Summary
Dit werk beschrijft een robuuste en ongecompliceerde methode om de endocannabinoïde 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegansop te sporen en te kwantificeren. Een analytische HDO standaard ons voorbereid en gebruikt voor de kwantificering van 2-AG door isotopen verdunning en vloeistofchromatografie-elektro spray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Dit werk presenteert een methode om een analytische standaard te bereiden voor het analyseren van 2-Arachidonoyl glycerol (2-AG) kwalitatief en kwantitatief door vloeistofchromatografie-elektro spray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoïden zijn gecondengeerde lipide-bemiddel kers die meerdere biologische processen in verschillende organismen reguleren. In C. elegans, 2-AG is gebleken dat het bezitten van verschillende rollen, met inbegrip van de modulatie van Dauer vorming en cholesterol metabolisme. Dit verslag beschrijft een methode om de moeilijkheden te overwinnen die gepaard gaan met de kosten en stabiliteit van HDO normen die voor 2-AG kwantificering vereist zijn. De procedure voor de synthese van de standaard is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium, zonder de noodzaak voor organische synthese expertise of speciale apparatuur. Daarnaast wordt een wijziging van de methode van Folch om de HDO standaard uit de C. elegans -cultuur te extraheren beschreven. Tot slot wordt een kwantitatieve en analytische methode beschreven voor het detecteren van 2-AG met behulp van de stabiele isotopisch gelabelde analoge 1-AG-d5 , die betrouwbare resultaten oplevert in een snelle chromatografische uitvoering. De procedure is nuttig voor het bestuderen van de meerdere rollen van 2-AG in C. elegans terwijl ook van toepassing op andere studies van metabolieten in verschillende organismen.
Introduction
Endocannabinoïden reguleren meerdere biologische processen in een verscheidenheid van organismen en worden bewaard lipide-mediatoren1. De eerste ontdekte en meest goed gekarakteriseerde endocannabinoïden zijn anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) en 2-Arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoïden spelen vele kritische rollen, met inbegrip van degenen die betrokken zijn bij hersenen beloning systemen, evenals drugsverslaving, geheugen, stemming, en metabole processen2. AEA en 2-AG zijn alleen gesynthetiseerd wanneer nodig en hebben een korte levensduur, en ze worden afgebroken door transport eiwit heropname en hydrolyse3.
Het gebruik van diermodellen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans) is belangrijk geworden om te bestuderen van de grote verscheidenheid van biologische processen, met inbegrip van apoptosis, cel signalering, celcyclus, celpolariteit, genregulatie, metabolisme, veroudering, en Geslachtsbepaling4,5. Daarnaast is C. elegans een uitstekend model voor het bestuderen van de fysiologische rollen van meervoudig onverzadigde vetzuren (pufas). AEA is geïdentificeerd in C. elegans en wordt verlaagd onder dieet beperking6. Dit tekort verlengt de levensduur van de nematode door middel van een dieet restrictie mechanisme dat kan worden onderdrukt door suppletie met de endocannabinoïde. Onlangs werd ontdekt dat 2-AG en AEA spelen fundamentele rollen in de regulering van de cholesterol handel in C. elegans7. Nog belangrijker, er werd vastgesteld dat suppletie met exogene 2-AG Dauer arrestatie kan redden, die wordt veroorzaakt door de verminderde cholesterol handel in Niemann-Pick type C1 C. elegans mutanten.
Om een beter begrip van 2-AG de relatie met cholesterol handel en andere biologische processen in de nematode (dat wil zeggen, monoaminerge signalering, nociception en motoriek) te krijgen, is het cruciaal om deze endogene metaboliet te bestuderen en hoe het is beïnvloed onder bepaalde milieu-en dieet omstandigheden8,9,10,11,12,13. Daarom is het noodzakelijk om te ontwerpen en optimaliseren van een methode voor het opsporen en kwantificeren van endogene 2-AG in C. elegans dat is eenvoudig te gebruiken voor wetenschappers van verschillende gebieden, vooral degenen die het gedrag van de nematode in verband met deze bestuderen endocannabinoïde.
In 2008 slaagden Lethonen en collega's erin om 2-AG en AEA in C. elegans te identificeren met behulp van LC-MS analytische methoden14. In 2011 slaagden ze erin om deze techniek uit te breiden naar andere endocannabinoïden15. Meer recent werk toont andere analytische methoden die succesvol zijn geweest bij het opsporen en kwantificeren van endocannabinoïden in C. elegans, waaronder massaspectrometrie en GC-MS16,17,18, en het heeft ook is gemeld dat soortgelijke analytische methoden kunnen worden uitgebreid naar andere modellen19.
Eerder gemelde analysemethoden voor het kwantificeren van 2-AG in biologische monsters betreffen meestal het gebruik van HDO normen die commercieel worden verworven en die beschikbaar moeten zijn voor de aankoop20,21. Veel analytische normen voor LC-MS/MS kwantificering van endocannabinoïden zijn commercieel verkrijgbaar bij verschillende aanbieders. Niettemin, ze zijn duur, zijn gevoelig, en worden geoxideerd na verloop van tijd, als gevolg van de aanwezigheid van meerdere dubbele obligaties. De meest voorkomende versies van deze normen zijn gebaseerd op het OCTA-deuterated arachidonzuur en zijn geschikt voor kwantificering door isotoop verdunning LC-MS/MS14,22. Ook, de meeste van deze normen worden vervangen in positie 2 van de glycerol, waardoor ze instabiel onder de meeste omstandigheden, omdat ze gevoelig voor acyl migratie zijn19,23.
Om de moeilijkheden in verband met de kosten en stabiliteit van deze HDO normen te overwinnen, wordt een handige en eenvoudige methode voorgesteld om een analytische norm op basis van glycerol-d5voor te bereiden. De volgorde om de penta-deuterated standaard voor te bereiden vereist een drie stappen procedure die resulteert in de standaard 1-AG-d5, die stabiel is en geen acyl migratie ondergaat (het belangrijkste probleem bij het streven naar het synthetiseren van 2-monoacylglycerolen).
Het belangrijkste doel hier is om een eenvoudige en reproduceerbare methode te tonen voor het bestuderen van 2-AG in C. elegans, inclusief de synthese van de analytische HDO norm, bereiding en extractie van de nematode monsters, en analyse door LC-MS/MS (Figuur 1 ). Deze synthetische procedure is haalbaar zonder de geraffineerde organische synthese kennis of speciale apparatuur, waardoor het geschikt is voor wetenschappers van verschillende vakgebieden die C. elegans gedrag onder endocannabinoïde invloed bestuderen. De methode is ook uitbreidbaar naar andere studiemodellen, waardoor het nuttig is voor verschillende doelen. De standaard, bereid zoals hier gerapporteerd, is toegepast om met succes een snelle en betrouwbare chromatografische methode te ontwikkelen die een effectieve detectie en kwantificering van 2-AG op een reproduceerbare manier mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.1-AG-d5 voorbereiding
Opmerking: voor het verkrijgen van 1-AG-d5 als een HDO interne standaard voor kwantificerings testen, volgt u het protocol zoals hieronder beschreven.
- Differentiële bescherming
- Om primaire alcoholen alleen te beschermen, Voeg eerst 38 mg glycerol-d8 toe aan een 10 ml-reactie buis met behulp van een Pasteur-pipet en voeg een magnetische roerder toe.
- Voeg 5 mL watervrije dichloormethaan (DCM) toe met een 5 mL Hamilton spuit en vul de buis met Dry N2 om een inerte atmosfeer te leveren.
- Maak een bad met een ondiepe Dewar kolf gevuld met gedestilleerd ethylacetaat.
- Monteer de hermetisch gesloten reactie buis in het bad en koel deze af door langzaam vloeistof N2 toe te voegen aan het ethylacetaat totdat het oplosmiddel is bevroren.
Let op: vloeistof heftig kookt bij kamertemperatuur (RT) en kan ernstige brandwonden veroorzaken bij contact met de ogen en de huid. - Voeg 54 mg watervrij Collidine toe met een Hamilton injectiespuit.
Let op: Collidine is vluchtig en heeft een zeer sterke en onaangename geur. - Voeg 70 mg tert-butyldimethylsilylchloride toe en roer de gehele oplossing 3 uur bij-78 °C op een magneetroerder.
- Na 3 uur, laat de reactie op warm op RT en Blijf roeren voor een extra 12 h.
- Voeg 2 mL pekel toe om de reactie te doven.
- Extraheer de oplossing 3x met 2 mL gedestilleerd dichloormethaan met behulp van een scheitrechter, waarbij het organisch extract telkens wordt opgeslagen.
- Combineer de drie organische extracten en droog ze over natriumsulfaat.
- Damp de dichloormethaan onder verminderde druk in een vacuüm rotatieverdamper voorzichtig in om oplosmiddel projecties te voorkomen.
- Reinig het ruwe mengsel door Kolomchromatografie met behulp van silicagel als de stationaire fase en een 10% toenemende hexaan/ethylacetaat gradiënt, beginnend vanaf 100% hexaan en eindigend met 100% ethylacetaat.
- Combineer de productbevattende fracties en verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk in een vacuüm rotatieverdamper om de zuivere 1-O, 3-O-bis-(TBDMS) glycerol-d5 te verkrijgen als een kleurloze vloeistof.
- Verestering
- Voeg 10 mg 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-glycerol-d5 (eerder gesynthetiseerd) toe aan een 10 ml-reactie buis met behulp van een Pasteur-pipet en voeg een magnetische roerder toe.
- Voeg 2 mL watervrije dichloormethaan toe met een 5 mL Hamilton spuit en vul de buis met Dry N2 om een inerte atmosfeer te leveren.
- Koel de oplossing af op 0 °C met behulp van een ijsbad.
- Voeg 36 mg arachidonzuur toe met behulp van een met meerdere volumes verstelbare micropipet en roer.
- Voeg toe 15 mg 4-dimethylaminopyridine en roer.
- Voeg 15 mg N, N'-diisopropylcarbodiimide toe met behulp van een met meerdere volumes verstelbare micropipet en roer.
- Laat het mengsel reageren bij 0 °C gedurende 3 uur.
- Na 3 uur, laat de reactie op warm op RT en Blijf roeren voor een extra 12 h.
- Voeg 2 mL water toe om de reactie te doven.
- Extraheer de organische oplossing 3x met 2 mL gedestilleerd dichloormethaan (DCM) met behulp van een scheitrechter.
- Plaats de drie organische extracten in dezelfde buis en droog ze over natriumsulfaat.
- Damp de dichloormethaan onder verminderde druk in een vacuüm rotatieverdamper voorzichtig in om oplosmiddel projecties te voorkomen.
- Reinig het ruwe mengsel door Kolomchromatografie met behulp van silicagel als de stationaire fase en een 10% toenemende hexaan/ethylacetaat gradiënt, beginnend bij 100% hexaan en eindigend met 50% hexaan/50% ethylacetaat.
- Combineer de productbevattende fracties en verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk in een vacuüm rotatieverdamper om de zuivere 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 als een gelige vloeistof te verkrijgen.
- Deprotection
- Voeg 15 mg 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 (voorheen gesynthetiseerd) toe aan een 10 ml-reactie buis met behulp van een Pasteur-pipet en voeg een magnetische roerder toe.
- Voeg 2 mL watervrij THF toe met een 5 mL Hamilton spuit en vul de buis met Dry N2 om een inerte atmosfeer te leveren.
- Koel de oplossing af op 0 °C met behulp van een ijsbad.
- Voeg 150 μL druppwise van 1 M tetrabutylammoniumfluoride oplossing in THF toe met een Hamilton-spuit.
- Laat de reactie warm om RT en roer voor 1 h.
- Voeg na 1 uur 2 mL water toe om de reactie te doven.
- Extraheer de oplossing 3x met 2 mL gedestilleerd dichloormethaan met behulp van een scheitrechter.
- Combineer de drie organische extracten en droog ze over natriumsulfaat.
- Damp de dichloormethaan onder verminderde druk in een vacuüm rotatieverdamper in om de zuivere 1-AG-d5 als gelige vloeistof te verkrijgen.
- Bewaak alle reacties door Dunnelaagchromatografie uitgevoerd op silicagel 60 F254 voorgecoate aluminium platen. Visualiseer de banden onder een UV-lamp van 254 nm na kleuring met een ethanolische oplossing van 4-anisaldehyde.
2. voorbereiding van standaardvoorraad-en meetoplossingen
- Los 1 mg van de interne standaard 1-AG-d5 op in 1 ml ACN en sonificeren gedurende 1 minuut om de 1.000 ppm standaardstockoplossing te verkrijgen.
- Om de 1.000 ppb-oplossing voor kwantificering in wormen voor te bereiden, bereidt u eerst een 10 ppm-oplossing voor: Neem 10 μL van de stamoplossing met behulp van een Hamilton-spuit en Verdun deze tot een eindvolume van 1 mL door 990 μL ACN toe te voegen.
- Neem 100 μL van de in stap 2,2 geproduceerde oplossing met behulp van een Hamilton-spuit en Verdun deze tot een eindvolume van 1 mL door 900 μL ACN toe te voegen om de 1.000 ppb-oplossing te verkrijgen die voor de kwantificering wordt gebruikt.
- Soniceren gedurende 1 minuut tussen elke stap om een volledige solubilization te garanderen. Bewaar de oplossingen bij-78 °C om de concentraties en integriteit van de normen te handhaven. Nadat de standaardoplossing wordt gebruikt, stroomt u wat stikstof voordat u de injectieflacon sluit om oxidatie te voorkomen.
3. groei en onderhoud van C. elegans
NB: zaai de agarplaten van de nematode groeimedium (NGM) met E. coli OP50 en propageren de wormen op deze platen.
- Meng 3 g NaCl met 17 g agar.
- Voeg 2,5 g peptone toe en voeg vervolgens 975 mL H2O toe.
- Autoclaaf voor 50 min, koel de kolf dan tot 55 °C.
- Meng het volgende: 1 mL van 1 M CaCl2, 1 ml van 1 m MgSO4, 25 ml 1 m KH2po4 buffer (allemaal eerder autoclaved), en 1 ml 5 mg/ml cholesterol in ethanol.
- Terwijl het behoud van een steriele omgeving, de NGM oplossing te doseren in 60 mm Petri platen, het vullen van de platen tot tweederde van hun volume. Bewaar de platen op 4 °C.
- Streep de E. coli bacteriecultuur van a-80 °c glycerol voorraad op de LB agar plaat. Laat de plaat 's nachts groeien op 37 °C.
- Pick-up een enkele kolonie te inoculeren 100 mL vloeibare LB 's nachts bij 37 °C met agitatie.
Opmerking: het is niet nodig om de O.D. te controleren, omdat deze stam in deze tijd een stationaire fase kan bereiken. - Verwijder de opgeslagen NGM-platen, verwijder de deksels in de laminaire stroom afzuigkap en laat open om de verdamping van overtollig vocht van de platen mogelijk te maken.
- Zodra de platen zijn gedroogd, gebruik een Pasteur-pipet om 100 μL van OP50 E. coli toe te voegen aan het midden van de plaat zonder zich te verspreiden.
- Laat de OP50 E. coli gazon om 's nachts te groeien bij RT of bij 37 °c gedurende 8 uur.
- Voeg de gewenste aantallen worm embryo's toe die zijn verkregen door hypochloriet behandeling of "bleaching" (rubriek 4).
Opmerking: laat de platen afkoelen tot RT voor de toevoeging van wormen.
4. bleaching techniek voor het synchroniseren van C elegans culturen
- Zaden en Brok wormen op 6 cm NGM platen.
- Laat de wormen groeien voor 2-3 dagen om voldoende aantallen eieren en zwangere volwassenen op het bord te krijgen.
- Zodra er voldoende eieren/volwassenen, giet 5 mL M9 op de plaat.
- Breng de wormen over naar een centrifugebuis van 15 mL met een glazen pipet.
- Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 2.000 x g en pellet de wormen.
- Het grootste deel van de M9 uitzuigen, waardoor verstoring van de worm pellet wordt vermeden.
- Voeg 3 mL bleek oplossing toe (2:1:1 verhouding NaOH: NaOCl: H2O).
- Keer zachtjes om de oplossing gedurende 5 minuten te mengen of totdat het aantal intacte volwassen wormen afneemt.
Let op: niet meer dan 5 min bleken. - Centrifugeer 1 minuut bij 2.000 x g en zuig het grootste deel van de bleek oplossing op zonder de worm pellet te storen.
- Voeg 15 mL M9 toe en meng goed.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut opnieuw bij 2000 x g .
- Het grootste deel van de M9 uitzuigen zonder de worm pellet te storen.
- Herhaal stap 4.10-4.12 een of twee keer.
- Voeg 5 mL verse M9 en agitaat toe.
- Laat de eitjes 's nachts uitkomen met zacht schommelen.
5. voorbereiding van het worm monster
- Laat de N2-embryo's die door de bleek procedure worden verkregen, 's nachts in M9-buffer (5 mL in een centrifugebuis van 15 mL) bij 20 °C uitkomen.
- Oogst de gesynchroniseerde L1s door de buis 2 min te centrifugeren bij 2.000 x g.
- Was de wormen met M9 buffer 1x en kwantificeer vervolgens het aantal levende L1 wormen.
- Zaai ongeveer 10.000 wormen in NGM-platen (diameter van 10 cm) met 1 mL OP50 E. coli (voorheen gedroogd).
- Inbroed de platen voor 48 uur bij 20 °C totdat de wormen de L4-fase bereiken.
- Oogst de wormen met de Cold M9-buffer in een centrifugebuis van 15 mL, was ze 1x en breng ze over naar een tube van 1,5 mL.
- Pellet de wormen door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 1 minuut, elimineer het grootste deel van het supernatant, dompel de buizen onder in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °c.
6. lipide-extractie
- Ontdooi ongeveer 100 μL bevroren worm pellets van N2 op ijs, voeg 1,3 ml methanol toe en sonificeren het monster gedurende 4 minuten.
- Voeg 2,6 ml chloroform en 1,3 ml 0,5 m KCl/0.08 m H3po4 toe aan een eind verhouding van 1:2:1, 1.000 ppb van de interne standaard 1-AG-d5en gebutyleerd hydroxytolueen als antioxidant middel in een eindconcentratie van 50 μg/ml.
- Vortex de monsters gedurende 1 minuut en soniceren in een ultrasoon waterbad gedurende 15 minuten op ijs.
- Vortex de monsters 2x gedurende 1 minuut en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g om de fasescheiding te induceren.
- Vang de onderste fase op en vang het op in een schone buis, droog het onder stikstof en rebreng het vaste residu in 100 μL van ACN.
7. endocannabinoïde analyse door HPLC-MS/MS
- Gebruik vloeistofchromatografie in combinatie met een ESI Triple vierpolige massaspectrometer om 2-AG uit nematode monsters te meten en te kwantificeren.
- Gebruik de volgende verhouding voor omgekeerde-fase HPLC: van 0,0-0,5 min H2o:acn (40:60), 0,5-6,5 min h2o:acn (40:60) tot (25:75), 6,5-7,5 min h2o:ACN (25:75), 7.5-8.0 min h2o:ACN (25:75) tot (40:60), 8.0-12.0 min H2O: ACN (40:60).
- Houd de kolomtemperatuur bij 40 °C en stel de temperatuur van de autosampler-lade in op 10 °C.
- Stel de volgende ionisatie condities in: positive-Ion-modus; drooggas (N2) temperatuur = 300 °c; drooggas debiet = 10 L/min; druk van de vernevelaar = 10 UA; en dop. spanning = 4 kV.
- Gebruik voor de detectie van analyt MRM met de volgende overgangen: 379,2 m/z tot 289,2 m/z voor 2-AG; en 384,2 m/z tot 289,2 m/z voor 1-AG-d5.
8. endocannabinoïde kwantificering in wormen
- Gebruik HDO interne standaard 1-AG-d5 en bereken de piekoppervlak verhoudingen van de analyt naar de interne standaard.
- Gebruik de volgende overgangen: 384,2 m/z tot 287,2 m/z voor 2-AG; en 379,2 m/z tot 287,2 m/z voor 1-AG-d5.
- Bereken de concentratie van de endogene 2-AG door in vergelijking met de piek gebied verhoudingen van de HDO standaard met behulp van de concentratiewaarde van de norm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een isotopisch gelabelde analoog werd met succes gesynthetiseerd uit in de handel verkrijgbare d8-glycerol en arachidonzuur met behulp van een 3-Step synthetische methode (Figuur 2, Figuur 3). Deze stappen zijn eenvoudig en vereisen geen geavanceerde apparatuur, speciaal gecontroleerde omstandigheden of dure reagentia. Dus, deze methode is robuust en kan met succes worden uitgebreid tot synthetiseren van monoacylglyceriden met verschillende vetzuren.
1-AG-d5 werd structureel gekarakteriseerd met behulp van nucleaire magnetische spectroscopie. 1 H NMR toonde de karakteristieke Multiplet met 5,44 ppm tot 4,93 ppm, die voor de acht vinyl protonen van de Arachidonoyl-keten en triplet op 2,40 ppm integreert, overeenkomend met de twee protonen van de Alfa positie aan de carbonylgroep. In 2D NMR, is het ook mogelijk om te zien een 2,9 ppm naar 2,7 ppm Multiplet toewijs aan de vijf deuterium van de glycerol portie.
De chemisch gesynthetiseerde 1-AG-d5 werd gebruikt als een interne standaard in C. elegans samples. De standaard werd toegevoegd aan de monsters vóór extractie vervolgens geëxtraheerd met de endogene lipiden, met behulp van een eenvoudige methode aangepast van Folch24. Deze gemodificeerde methode biedt een hoge herstel waarde van de standaard, zoals blijkt uit de HPLC-kwantificering.
De methode werd geoptimaliseerd met behulp van de overgangen 1) 384,2 m/z tot 287,2 m/z voor 2-AG en 2) 379,2 m/z tot 287,2 m/z voor 1-AG-d5, waarbij de glycerol moleculen verloren gaan (Figuur 4). De grenzen van de detectie (LOD) en kwantificering (LOQ) werden berekend voor de norm met behulp van een ijkcurve, resulterend in waarden van respectievelijk 5 ppb en 16,6 ppb. De retentietijd voor de standaard was 6,8 min.
2-AG endogene uit de C. elegans monsters werd met succes gedetecteerd en gekwantificeerd door isotopen verdunning met de chemisch gesynthetiseerde 1-AG-d5 met behulp van HPLC-MS/MS (Figuur 5).
Aangezien de oorspronkelijke concentraties van de HDO-normen in de monsters 1 en 3 elk 1.000 ppb waren, was het mogelijk om de endogene concentratie van 2-AG bij 340 ppb te berekenen voor 1 en 360 ppm voor monster 3, met een gemiddelde van 350 ppm ( Tabel 1).
Figuur 1: samenvatting van synthese, worm bemonstering en kwantificering. Om een succesvolle kwantificering van de endogene 2-AG te bereiken, was het noodzakelijk om zijn HDO analoog te synthetiseren met behulp van een drie stappen reeks. Daarna werd het toegevoegd aan worm monsters, geëxtraheerd en geanalyseerd door HPLC-MS/MS. gebruikt als een interne standaard, de synthetische van 1-AG-d5 was het instrument gebruikt voor het kwantificeren van de endogene metaboliet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: synthetisch schema voor het verkrijgen van 1-AG-d5. Een massa van 10 mg van de HDO analoog werd verkregen met behulp van de drie-stappen methode waarbij 1) bescherming van de glycerol-d-8, 2) acylering met arachidonzuur, en 3) deprotectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: chemische structuur van de isotopisch gelabeld 2-AG analoog. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: geselecteerde fragmentaties voor de kwantificering van 1-AG-d5 en 2-AG. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: HPLC-chromatogrammen voor 1-AG-d5 en 1-AG als zuivere normen en interne normen in een worm monster. Het was mogelijk om te analyseren retentietijden en zie dat 1) de worm lijkt niet te hebben van endogene 1-AG en 2) het zou alleen 2-AG, maar de standaard 1-AG-d5 zal nog steeds werken als een goede analytische standaard voor kwantificering door isotopen verdunning. De gebruikte overgangen waren: 384,2 m/z tot 287,2 m/z voor 2-AG, en 379,2 m/z tot 287,2 m/z voor 1-AG-d5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| 1-AG-d5 | 2-AG | Ratio (2-AG/1-AG-d5) | |
| Voorbeeld 1 | 71964,74 | 210616,08 | 0,34 |
| Voorbeeld 3 | 74311,36 | 205648,43 | 0,36 |
Tabel 1: piek gebied verhoudingen voor de HDO standaard en endogene 2-AG. De verhoudingen werden berekend als een quotiënt tussen de piek gebieden van 2-AG en 1-AG-d5 , respectievelijk, voor twee geïsoleerde monsters, beide met HDO standaard toegevoegd vóór de extractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endocannabinoïden zijn een klasse van lipiden die betrokken zijn bij de regulatie van de Dauer formatie in C. elegans7. Specifieker, de synthese van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFAs) is belangrijk voor de handel in cholesterol en de reproductieve ontwikkeling van wormen. Het wordt hier onthuld dat 2-AG, een arachidonzuur dat endocannabinoïde bevat, verantwoordelijk is voor het restituting van de Dauer larve tot zijn normale cyclus in wormen die een verminderd cholesterol metabolisme hebben7.
Gezien het recent ontdekte belang van 2-AG in de verbetering van de cholesterol handel en andere biologische processen en hoe weinig bekend is over hoe lipiden dit proces beïnvloeden, is een betrouwbare detectiemethode voor deze endocannabinoïde noodzakelijk. De succesvolle ontwikkeling van deze eenvoudige en robuuste synthetische methode om de HDO analoge 1-AG-d5 te verkrijgen, is een belangrijke stap in dit protocol.
De meeste van de gerapporteerde methoden om monoacylglycerolen te kwantificeren betrekken het gebruik van commercieel beschikbare analytische normen, die zijn meestal duur en instabiel onder regelmatige opslagomstandigheden. Dit maakt ze lastig voor onderzoekers die grotere hoeveelheden normen en verse voorraden nodig hebben. Ze zijn ook onbereikbaar voor lagere budget laboratoria. Echter, deze methode overkomt dit obstakel door het voorstellen van de synthese van de standaard met behulp van meer toegankelijke uitgangsmaterialen.
Het is ook opmerkelijk dat in tegenstelling tot andere gerapporteerde methoden (die gebruik maken van HDO analytische normen van 2-gesubstitueerde monoacylglycerolen die onder vele omstandigheden lijden aan acyl-migratie, zodat twee chromatografische pieken worden gezien en de relatieve invloed van kwantificering door isotopen verdunning25), deze methode maakt efficiënt gebruik van een 1-gesubstitueerde HDO analytische standaard, die één isomeer is en geen acyl-migratie ondergaat.
De synthetische methode is eenvoudig en vereist geen geavanceerde omstandigheden, waardoor het ideaal is voor elk laboratorium met minimale apparatuur, budget en toegang tot reactanten. Het is ook een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt door elke wetenschapper die in het veld werkt, zonder de noodzaak van speciale training in de organische synthese. De voorbereiding van het worm monster is de conventionele methode, zonder verdere complicaties. Ten slotte is de lipide-extractiemethode om de eindmonsters te verkrijgen een wijziging van het Folch-protocol24 , dat betere herstel waarden mogelijk maakt, omdat het geen chromatografische kolom zuivering vereist.
De kritieke stap is ervoor te zorgen dat de monstervoorbereiding en lipide-extractie adequaat worden uitgevoerd om een goed en detecteerbaar herstel van de standaard te bereiken. Het is ook belangrijk om 1) te produceren nieuwe voorraadoplossingen maandelijks te handhaven voorwaarden van de standaard en 2) controleren door NMR-spectroscopie of LC-MS dat de norm is nog steeds zuiver en heeft geen oxidatie of afbraak ondergaan. De enige beperking van deze techniek is afhankelijk van de uitbreiding ervan tot andere studies die endogene 2-AG concentraties lager kunnen hebben dan de gepresenteerde LOQ. In dit geval moet de methode worden aangepast om ervoor te zorgen dat de concentratie tussen de grenzen valt.
In het geval van een storing tijdens het protocol waarbij 1) er geen zichtbaar chromatografisch signaal van de standaard of 2) de herstel waarde van de standaard na extractie lager is dan verwacht, is het raadzaam om te herhalen monstervoorbereiding en lipide-extractie. Aangezien de synthetische route de synthese omvat van een beschermd HDO bouwsteen van glycerol dat uiteindelijk met arachidonzuur in de laatste stap wordt acyleerd, kan deze methode worden uitgebreid tot de synthese van HDO normen van andere monoacylglycerolen, diacylglicerolen, fosfolipiden en structureel verwante metabolieten.
Kortom, deze nieuwe procedure beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het opsporen en kwantificeren van 2-AG, die zal helpen bij het aanpakken van enkele van de onbeantwoorde vragen over de rol van deze endocannabinoïde in C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een onderzoeksbeurs van de Agencia Nacional de Promoción científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. en B.H.C. zijn Fellows van CONICET. D.d.M. en G.R.L. zijn lid van de Onderzoeksafloop van CONICET. We zijn dankbaar Gonzalo Lamberto (INMET) voor LC-MS/MS analyse en nuttige discussie. Video-opnamen en bewerking is gedaan door Ramiro Ortega en María Soledad Casasola van Dirección de comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario in Rosario, Argentinië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M.
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
