Summary
עבודה זו מתארת שיטה חזקה וישירה כדי לזהות ולכמת את האנדוקאנמיאיד 2-ארכאינול (2-AG) ב- C. אלגיה. תקן הניתוח האנליטי הינו מוכן ומשמש לקוונפיקציה של 2-AG על ידי איזונושא דילול וכרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרורינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
עבודה זו מציגה שיטה להכנת תקן אנליטי לניתוח 2-ארכאיקסיקסיל (2-AG) באיכות ובכמת של נוזלים כרומטוגרפיה-אלקטרולינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS). אנדוקנבינואידים נשמרים מתווכים השומנים המסדירים תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים. ב C. אלגיה, 2-AG נמצא בעלי תפקידים שונים, כולל אפנון של היווצרות דאואר ומטבוליזם הכולסטרול. דו ח זה מתאר שיטה להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של התקנים החיצוניים הדרושים לקוונפיקציה של 2-AG. ההליך לסינתזה של התקן הוא פשוט יכול להתבצע בכל מעבדה, ללא צורך מומחיות סינתזה אורגנית או ציוד מיוחד. בנוסף, מתוארת שינוי של השיטה של Folch לחלץ את התקן הדאומנטי מתרבות C. אלגיה . בסופו של דבר, שיטה כמותית ואנליטית לזהות 2-AG באמצעות isotopically יציבה התווית אנלוגי 1-AG-d5 מתואר, אשר מספק תוצאות אמינות לרוץ מהיר כרומאטוגרפי. הנוהל הוא שימושי עבור לימוד תפקידים מרובים של 2-AG ב C. אלגיה בעוד להיות ישימה למחקרים אחרים של מטבוליטים באורגניזמים שונים.
Introduction
אנדוקאנבינואידים לווסת תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים הם שמרו מגשרים השומנים1. הגילוי הראשון והטוב ביותר המאופיין באנדוקאנבינואידים הם אנאנדאמיד (ארכאדונאוליטהלתנולאמיד, איה) ו-2-ארכאיקסיקסיל גליצרול (2-AG). אנדוקאנבינואידים לשחק תפקידים קריטיים רבים, כולל אלה המעורבים במערכות תגמול המוח, כמו גם התמכרות לסמים, זיכרון, מצב רוח, ותהליכים מטבוליים2. איה ו-2-AG הם רק מסונתז בעת הצורך ויש להם חיים קצרים משתרע, והם מושפל דרך חלבון התחבורה ספיגה חוזרת הידרוליזה3.
השימוש במודלים של בעלי חיים כמו האלמרנים (C. אלגיה) הפך חשוב ללמוד את המגוון הגדול של תהליכים ביולוגיים כולל אפופטוזיס, איתות תא, מחזור התא, קוטביות התא, תקנה גנים, חילוף חומרים, הזדקנות, וקביעת מין4,5. בנוסף, הג הוא מודל מצוין לחקר התפקידים הפיזיולוגיים של חומצות שומן רב בלתי רוויות (pufas). איה זוהתה ב -C. אלגיה ומצטמצמת תחת הגבלת תזונה6. מחסור זה מרחיב את תוחלת החיים של נמטודות באמצעות מנגנון הגבלה תזונתיים שניתן לדכא על ידי תוספת עם אנדוקאנביאיד. לאחרונה, נתגלה כי 2-AG ו-איה משחקים תפקידים בסיסיים בוויסות סחר בכולסטרול בג7. חשוב מכך, נקבע כי התוספת עם אקסוגני 2-AG יכול להציל את מעצר דאואר, אשר נגרמת על ידי סחר הכולסטרול לקוי של נימן לבחור סוג C1 C. אלגיה מוטציות.
כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי 2-AG עם סחר בכולסטרול ותהליכים ביולוגיים אחרים ב נמטודות (כלומר, איתות monoaminergic, נוקטונזיה ו תנועה), זה חיוני לחקור את המטסוגזה אנדודוגלי ואיך זה מושפע בתנאים סביבתיים ותזונתיים מסוימים8,9,10,11,12,13. לכן, זה הכרחי לעצב ולמטב את השיטה כדי לזהות ולכמת אנדוגני 2-AG ב C. אלגיה כי הוא פשוט לשימוש עבור מדענים של שדות שונים, במיוחד אלה הלומדים את התנהגותו של nematode ביחס זה . בסדר, אנדוקנביאיד
בשנת 2008, לטונטן ועמיתים לעבודה הצליחו לזהות 2-AG ו -"איה" ב-C. אלגיה באמצעות שיטות אנליטיות LC-MS14. ב 2011, הם הצליחו להרחיב את הטכניקה הזאת לאנדוקנבינואידים אחרים15. העבודה האחרונה הראתה שיטות אנליטיות אחרות אשר הצליחו באיתור וכימות אנדוקנבינואידים ב -C. אלגיה, כולל ספקטרומטר מסה ו-GC-MS16,17,18, והוא חייב דווח גם כי ניתן להרחיב שיטות אנליטיות דומות למודלים אחרים19.
בעבר דיווחו שיטות אנליטיות המשמשות לכימות 2-AG בדגימות ביולוגיות כוללות בדרך כלל את השימוש בתקנים דאוטים הנרכשים מסחרית ודורשים זמינות לרכישה20,21. סטנדרטים אנליטיים רבים עבור כימות LC-MS/MS של אנדוקאנבינואידים הם זמינים מסחרית מספקים שונים. עם זאת, הם יקרים, רגישים, ולהיות תחמוצת לאורך זמן, עקב נוכחות של איגרות חוב כפולות מרובות. הגרסאות השכיחות ביותר של תקנים אלה מבוססים על החומצה הארכידונית של octa-שניוני ומתאימות לקוונפיקציה על ידי דילול האיזוטופ LC-ms/ms14,22. כמו כן, רוב הסטנדרטים הללו מוחלף במיקום 2 של גליצרול, מה שהופך אותם לא יציבים ברוב התנאים מאז הם נוטים הגירה acyl19,23.
כדי להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של הסטנדרטים הללו, שיטה נוחה ופשוטה מוצגת להכנת תקן אנליטי המבוסס על גליצרול-d5. הרצף שמטרתו להכין את התקן המחומש מחייב הליך שלושה שלבים התוצאתו תקן 1-AG-d5, אשר יציב ואינו עובר הגירה acyl (הבעיה העיקרית כאשר מכוון לסנתז 2-monoacylglycerols).
המטרה העיקרית כאן היא להראות שיטה פשוטה ומנויית ללמוד 2-AG ב -C. אלגיה, כולל סינתזה של תקן הניתוח האנליטי, ההכנה והחילוץ של דגימות נמטודות, וניתוח על ידי LC-ms/MS (איור 1 ). הליך סינתטי זה הוא השגה ללא הידע סינתזה אורגני מתוחכם או ציוד מיוחד, מה שהופך אותו מתאים למדענים מתחומים שונים אשר לומדים את ההתנהגות C. אלגיה תחת השפעה אנדוקנביאיד. השיטה גם ניתנת להרחבה לדגמי מחקר אחרים, מה שהופך אותו לשימושי עבור מטרות שונות. התקן, שהוכן כפי שדווח כאן, הוחל בהצלחה לפתח שיטת כרומטוגרפית מהירה ואמינה המאפשרת זיהוי וכימות יעילים של 2-AG באופן שאינו מתפקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.1-AG-d5 הכנה
הערה: לקבלת 1-AG-d5 כסטנדרט פנימי שניוני עבור כימות הכמת, בצע את הפרוטוקול כמפורט להלן.
- הגנה דיפרנציאלית
- רק כדי להגן על האלכוהול הראשי, ראשית להוסיף 38 מ"ג של גליצרול-d8 כדי צינור התגובה 10 מ ל באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף מערבב מגנטי.
- הוסף 5 מ ל של diלורוקומאן (DCM) באמצעות 5 מ"ל מזרק המילטון, ולמלא את הצינור עם N2 יבש כדי להניב אווירה אינרטי.
- להכין אמבטיה באמצעות הבקבוקון Dewar רדוד מלא אצטט אתיל מזוקקים.
- להתאים את צינור התגובה הרמטית סגור בתוך האמבטיה ומצננים אותו על ידי הוספת איטית N2 נוזלי כדי אצטט אתיל עד הממס הוא קפוא.
התראה: הנוזל מצטמצם בפראות בטמפרטורת החדר (RT) ועלול לגרום לכוויות חמורות בעת יצירת קשר עם העיניים והעור. - הוסף 54 מ"ג של מקולחות אנפני המים באמצעות מזרק המילטון.
התראה: הקולדין הוא נדיף ויש לו ריח חזק מאוד לא נעים. - להוסיף 70 mg של tert-בוטילימתיל silyl כלוריד ולערבב את הפתרון כולו עבור 3 h ב-78 ° c על שטירר מגנטי.
- לאחר 3 שעות, להשאיר את התגובה לחמם ב RT ולהמשיך לערבב עבור 12 h נוספים.
- הוסף 2 מ ל של מלח כדי להרוות את התגובה.
- לחלץ את הפתרון 3x עם 2 מ ל של דיכלורומתאן מזוקקים באמצעות משפך הפרדה, שמירת תמצית אורגנית בכל פעם.
- לשלב את שלושת תמציות אורגני ולייבש אותם על נתרן גופרתי.
- מתנדפים את הדילורומתאן תחת לחץ מופחת במאייד רוטרי ואקום בזהירות כדי למנוע תחזיות ממיסים.
- לטהר את התערובת גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור באמצעות סיליקה ג'ל כשלב נייח ו 10% הגדלת הקסאן/אתיל אצטט הדרגתי, החל 100% הקסאן וגימור עם 100% אתיל אצטט.
- לשלב את השברים המכילים את המוצר ולהסיר את הממס תחת לחץ מופחת במיאייד רוטרי ואקום כדי להשיג את הטהור 1-O, 3-O-bis-(TBDMS) גליצרול-d5 כנוזל חסר צבע.
- אסטפיקציה
- הוסף 10 מ"ג של 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-גליצרול-d5 (בעבר מסונתז) לצינור התגובה של 10 מ ל באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף שטירר מגנטי.
- הוסיפו 2 מ ל של דיכלורומתאן באמצעות 5 מ"ל מזרק המילטון, ומלאו את הצינור עם N2 יבש כדי להניב אווירה אינרטי.
- מצננים את הפתרון ל -0 ° צ' באמצעות אמבט קרח.
- הוסף 36 מ"ג של חומצה ארכידונית באמצעות מיקרופיפטה רב עוצמה מתכווננת ומערבבים.
- הוסיפו 15 מ ג של 4-דימתלימימיולימיתדין ומערבבים.
- להוסיף 15 מ"ג של N, N'-dillllllllilla באמצעות מיקרופיפטה רב עוצמה מתכווננת ומערבבים.
- תנו לתערובת להגיב ב -0 ° c ל -3 שעות.
- לאחר 3 שעות, להשאיר את התגובה לחמם ב RT ולהמשיך לערבב עבור 12 h נוספים.
- הוסף 2 מ ל של מים כדי להרוות את התגובה.
- לחלץ את הפתרון האורגני 3x עם 2 מ ל של דיכלורומתאן מזוקקים (dcm) באמצעות משפך הפרדה.
- מניחים את שלושת תמציות אורגני באותה צינורית ולייבש אותם על נתרן גופרתי.
- מתנדפים את הדילורומתאן תחת לחץ מופחת במאייד רוטרי ואקום בזהירות כדי למנוע תחזיות ממיסים.
- לטהר את התערובת גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור באמצעות סיליקה ג'ל כשלב נייח ו 10% הגדלת הקסאן/אתיל אצטט הדרגתי, החל מ 100% הקסאן וגימור עם 50% הקסאן/50% אתיל אצטט.
- לשלב את השברים המכילים את המוצר ולהסיר את הממס תחת לחץ מופחת במיאייד רוטרי ואקום כדי להשיג את טהור 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 כנוזל צהבהב.
- Deprotection
- הוסף 15 מ"ג של 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 (בעבר מסונתז) לצינור התגובה של 10 מ ל באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף שטירר מגנטי.
- הוסף 2 מ ל של הברז THF באמצעות 5 מ"ל מזרק המילטון, ולמלא את הצינור עם N2 יבש כדי להניב אווירה אינרטי.
- מצננים את הפתרון ל -0 ° צ' באמצעות אמבט קרח.
- הוסף 150 μL הdropwise של 1 M tetrabutyלאממוניום הפתרון פלואוריד באמצעות מזרק המילטון.
- תן את התגובה חם RT ומערבבים עבור 1 h.
- לאחר 1 h, להוסיף 2 מ ל של מים כדי להרוות את התגובה.
- לחלץ את הפתרון 3x עם 2 מ ל של דילורומזופה מזוקקים באמצעות משפך הפרדה.
- לשלב את שלושת תמציות אורגני ולייבש אותם על נתרן גופרתי.
- מתנדפים את הדילורומתאן תחת לחץ מופחת במאייד רוטרי ואקום כדי להשיג את הטהור 1-AG-d5 כנוזל צהבהב.
- הצג את כל התגובות על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה שבוצעה על סיליקה ג'ל 60 F254 מצופה מראש גיליונות אלומיניום. דמיינו את הלהקות תחת מנורת UV 254 ננומטר לאחר הצביעת עם פתרון ethanolic של 4-אנאיזולדהיד.
2. הכנת מניות סטנדרטיות ופתרונות מדידה
- לפזר 1 מ"ג של תקן פנימי 1-AG-d5 ב 1 מ ל של acn ו sonicate עבור 1 דקות כדי לקבל את הפתרון 1,000 ppm מניות סטנדרטי.
- כדי להכין את הפתרון 1,000 ppb המשמש לכמת בתולעים, ראשית להכין פתרון 10 ppm: לקחת 10 μL של פתרון המניה באמצעות מזרק המילטון ולדלל אותו לנפח הסופי של 1 mL על ידי הוספת 990 μL של ACN.
- קח 100 μL מהפתרון המיוצר בשלב 2.2 באמצעות מזרק המילטון, ולדלל אותו לנפח הסופי של 1 מ ל על ידי הוספת 900 μL של ACN כדי להשיג את הפתרון 1,000 ppb המשמש את כימות.
- Sonicate עבור 1 דקות בין כל שלב כדי להבטיח פתרון מוחלט. אחסן את הפתרונות ב-78 ° צ' כדי לשמור על הריכוזים והשלמות של הסטנדרטים. לאחר הפתרון הסטנדרטי משמש, זרימת כמה חנקן לפני סגירת המבחנה כדי למנוע חמצון.
3. צמיחה ואחזקה של ס. אלגיה
הערה: הזרע בינונית צמיחה נמטודות (ngm) אגר צלחות עם E. coli OP50 והפיץ את התולעים על צלחות אלה.
- מערבבים 3 גרם של הנאגל עם 17 גרם של אגר.
- להוסיף 2.5 g של peptone, ולאחר מכן להוסיף 975 mL של H2O.
- אוטוקלב עבור 50 דקות, ולאחר מכן לצנן את הבקבוקון 55 ° c.
- מערבבים את הפרטים הבאים: 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ ל 1 m MgSO4, 25 מ"ל של 1 m KH2פו4 מאגר (כל אלה היו בעבר autoclaved), ו 1 mL של 5 mg/mL כולסטרול באתנול.
- תוך שמירה על סביבה סטרילית, לחלק את הפתרון NGM לתוך 60 מ"מ צלחות פטרי, מילוי לוחיות שני שלישים של נפח שלהם. אחסן את הצלחות ב -4 ° c.
- רצף את התרבות החיידק של E. coli מ-80 ° צ' גליצרול מלאי על לוחית LB אגר. תנו לו לגדול על הצלחת לילה ב 37 ° c.
- לאסוף מושבה אחת כדי לחסן 100 mL של הנוזל LB לילה ב 37 ° c עם עצבנות.
הערה: אין צורך לבדוק את מנת היתר כי זן זה יכול להגיע לשלב נייח בזמן הזה. - הסר את צלחות NGM המאוחסנים, להסיר את העפעפיים במכסה הזרימה למינארי, ולהשאיר פתוח כדי לאפשר אידוי של לחות עודפת מן הצלחות.
- לאחר הצלחות מיובשות, להשתמש בצינורות פסטר כדי להוסיף 100 μL של OP50 E. coli למרכז הצלחת מבלי להתפשט.
- לעזוב את OP50 E. coli הדשא לצמוח בלילה ב RT או ב 37 ° צ' עבור 8 h.
- הוסף את העוברים הרצויים תולעת מספר המתקבלים על ידי היפוכלוריט הטיפול או "הלבנה" (סעיף 4).
הערה: לצנן את הצלחות כדי RT לפני תוספת של תולעים.
4. שיטת הלבנה לסנכרון מתרבויות האלאנים
- הזרע תולעים קטע על 6 ס"מ לוחיות NGM.
- להשאיר את התולעים גדל במשך 2-3 ימים כדי להשיג מספר מספיק של ביצים מבוגרים gravid על הצלחת.
- ברגע שיש מספיק ביצים/מבוגרים, יוצקים 5 מ ל של M9 על הצלחת.
- העבר את התולעים לצינורית צנטריפוגה של 15 מ ל באמצעות פיפטה זכוכית.
- צנטריפוגה את הצינור עבור 2 דקות ב 2,000 x g ו הגלולה תולעים.
- מיניקה את רוב M9, הימנעות הפרעה של הגלולה תולעת.
- הוסף 3 מ ל של הלבנת פתרון (2:1:1 יחס של NaOH: NaOCl: H2O).
- היפוך בעדינות כדי לערבב את הפתרון עבור 5 דקות או עד שמספר התולעים בוגרים שלמים פוחת.
התראה: אין להלבין במשך יותר מ-5 דקות. - צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 2,000 x ו יניקה רוב הפתרון הלבנת מבלי להפריע את הגלולה תולעת.
- הוסיפו 15 מ ל של M9 וערבבו היטב.
- צנטריפוגה שוב ב 2000 x g עבור 1 דקות.
- מיניקה את רוב הM9. מבלי להפריע לגלולה התולעת
- חזור על שלבים 4.10-4.12 פעם אחת או שתיים נוספות.
- הוסף 5 מ ל של M9 טריים ומתפרעים.
- תן לביצים לבקוע לילה. עם רוק עדין
5. הכנה לדגימת תולעים
- תן את העוברים N2 מושגת על ידי הלבנת הליך הM9 לילה במאגר (5 מ ל בצינור צנטריפוגה 15 מ ל) ב -20 ° c.
- הקציר L1s מסונכרן על-ידי תפרידו השפופרת עבור 2 דקות ב 2,000 x g.
- לשטוף את התולעים עם M9 מאגר 1x, ולאחר מכן לכמת את מספר התולעים חי L1.
- זרע כ 10,000 תולעים לתוך לוחות NGM (10 ס"מ קוטר) עם 1 מ ל של OP50 E. coli (מיובש בעבר).
- מודטה את הצלחות עבור 48 h ב 20 ° צ' עד תולעים להגיע לשלב L4.
- לקצור את התולעים באמצעות מאגר M9 קר בתוך 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה, לשטוף אותם 1x, ולאחר מכן להעביר אותם לצינור 1.5 mL.
- גלולה את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 1 דקות, לחסל את רוב supernatant, לטבול את הצינורות בחנקן נוזלי, ולאחסן ב-80 ° c.
6. הוצאת ליפיד
- הפשרת כ 100 μL של כדורי תולעת קפואים השייכים N2 על הקרח, להוסיף 1.3 mL של מתנול, ו sonicate המדגם עבור 4 דקות.
- הוסף 2.6 mL של כלורופורם, ו 1.3 mL של 0.5 M KCl/0.08 M H3PO4 ליחס הסופי של 1:2:1, 1,000 ppb של תקן פנימי 1-AG-d5, ו בוטיק הידרוקסינן כסוכן נוגד חמצון בריכוז הסופי של 50 μg/mL.
- מערבולת הדגימות עבור 1 דקות ו sonicate באמבט מים אולטרה סאונד עבור 15 דקות על הקרח.
- מערבולת הדגימות 2x עבור 1 דקות ו צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 2,000 x g כדי לגרום הפרדת השלב.
- לאסוף את השלב התחתון ולאסוף אותו צינור נקי, יבש אותו תחת חנקן, ולהשעות מחדש את שאריות מוצק 100 μL של ACN.
7. אנליזה אנדוקנביאיד על-ידי בדיקות-MS/MS
- השתמש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר משולש ESI 4 פי ארבעה המסה כדי לזהות ולכמת 2-AG מדגימות נמטודות.
- השתמש ביחס הבא לקבלת הוראות ביצוע שלב היפוך: מ 0.0-0.5 min H2o:acn (40:60), 0.5-6.5 דקות2o:acn (40:60) ל (25:75), 6.5-7.5 min h2o:acn (25:75), 7.5-8.0 min h2o:acn (25:75) עד (40:60), 8.0-12.0 min h2O: ACN (40:60).
- שמור על טמפרטורת העמודה ב-40 ° צ' והגדר את טמפרטורת המגש של הדגם האוטומטי ל-10 ° c.
- הגדר את תנאי האינון הבאים: מצב יון חיובי; ייבוש גז (N2) טמפרטורה = 300 ° c; ייבוש הזרמת גז שיעור = 10 L/דקות; לחץ בולווי = 10 UA; וכובע. מתח = 4 kV.
- לאיתור האנליטה, השתמש ב-MRM עם המעברים הבאים: 379.2 m/z ל-289.2 m/z עבור 2-AG; ו 384.2 m/z כדי 289.2 m/z עבור 1-AG-d5.
8. כימות אנקנביאיד בתולעים
- השתמש בתקן פנימי דאוט 1-AG-d5 ולחשב את יחסי האזור השיא של האנליטה לתקן הפנימי.
- השתמש במעברים הבאים: 384.2 m/z כדי 287.2 m/z עבור 2-AG; ו 379.2 m/z כדי 287.2 m/z עבור 1-AG-d5.
- לחשב את הריכוז של האנדודוגני 2-AG על ידי השוואת היחס לאזור השיא של תקן שניוני באמצעות ערך הריכוז של התקן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנלוגי isotopically שכותרתו היה בהצלחה מסונתז מ-d זמין מסחרית של8-גליצרול וחומצה ארכידונית באמצעות שיטת 3-צעד סינתטי (איור 2, איור 3). שלבים אלה הם פשוטים ואינם דורשים ציוד מתוחכם, תנאים מבוקרים במיוחד, או ריאגנטים יקר. לכן, שיטה זו איתנה וניתן להאריך בהצלחה לסנתז מונוציליגליליפידים המכילים חומצות שומן שונות.
1-AG-d5 היה מאופיין מבנית באמצעות ספקטרוסקופיה מגנטית גרעינית. מיכל בן H NMR הראה את המכפיל האופייני בשעה 5.44 עמודים לדקה ל 4.93 ppm, אשר משתלב עבור שמונה פרוטונים ויניל של שרשרת הארכידונוקסיל ושלישיה ב 2.40 ppm, המתאים שני פרוטונים של עמדת אלפא לקבוצה קרבונל. ב 2ד nmr, אפשר גם לראות 2.9 עמודים לדקה כדי 2.7 לדפים לדקה הכהמתן לתוך חמש דאוטריום של החלק הגליצרול.
מסונתז כימית 1-AG-d5 שימש כסטנדרט פנימי בדגימות של C. אלגיה . התקן נוסף לדגימות לפני החילוץ לאחר מכן חילוץ עם שומנים אנדוגניים, באמצעות שיטה ישירה המותאם Folch24. שיטה זו שהשתנתה מספקת ערך שחזור גבוה של התקן, כפי שמוצג על-ידי כימות הקוונפיקציה.
השיטה היתה ממוטבת באמצעות מעברים 1) 384.2 m/z כדי 287.2 m/z עבור 2-AG ו 2) 379.2 m/z כדי 287.2 m/z עבור 1-AG-d5, שבו מולקולות גליצרול יאבדו (איור 4). גבולות הזיהוי (לוד) והקוונפיקציה (LOQ) חושבו לתקן באמצעות עקומת כיול, וכתוצאה מכך ערכים של 5 ppb ו 16.6 ppb, בהתאמה. זמן ההחזקה עבור התקן היה 6.8 דקות.
2-AG אנדוגני מדגימות ה -C התגלתה בהצלחה וככמת באמצעות דילול איזונושא עם מסונתז כימית 1-AG-d5 באמצעות בדיקות-Ms/ms (איור 5).
מאז הריכוזים המקוריים של הסטנדרטים הדאוניים בדגימות 1 ו -3 היו כל 1,000 ppb, מן היחס באזור השיא ניתן היה לחשב את ריכוז אנסוגני של 2-AG ב 340 ppb עבור מדגם 1 ו 360 ppm עבור מדגם 3, מניב ממוצע של 350 ppm ( טבלה 1).
איור 1: תקציר של סינתזה, דגימת תולעים וכימות. כדי להשיג כימות מוצלחת של האנדודוגני 2-AG, היה צורך לסנתז אנלוגי הדאונטי באמצעות רצף של שלושה שלבים. לאחר מכן, הוא התווסף דגימות תולעים, הופק, ונותח על ידי בדיקות-MS/MS. משמש כסטנדרט פנימי, סינתטי של 1-AG-d5 היה הכלי המשמש לכמת את המטדוגני אנדולייט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מזימה סינתטית להשגת 1-AG-d5. מסה של 10 מ ג של אנלוגי שטרם הושגה באמצעות שיטת שלושה שלבים מעורבים 1) הגנה על הגליצרול-d8, 2) אכלציה עם חומצה ארכידונית, ו 3) deprotection. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: המבנה הכימי של isotopically מתויג 2-AG אנלוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הfragmentations שנבחרו לכימות של 1-ag-d 5 ו-2-ag. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: כרומטוגרמות ל-1-AG-d5 ו-1-ag כתקנים טהורים וסטנדרטים פנימיים בדגימת תולעים. ניתן היה לנתח את זמני השמירה ולראות כי 1) התולעת מופיעה לא יש אנדודוגני 1-AG ו 2) זה היה רק 2-AG, אבל תקן 1-AG-d5 עדיין לעבוד כסטנדרט אנליטי טוב עבור כימות על ידי דילול איזונושא. המעברים בהם נעשה שימוש: 384.2 m/z כדי 287.2 m/z עבור 2-AG, ו 379.2 m/z כדי 287.2 m/z עבור 1-AG-d5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| 1-AG-d5 | 2-AG | יחס (2-AG/1-AG-d5) | |
| לדוגמה 1 | 71964.74 | 210616.08 | 0.34 |
| לדוגמה 3 | 74311.36 | 205648.43 | 0.36 |
טבלה 1: יחסי שיא באזור עבור תקן שניוני ואנדודוגני 2-AG. היחס היה מחושב כמנה בין שטחי השיא של 2-AG ו-1-AG-d5, בהתאמה, עבור שתי דגימות מבודדות, שניהם עם תקן שניוני הוסיף לפני החילוץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנדוקנבינואידים הם מחלקה של שומנים כי היו מעורבים בוויסות של היווצרות dauer ב -C. אלגיה7. באופן ספציפי יותר, סינתזה של חומצות שומן רב בלתי רווי (PUFAs) חשוב עבור סחר בכולסטרול ואת התפתחות הרבייה של תולעים. הוא נחשף כאן 2-AG, חומצה ארכידונית המכילה אנדוקאנביאיד, אחראי על restituting הזחל dauer למחזור הרגיל שלה תולעים כי יש ליקויי חילוף החומרים של הכולסטרול7.
לאור החשיבות שהתגלתה לאחרונה של 2-AG בשיפור הסחר בכולסטרול ותהליכים ביולוגיים אחרים וכמה מעט ידוע על איך שומנים להשפיע על תהליך זה, שיטת זיהוי אמין עבור אנדוקאנביאיד זה הוא הכרחי. ההתפתחות המוצלחת של השיטה הסינתטית הפשוטה והאיתנה הזאת להשגת האנלוגי הדאונטי 1-AG-d5 הוא צעד מפתח בפרוטוקול זה.
רוב השיטות שדווחו לכמת monoacylglycerols כרוכים בשימוש בתקנים אנליטיים זמינים מסחרית, אשר בדרך כלל יקר ולא יציב בתנאי אחסון רגיל. זה עושה אותם לא נוח עבור חוקרים הדורשים כמויות גדולות יותר של תקנים ומניות טריות. בנוסף, הן אינן מאפשרות למעבדות זולות יותר. עם זאת, שיטה זו גוברת על מכשול זה על ידי הצעת סינתזה של התקן באמצעות חומרי התחלה נגיש יותר.
זה גם מדהים כי בניגוד שיטות אחרות שדווחו (אשר משתמשים בתקנים אנליטיים ברמה של 2-התחליפי מונוטליגליליולים הסובלים acyl-הגירה בתנאים רבים, כך שתי פסגות כרומטוגרפיים נראים ומשפיעים על יחסי קוונפיקציה על ידי איזונושא דילול25), שיטה זו משתמשת באופן יעיל בתקן אנליטי 1-התחליפי, שהוא איזומד יחיד ולא עובר acyl-הגירה.
השיטה הסינתטית היא פשוטה ואינה דורשת תנאים מתוחכמים, מה שהופך אותו לאידיאלי לכל מעבדה שיש בה ציוד מינימלי, תקציב וגישה למגיבים. זוהי גם טכניקה פשוטה שניתן להשתמש על ידי כל מדען עובד בתחום, ללא צורך הכשרה מיוחדת סינתזה אורגנית. ההכנה לדגימת התולעים היא השיטה המקובלת, ללא סיבוכים נוספים. לבסוף, שיטת החילוץ ליפיד כדי להשיג את הדגימות הסופיות הוא שינוי של הפרוטוקול של folch24 המאפשר ערכים התאוששות טובה יותר, מאז הוא אינו דורש טיהור עמודה כרומטוגרפי.
הצעד הקריטי הוא להבטיח כי ההכנה לדוגמה החילוץ ליפיד מבוצעים כראוי כדי להשיג טוב ולזיהוי התאוששות של התקן. חשוב גם 1) לייצר פתרונות מניות טריים בחודש כדי לשמור על תנאי סטנדרטי 2) לבדוק על ידי NMR-ספקטרוסקופיה או LC-MS כי התקן עדיין טהור ולא עבר חמצון או השפלה. המגבלה היחידה של טכניקה זו מסתמכת על התרחבות שלה למחקרים אחרים שעשויים להיות בעלי ריכוזים אנדוגניים 2-AG נמוך יותר LOQ הציג. במקרה זה, יש לשנות את השיטה כדי להבטיח כי הריכוז נופל בין המגבלות.
במקרה של כשל במהלך הפרוטוקול שבו 1) אין אות כרומוגרפיה גלויה של תקן או 2) ערך השחזור של התקן לאחר החילוץ נמוך מהצפוי, מומלץ לחזור על הכנה לדוגמה הפקת שומנים בדם. מאז התוואי הסינתטי כרוך סינתזה של בניין גליצרול המוגנים מוגן, כי הוא לבסוף באמצעות חומצה ארכידונית בשלב האחרון, שיטה זו ניתן להרחיב את הסינתזה של סטנדרטים שלוניים של מונצילין אחרים, . ומטבוליטים קשורים מבחינה מבנית
לסיכום, הליך חדש זה מתאר שיטה פשוטה ומיועלת לגילוי וכימות של 2-AG, אשר יסייע לטפל בכמה שאלות שלא נענו לגבי התפקיד של האנדוקנביאיד הזה ב -C. אלגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק מחקר של הסוכנות הלאומי Tecnológica y של המחקר (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., פ, ו B.H.C. הם ברנשים מ CONICET. D.d.M. ו G.R.L. הם חברי הקריירה המחקר של CONICET. אנו מודים לגונזלו לאמברטו (INMET) עבור ניתוח LC-MS/MS ודיון מועיל. הירי והעריכה של וידאו נעשה על ידי רמירו אורטגה ומריה סולאסולה Casasola מכיוון הבימוי של האופרה דה לה סינסיה, Faculøy דה Ciencia לראנוטיקה הביננייונאלס, אוניברסיהנאסיונאל דה רוסאריו ברוסאריו, ארגנטינה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M.
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
