Autoklav for 50 min, og deretter avkjøles flasken til 55 ° c.
  4. Bland følgende: 1 mL 1m CaCl ml1 m MgSO4, 25 ml 1 m KH2PO4 buffer (som alle har vært tidligere autoklaveres), og 1 ml 5 mg/ml kolesterol i etanol.
  5. Mens du opprettholder et sterilt miljø, dispensere NGM løsningen i 60 mm Petri plater, fylle platene til to tredjedeler av deres volum. Oppbevar platene ved 4 ° c.
  6. Strek E. coli bakteriell kultur fra a-80 ° c glyserol lager på lb agar plate. La det vokse på tallerkenen over natten på 37 ° c.
  7. Plukk opp en enkelt koloni for å vaksinere 100 mL av flytende LB over natten ved 37 ° c med agitasjon.
    Merk: det er ikke nødvendig å sjekke OD fordi denne belastningen kan nå stasjonær fase over denne tiden.
  8. Fjern de lagrede NGM platene, Fjern lokkene i laminær strømnings hette, og la være åpne for å tillate fordampning av overflødig fuktighet fra platene.
  9. Når platene er tørket, bruk en Pasteur-pipette for å legge til 100 μL av OP50 E. coli til midten av platen uten å spre seg.
  10. La OP50 E. coli plenen vokse over natten ved RT eller ved 37 ° c for 8 timer.
  11. Legg til ønsket nummer orm embryo oppnådd ved natriumhypokloritt behandling eller "bleking" (del 4).
    Merk: Avkjøl platene til RT før tilsetning av ormer.

4. bleking teknikk for synkronisering C elegans kulturer

  1. Seed og blings ormer på 6 cm NGM plater.
  2. La ormer vokser for 2-3 dager for å få tilstrekkelig antall egg og gravid voksne på tallerkenen.
  3. Når det er nok egg/voksne, helle 5 mL av M9 på tallerkenen.
  4. Overfør ormene til et 15 mL sentrifugerør med en glass pipette.
  5. Sentrifuger røret i 2 min ved 2 000 x g og pellet ormene.
  6. Sug ut det meste av M9, unngå forstyrrelse av ormen pellet.
  7. Tilsett 3 mL bleking løsning (2:1:1 forholdet NaOH: NaOCl: H2O).
  8. Inverter forsiktig å blande løsningen i 5 min eller til antall intakt voksen ormer avtar.
    FORSIKTIG: ikke blekemiddel i mer enn 5 minutter.
  9. Sentrifuger for 1 min ved 2 000 x g og sug det meste av bleking løsningen uten å forstyrre ormen pellet.
  10. Tilsett 15 mL av M9 og bland godt.
  11. Sentrifuger igjen ved 2000 x g i 1 min.
  12. Sug ut det meste av M9 uten å forstyrre ormen pellet.
  13. Gjenta trinn 4.10-4.12 en eller to ganger til.
  14. Tilsett 5 mL fersk M9 og agitere.
  15. La eggene klekkes over natten med milde rocking.

5. forberedelse av orm prøver

  1. La N2 embryo oppnås ved bleking prosedyren Luke over natten i M9 buffer (5 mL i et 15 mL sentrifugerør) ved 20 ° c.
  2. Harvest synkronisert L1s ved sentrifugering røret for 2 min på 2 000 x g.
  3. Vask ormer med M9 buffer 1x, deretter kvantifisere antall Live L1 ormer.
  4. Seed ca 10 000 ormer i NGM plater (10 cm diameter) med 1 mL OP50 E. coli (tidligere tørket).
  5. Ruge platene for 48 h ved 20 ° c til ormene kommer til L4-scenen.
  6. Harvest ormene ved hjelp av kaldt M9 buffer i en 15 mL sentrifuge tube, vaske dem 1x, deretter og overføre dem til en 1,5 mL tube.
  7. Pellet ormene av sentrifugering på 2 000 x g for 1 min, eliminere det meste av supernatanten, dyppe rørene i flytende nitrogen, og lagre ved-80 ° c.

6. lipid utvinning

  1. Tin ca. 100 μL av frosne orm pellets som tilhører N2 på is, tilsett 1,3 mL metanol og sonikere prøven i 4 min.
  2. Tilsett 2,6 mL kloroform, og 1,3 mL 0,5 M KCl/0.08 M H3PO4 til et endelig forhold på 1:2:1, 1 000 ppb av den interne standarden 1-AG-d5, og butylert butylhydroksytoluen som antioksidant middel ved en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml.
  3. Vortex prøvene i 1 min og sonikere i et ultralyd vannbad i 15 minutter på is.
  4. Vortex prøvene 2x for 1 min og sentrifuger for 10 min ved 2 000 x g for å indusere fase separasjon.
  5. Samle den nedre fasen og samle den i et rent rør, tørk den under nitrogen, og resuspend den faste rester i 100 μL av ACN.

7. Endocannabinoid analyse av HPLC-MS/MS

  1. Bruk flytende kromatografi kombinert med en ESI trippel quadrupole masse spektrometer å oppdage og kvantifisere 2-AG fra nematode prøver.
  2. Bruk følgende forhold for reversert-fase HPLC: fra 0,0-0,5 min H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min h2O:ACN (40:60) til (25:75), 6,5-7.5 min h2O:ACN (25:75), 7,5-8.0 min h2O:ACN (25:75) til (40:60), 8.0-12.0 min h2O: ACN (40:60).
  3. Oppretthold Kol onne temperaturen ved 40 ° c og Still inn autosampler skuff temperatur til 10 ° c.
  4. Angi følgende ionisering betingelser: positiv-ion-modus; tørking gass (N2) temperatur = 300 ° c; tørking gass strømningshastighet = 10 L/min; forstøveren trykk = 10 UA; og lue. spenning = 4 kV.
  5. For analytt deteksjon, bruk MRM med følgende overganger: 379,2 m/z til 289,2 m/z for 2-AG; og 384,2 m/z til 289,2 m/z for 1-AG-d5.

8. Endocannabinoid kvantifisering i ormer

  1. Bruk deuterert interne standard 1-AG-d5 og Beregn topp området prosenter av analytt til den interne standarden.
  2. Bruk følgende overganger: 384,2 m/z til 287,2 m/z for 2-AG; og 379,2 m/z til 287,2 m/z for 1-AG-d5.
  3. Beregn konsentrasjonen av endogene 2-AG ved å sammenligne til toppen området prosenter av deuterert standard ved hjelp av konsentrasjonen verdien av standarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En isotopically merket analog ble med hell syntetisert fra kommersielt tilgjengelige d8-glyserol og arachidonic syre ved hjelp av en 3-trinns syntetisk metode (figur 2, Figur 3). Disse trinnene er enkle og krever ikke avansert utstyr, spesielt kontrollerte forhold eller kostbare reagenser. Således, denne metoden er robust og kanskje være med hell utbygget å syntetisere monoacylglycerides inneholder annerledes fatty syren.

1-AG-d5 ble strukturelt karakterisert ved hjelp av kjernefysiske magnetiske spektroskopi. 1 den andre H NMR viste den karakteristiske multiplet ved 5,44 ppm til 4,93 ppm, som integrerer for de åtte vinyl protoner av arachidonoyl kjeden og Triplet på 2,40 ppm, tilsvarende de to protoner av Alpha posisjon til karbonyl gruppen. I 2D NMR, det er også mulig å se en 2,9 ppm til 2,7 ppm multiplet overdras til de fem deuterium av glyserol delen.

Den kjemisk syntetisert 1-AG-d5 ble brukt som en intern standard i C. elegans prøver. Standarden ble lagt til prøvene før ekstraksjon deretter ekstrahert med den endogene lipider, ved hjelp av en grei metode tilpasset fra Folch24. Denne endrede metoden gir en høy utvinnings verdi av standarden, som vist ved HPLC kvantifisering.

Metoden ble optimalisert ved hjelp av overganger 1) 384,2 m/z til 287,2 m/z for 2-AG og 2) 379,2 m/z til 287,2 m/z for 1-AG-d5, der glyserol molekyler er tapt (Figur 4). Grensene for påvisning (LOD) og kvantifisering (LOQ) ble beregnet for standarden ved hjelp av en kalibrering kurve, noe som resulterer i verdier av 5 ppb og 16,6 ppb, henholdsvis. Oppbevaringstiden for standarden var 6,8 min.

2-AG endogene fra C. elegans prøvene ble oppdaget og kvantifisert av isotopanrikning fortynning med kjemisk syntetisert 1-AG-d5 ved hjelp av HPLC-MS/MS (figur 5).

Siden den opprinnelige konsentrasjonen av deuterert standarder i prøver 1 og 3 var hver 1 000 ppb, fra toppen området forholdet var det mulig å beregne endogene konsentrasjonen av 2-AG på 340 ppb for prøven 1 og 360 ppm for sample 3, gir et gjennomsnitt på 350 ppm ( Tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Sammendrag av syntese, orm prøvetaking og kvantifisering. For å oppnå vellykket kvantifisering av endogene 2-AG, var det nødvendig å syntetisere sin deuterert analoge ved hjelp av en tre-trinns sekvens. Etterpå ble det lagt til ormen prøver, ekstrahert, og analysert av HPLC-MS/MS. brukes som en intern standard, syntetisk 1-AG-d5 var verktøyet brukes til å kvantifisere den endogene metabolitten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: syntetisk ordning for å skaffe 1-AG-d5. En masse av 10 mg av deuterert analoge ble innhentet ved hjelp av tre-trinns metode som involverer 1) beskyttelse av glyserol-d8, 2) acylering med arachidonic syre, og 3) deprotection. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kjemisk struktur i isotopically merket 2-AG analog. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Utvalgte fragmentations for kvantifisering av 1-AG-d5 og 2-AG. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: HPLC kromatogrammene for 1-AG-d5 og 1-AG som rene standarder og interne standarder i en orm prøve. Det var mulig å analysere oppbevaring ganger og se at 1) ormen synes ikke å ha endogene 1-AG og 2) det ville bare ha 2-AG, men standard 1-AG-d5 vil fortsatt fungere som en god analytisk standard for kvantifisering av isotopanrikning fortynning. Overgangene som ble brukt var: 384,2 m/z til 287,2 m/z for 2-AG, og 379,2 m/z til 287,2 m/z for 1-AG-d5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1-AG-d5 2-AG Forhold (2-AG/1-AG-d5)
Eksempel 1 71964,74 210616,08 0,34
Eksempel 3 74311,36 205648,43 0,36

Tabell 1: topp område forhold for deuterert standard og endogene 2-AG. Forholdene ble beregnet som en kvotienten mellom de største områdene av 2-AG og 1-AG-d5, henholdsvis for to isolerte prøver, både med deuterert standard lagt før ekstraksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endocannabinoids er en klasse av lipider som har vært innblandet i regulering av dauer dannelse i C. elegans7. Mer spesifikt, er syntesen av flerumettede fettsyrer (Fuf) viktig for kolesterol handel og den reproduktive utviklingen av ormer. Det er avslørt her at 2-AG, en arachidonic syre som inneholder endocannabinoid, er ansvarlig for restituting dauer Larven til normal syklus i ormer som har nedsatt kolesterol metabolisme7.

Gitt den nylig oppdagede betydningen av 2-AG i styrking av kolesterol handel og andre biologiske prosesser og hvor lite er kjent om hvordan lipider påvirke denne prosessen, en pålitelig deteksjon metode for denne endocannabinoid er nødvendig. Den vellykkede utviklingen av denne enkle og robuste syntetiske metoden for å få deuterert analoge 1-AG-d5 er et viktig trinn i denne protokollen.

De fleste av de rapporterte metodene for å kvantifisere monoacylglycerols involverer bruk av kommersielt tilgjengelige analytiske standarder, som vanligvis er dyre og ustabile under vanlige lagringsforhold. Dette gjør dem upraktisk for forskere som krever større mengder av standarder og ferske aksjer. De er også utilgjengelig for lavere budsjett laboratorier. Men overvinner denne metoden denne hindringen ved å foreslå syntese av standarden ved hjelp av mer tilgjengelig Start materialer.

Det er også bemerkelsesverdig at i motsetning til andre rapporterte metoder (som bruker deuterert analytiske standarder av 2-erstattet monoacylglycerols som lider acyl-migrasjon under mange forhold, slik at to kromatografiske topper er sett og påvirke den relative kvantifisering av isotopanrikning fortynning25), denne metoden effektivt bruker en 1-erstattet deuterert analytisk standard, som er en enkelt isomer og gjennomgår ikke acyl-migrasjon.

Den syntetiske metoden er enkel og krever ingen sofistikerte forhold, noe som gjør den ideell for ethvert laboratorium som har minimalt med utstyr, budsjett og tilgang til reaktantene. Det er også en enkel teknikk som kan brukes av enhver forsker som arbeider i felten, uten behov for spesiell opplæring i Organisk syntese. Ormen prøven preparatet er den konvensjonelle metoden, uten ytterligere komplikasjoner. Til slutt, lipid utvinning metode for å få den endelige prøvene er en modifikasjon fra Folch ' s protokoll24 som gjør det mulig for bedre utvinning verdier, siden det ikke krever kromatografiske kolonnen rensing.

Det kritiske trinnet er å sikre at prøven forberedelse og lipid ekstraksjon er utført tilstrekkelig for å oppnå god og sporbar utvinning av standarden. Det er også viktig å 1) produsere ferske lager løsninger månedlig for å opprettholde forholdene i standard og 2) sjekk av NMR-spektroskopi eller LC-MS at standarden er fortsatt ren og har ikke gjennomgått oksidasjon eller degradering. Den eneste begrensningen av denne teknikken er avhengig av sin ekspansjon til andre studier som kan ha endogene 2-AG konsentrasjoner lavere enn de presenterte LOQ. I dette tilfellet bør metoden endres for å sikre at konsentrasjonen faller mellom grensene.

I tilfelle av svikt under protokollen der 1) er det ingen synlige kromatografiske signal av standard eller 2) utvinningen verdien av standarden etter ekstraksjon er lavere enn forventet, anbefales det å gjenta prøven forberedelse og lipid utvinning. Siden den syntetiske ruten innebærer syntese av en beskyttet deuterert glyserol byggekloss som er endelig acylated med arachidonic syre i det siste trinnet, kan denne metoden utvides til syntesen av deuterert standarder for andre monoacylglycerols, diacylglicerols, fosfolipider og strukturelt beslektede metabolitter.

Oppsummert denne nye prosedyren beskriver en grei og reproduserbar metode for å oppdage og kvantifisere 2-AG, som vil bidra til å ta opp noen av de ubesvarte spørsmål om rollen til denne endocannabinoid i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend fra Agencia Nacional de Promoción Científica y tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., GP og B.H.C. er stipendiater fra CONICET. D.d.M. og GRL er medlemmer av forsknings karrieren til CONICET. Vi er takknemlige til Gonzalo Lamberto (INMET) for LC-MS/MS analyse og nyttig diskusjon. Video opptak og redigering har blitt gjort av Ramiro Ortega og María Soledad Casasola fra Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
  3. Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
  6. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
  7. Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
  8. Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
  9. Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
  10. Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
  11. Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
  12. Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
  13. Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
  14. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
  15. Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
  16. Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
  17. Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
  18. Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
  19. Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
  20. Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
  21. Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
  22. Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
  23. Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).

Tags

Biokjemi endocannabinoids C. elegans syntese deuterert analogs 2-AG Dauer mags HPLC-MS/MS isotopanrikning fortynning kvantifisering
Syntese av en Deuterert standard for kvantifisering av 2-Arachidonoylglycerol i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández de Luco, J., Prez,… More

Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter