Summary
Diese Arbeit beschreibt eine robuste und unkomplizierte Methode, um das Endocannabinoid 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) in C. eleganszu erkennen und zu quantifizieren. Ein analytischer deuterated Standard hat wir vorbereitet und für die Quantifizierung von 2-AG durch Isotopverdünnung und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) verwendet.
Abstract
Diese Arbeit stellt eine Methode zur Vorbereitung eines analytischen Standards zur qualitativen und quantitativen Analyse von 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) dar. Endocannabinoide sind konservierte Lipidmediatoren, die mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen regulieren. Bei C. elegans, 2-AG wurde festgestellt, dass verschiedene Rollen besitzen, einschließlich Modulation der Dauerbildung und Cholesterinstoffwechsel. Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den Kosten und der Stabilität der deuterated Standards verbunden sind, die für die Quantifizierung der 2-AG erforderlich sind. Das Verfahren zur Synthese der Norm ist einfach und kann in jedem Labor durchgeführt werden, ohne dass organische Synthese-Expertise oder spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Darüber hinaus wird eine Änderung der Folch-Methode beschrieben, um den deuterated Standard aus der C. elegans-Kultur zu extrahieren. Schließlich wird eine quantitative und analytische Methode zur Detektion von 2-AG mit dem stabilen isotopisch beschrifteten Analog 1-AG-d5 beschrieben, das zuverlässige Ergebnisse in einem schnell-chromatographischen Lauf liefert. Das Verfahren ist nützlich, um die vielfältigen Rollen der 2-AG in C. elegans zu untersuchen und gleichzeitig auf andere Untersuchungen von Metaboliten in verschiedenen Organismen anwendbar zu sein.
Introduction
Endocannabinoide regulieren mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen und sind konservierte Lipidmediatoren1. Die ersten entdeckten und am besten charakterisierten Endocannabinoide sind Anandamid (Arachidonoylethanolamid, AEA) und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG). Endocannabinoide spielen viele kritische Rollen, einschließlich derer in Gehirn BelohnungSysteme sowie Drogenabhängigkeit beteiligt, Speicher, Stimmung, und Stoffwechselprozesse2. AEA und 2-AG werden nur bei Bedarf synthetisiert und haben kurze Lebensdauern, und sie werden durch Transportproteinrückaufnahme und Hydrolyse3abgebaut.
Die Verwendung von Tiermodellen wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist wichtig geworden, um die große Vielfalt biologischer Prozesse zu untersuchen, einschließlich Apoptose, Zellsignalisierung, Zellzyklus, Zellpolarität, Genregulation, Stoffwechsel, Alterung, und Geschlechtsbestimmung4,5. Darüber hinaus ist C. elegans ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der physiologischen Rollen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs). AEA wurde in C. elegans identifiziert und wird unterDiät-Beschränkung6 reduziert. Dieser Mangel verlängert die Lebensdauer der Nematode durch einen diätetischen Restriktionsmechanismus, der durch Supplementierung mit dem Endocannabinoid unterdrückt werden kann. Kürzlich wurde entdeckt, dass 2-AG und AEA eine grundlegende Rolle bei der Regulierung des Cholesterinhandels in C. elegans7spielen. Noch wichtiger war, dass die Supplementierung mit exogenen 2-AG dauer arrest retten kann, die durch den beeinträchtigten Cholesterinhandel bei Niemann-Pick Typ C1 C. elegans Mutanten verursacht wird.
Um ein besseres Verständnis der Beziehung der 2-AG zum Cholesterinhandel und anderen biologischen Prozessen im Nematode (d. h. monoaminergische Signalisierung, Nozieption und Fortbewegung) zu erlangen, ist es entscheidend, diesen endogene Metaboliten zu untersuchen und wie er unter bestimmten Umwelt- und Ernährungsbedingungen betroffen8,9,10,11,12,13. Daher ist es unerlässlich, eine Methode zur Erkennung und Quantifizierung von endogenen 2-AG in C. elegans zu entwerfen und zu optimieren, die für Wissenschaftler verschiedener Bereiche einfach zu verwenden ist, insbesondere für diejenigen, die das Verhalten der Nematode in Bezug auf diese Endocannabinoid.
2008 gelang es Lethonen und Kollegen, 2-AG und AEA in C. elegans mit LC-MS-Analysemethoden zu identifizieren14. Im Jahr 2011 gelang es ihnen, diese Technik auf andere Endocannabinoide zu erweitern15. Neuere Arbeiten haben andere analytische Methoden gezeigt, die erfolgreich bei der Detektion und Quantifizierung von Endocannabinoiden in C. elegans,einschließlich Massenspektrometrie und GC-MS16,17,18, und es hat es wurde auch berichtet, dass ähnliche Analysemethoden auf andere Modelle erweitert werden können19.
Zuvor gemeldete Analysemethoden zur Quantifizierung von 2-AG in biologischen Proben beinhalten in der Regel die Verwendung von deuterated Standards, die kommerziell erworben werden und Verfügbarkeit für den Kauf erfordern20,21. Viele analytische Standards für die LC-MS/MS-Quantifizierung von Endocannabinoiden sind von verschiedenen Anbietern kommerziell erhältlich. Dennoch sind sie teuer, sind empfindlich und oxidieren im Laufe der Zeit, aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Doppelbindungen. Die gängigsten Versionen dieser Normen basieren auf der octa-deuterated arachidonsäure und sind für die Quantifizierung durch Isotopverdünnung LC-MS/MS14,22geeignet. Auch, die meisten dieser Standards sind in Position 2 des Glycerins ersetzt, so dass sie unter den meisten Bedingungen instabil sind, da sie anfällig für Acylmigrationsind 19,23.
Um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den Kosten und der Stabilität dieser deuterated Standards verbunden sind, wird eine bequeme und einfache Methode zur Vorbereitung eines analytischen Standards auf der Grundlage von Glycerin-d5vorgestellt. Die Reihenfolge zur Vorbereitung des penta-deuterated-Standards erfordert ein dreistufiges Verfahren, das zu dem Standard 1-AG-d5führt, das stabil ist und keiner Acylmigration unterzogen wird (das Hauptproblem bei der Synthese von 2-Monoacylglycerolen).
Das Hauptziel besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Untersuchung von 2-AG in C. eleganszu zeigen, einschließlich der Synthese des analytischen deuterated Standards, der Herstellung und Extraktion der Nematodenproben und der Analyse durch LC-MS/MS (Abbildung 1 ). Dieses synthetische Verfahren ist ohne das ausgeklügelte organische Synthesewissen oder spezielle Ausrüstung erreichbar, so dass es für Wissenschaftler aus verschiedenen Bereichen geeignet ist, die das Verhalten von C. elegans unter endocannabinoidem Einfluss untersuchen. Die Methode ist auch auf andere Studienmodelle erweiterbar, was sie für verschiedene Ziele nützlich macht. Die hier erstellte Norm wurde angewendet, um erfolgreich ein schnelles und zuverlässiges chromatographisches Verfahren zu entwickeln, das eine effektive Detektion und Quantifizierung von 2-AG in reproduzierbarer Weise ermöglicht.
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Protocol
1. 1-AG-d5 Zubereitung
HINWEIS: Um 1-AG-d5 als deuterated internen Standard für Quantifizierungstests zu erhalten, befolgen Sie das Protokoll wie unten beschrieben.
- Differenziellschutz
- Um nur Primäralkohole zu schützen, fügen Sie zunächst 38 mg Glycerin-d8 mit einer Pasteur-Pipette in ein 10 ml-Reaktionsrohr und einen Magnetischen Rührer hinzu.
- Fügen Sie 5 ml wasserfreies Dichlormethan (DCM) mit einer 5 ml Hamilton Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem N2, um eine inerte Atmosphäre zu erzielen.
- Bereiten Sie ein Bad mit einem flachen Dewar-Kolben mit destilliertem Ethylacetat gefüllt.
- Das hermetisch geschlossene Reaktionsrohr in das Bad einbauen und abkühlen, indem man dem Ethylacetat langsam FlüssigN2 hinzufügt, bis das Lösungsmittel eingefroren ist.
VORSICHT: Flüssigkeit kocht bei Raumtemperatur (RT) heftig und kann schwere Verbrennungen verursachen, wenn Augen und Haut in Kontakt kommen. - Fügen Sie 54 mg wasserfreies Collidine mit einer Hamilton-Spritze hinzu.
VORSICHT: Collidine ist flüchtig und hat einen sehr starken und unangenehmen Duft. - 70 mg Tert-Butyldimethylsilylchlorid hinzufügen und die gesamte Lösung für 3 h bei -78 °C auf einem Magnetrührer rühren.
- Nach 3 h die Reaktion bei RT warm lassen und weiter rühren für weitere 12 h.
- Fügen Sie 2 ml Sole hinzu, um die Reaktion zu löschen.
- Extrahieren Sie die Lösung 3x mit 2 ml destilliertem Dichlormethan mit einem Trenntrichter, wodurch der organische Extrakt jedes Mal eingespart wird.
- Kombinieren Sie die drei organischen Extrakte und trocknen Sie sie über Natriumsulfat.
- Verdampfen Sie das Dichlormethan unter reduziertem Druck in einem Vakuum-Rotationsverdampfer vorsichtig, um Lösungsmittelprojektionen zu vermeiden.
- Reinigen Sie das Rohgemisch durch Säulenchromatographie mit Kieselgel als stationäre reine Phase und einem um 10 % steigenden Hexan/Ethylacetat-Gradienten, beginnend mit 100% Hexan und Endbearbeitung mit 100% Ethylacetat.
- Kombinieren Sie die produkthaltigen Fraktionen und entfernen Sie das Lösungsmittel unter reduziertem Druck in einem Vakuum-Rotationsverdampfer, um das reine 1-O,3-O-bis-(TBDMS) Glycerin-d5 als farblose Flüssigkeit zu erhalten.
- Veresterung
- 10 mg des 1-O,3-O-bis(TBDMS)-Glycerol-d5 (zuvor synthetisiert) mit einer Pasteur-Pipette in ein 10 ml-Reaktionsrohr geben und einen Magnetrührer hinzufügen.
- Fügen Sie 2 ml wasserfreies Dichlormethan mit einer 5 ml Hamilton Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem N2, um eine inerte Atmosphäre zu erzielen.
- Kühlen Sie die Lösung mit einem Eisbad auf 0 °C ab.
- Fügen Sie 36 mg Arachidonsäure mit einer multi-Volumen einstellbare Mikropipette und rühren.
- 15 mg 4-Dimethylaminopyridin zugeben und umrühren.
- Fügen Sie 15 mg N,N'-Diisopropylcarbodiimid mit einem Multi-Volume einstellbare Mikropipette und rühren.
- Lassen Sie die Mischung bei 0 °C für 3 h reagieren.
- Nach 3 h die Reaktion bei RT warm lassen und weiter rühren für weitere 12 h.
- Fügen Sie 2 ml Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen.
- Extrahieren Sie die organische Lösung 3x mit 2 ml destilliertem Dichlormethan (DCM) mit einem Trenntrichter.
- Die drei organischen Extrakte in ein und dieselbe Röhre geben und über Natriumsulfat trocknen.
- Verdampfen Sie das Dichlormethan unter reduziertem Druck in einem Vakuum-Rotationsverdampfer vorsichtig, um Lösungsmittelprojektionen zu vermeiden.
- Reinigen Sie das Rohgemisch durch Säulenchromatographie mit Kieselgel als stationäre reine Phase und einem um 10 % steigenden Hexan/Ethylacetat-Gradienten, beginnend mit 100% Hexan und Endbearbeitung mit 50% Hexan/50% Ethylacetat.
- Kombinieren Sie die produkthaltigen Fraktionen und entfernen Sie das Lösungsmittel unter reduziertem Druck in einem Vakuum-Rotationsverdampfer, um die reine 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 als gelbliche Flüssigkeit zu erhalten.
- Deprotection
- 15 mg des 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 (zuvor synthetisiert) mit einer Pasteur-Pipette in ein 10 ml Reaktionsrohr geben und einen Magnetrührer hinzufügen.
- Fügen Sie 2 ml wasserfreies THF mit einer 5 ml Hamilton Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem N2, um eine inerte Atmosphäre zu erzielen.
- Kühlen Sie die Lösung mit einem Eisbad auf 0 °C ab.
- Fügen Sie 150 L tropfenweise von 1 M Tetrabutylammoniumfluoridlösung in THF mit einer Hamilton-Spritze hinzu.
- Lassen Sie die Reaktion auf RT warm und rühren Sie für 1 h.
- Nach 1 h 2 ml Wasser hinzufügen, um die Reaktion zu löschen.
- Extrahieren Sie die Lösung 3x mit 2 ml destilliertem Dichlormethan mit einem Trenntrichter.
- Kombinieren Sie die drei organischen Extrakte und trocknen Sie sie über Natriumsulfat.
- Verdampfen Sie das Dichlormethan unter reduziertem Druck in einem Vakuum-Rotationsverdampfer, um die reine 1-AG-d5 als gelbliche Flüssigkeit zu erhalten.
- Überwachen Sie alle Reaktionen durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60 F254 vorbeschichteten Aluminiumblechen. Visualisieren Sie die Bänder unter einer 254 nm UV-Lampe nach der Färbung mit einer ethanolischen Lösung von 4-Anisaldehyd.
2. Herstellung von Standardlager- und Messlösungen
- 1 mg des internen Standards 1-AG-d5 in 1 ml ACN auflösen und 1 min beschallen, um die Standardlösung 1.000 ppm zu erhalten.
- Um die 1.000 ppb-Lösung vorzubereiten, die für die Quantifizierung in Würmern verwendet wird, bereiten Sie zunächst eine 10 ppm-Lösung vor: Nehmen Sie 10 l der Vorratslösung mit einer Hamilton-Spritze und verdünnen Sie sie auf ein Endvolumen von 1 ml, indem Sie 990 l ACN hinzufügen.
- Nehmen Sie 100 l aus der in Schritt 2.2 hergestellten Lösung mit einer Hamilton-Spritze und verdünnen Sie sie auf ein Endvolumen von 1 ml, indem Sie 900 l ACN hinzufügen, um die für die Quantifizierung verwendete 1.000 ppb-Lösung zu erhalten.
- Sonicate für 1 min zwischen jedem Schritt, um eine vollständige Löslichkeit zu gewährleisten. Bewahren Sie die Lösungen bei -78 °C auf, um die Konzentrationen und die Integrität der Standards aufrechtzuerhalten. Nachdem die Standardlösung verwendet wurde, fließen Sie etwas Stickstoff, bevor Sie die Durchstechflasche schließen, um Oxidation zu verhindern.
3. Wachstum und Aufrechterhaltung von C. elegans
ANMERKUNG: Samen Sie die Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Agarplatten mit E. coli OP50 und vermehren die Würmer auf diesen Platten.
- 3 g NaCl mit 17 g Agar mischen.
- Fügen Sie 2,5 g Pepton hinzu, dann fügen Sie 975 ml H2O hinzu.
- Autoklav für 50 min, dann kühlen Sie den Kolben auf 55 °C.
- Mischen Sie folgendes: 1 ml von 1 M CaCl2, 1 ml von 1 M MgSO4, 25 ml von 1 M KH2PO4 Puffer (alle zuvor autoklaviert) und 1 ml 5 mg/ml Cholesterin in Ethanol.
- Geben Sie die NGM-Lösung unter Beibehaltung einer sterilen Umgebung in 60 mm Petriplatten aus und füllen Sie die Platten zu zwei Dritteln ihres Volumens. Bewahren Sie die Platten bei 4 °C auf.
- Die E. coli-Bakterienkultur von einem -80 °C-Glyzerinbestand auf die LB-Agarplatte zu sonieren. Lassen Sie es über Nacht bei 37 °C auf dem Teller wachsen.
- Nehmen Sie eine einzelne Kolonie auf, um 100 ml flüssiges LB über Nacht bei 37 °C mit Rührung zu impfen.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die O.D. zu überprüfen, da diese Sorte in dieser Zeit eine stationäre Phase erreichen kann. - Entfernen Sie die gelagerten NGM-Platten, entfernen Sie die Deckel in der laminaren Strömungshaube und lassen Sie sie offen, um die Verdunstung überschüssiger Feuchtigkeit von den Platten zu ermöglichen.
- Nachdem die Platten getrocknet sind, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um 100 l OP50 E. coli in die Mitte der Platte zu geben, ohne sich auszubreiten.
- Lassen Sie den OP50 E. coli Rasen über Nacht bei RT oder bei 37 °C für 8 h wachsen.
- Fügen Sie die gewünschte Anzahl von Wurmembryonen hinzu, die durch Hypochloritbehandlung oder "Bleichen" gewonnen wurden (Abschnitt 4).
HINWEIS: Kühlen Sie die Platten auf RT, bevor Sie Würmer hinzufügen.
4. Bleichtechnik zur Synchronisation von C-Eleans-Kulturen
- Samen- und Klopwürmer auf 6 cm NGM-Platten.
- Lassen Sie die Würmer für 2-3 Tage wachsen, um eine ausreichende Anzahl von Eiern und gravid Erwachsenen auf dem Teller zu erhalten.
- Sobald genügend Eier/Erwachsene vorhanden sind, 5 ml M9 auf den Teller geben.
- Übertragen Sie die Würmer mit einer Glaspipette in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
- Zentrifugieren Sie das Rohr für 2 min bei 2.000 x g und pellet die Würmer.
- Absaugung des größten Teils des M9, um Störungen des Schneckenpellets zu vermeiden.
- Fügen Sie 3 ml Bleichlösung hinzu (2:1:1 Verhältnis von NaOH:NaOCl:H2O).
- Um sanft umkehren, um die Lösung für 5 min zu mischen oder bis die Anzahl der intakten erwachsenen Würmer abnimmt.
VORSICHT: Nicht mehr als 5 min bleichen. - Zentrifugieren Sie 1 min bei 2.000 x g und saugen Sie den größten Teil der Bleichlösung ab, ohne das Schneckenpellet zu stören.
- 15 ml M9 hinzufügen und gut mischen.
- Zentrifuge wieder bei 2000 x g für 1 min.
- Den größten Teil des M9 aussaugen, ohne das Schneckenpellet zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.10-4.12 noch ein oder zwei Mal.
- 5 ml frischem M9 hinzufügen und aufregen.
- Lassen Sie die Eier über Nacht mit sanftem Schaukeln schlüpfen.
5. Wurmprobenvorbereitung
- Lassen Sie die N2-Embryonen, die durch das Bleichverfahren erhalten werden, über Nacht im M9-Puffer (5 ml in einem 15 ml Zentrifugenrohr) bei 20 °C schlüpfen.
- Ernten Sie die synchronisierten L1s, indem Sie das Rohr für 2 min bei 2.000 x gzentrieren.
- Waschen Sie die Würmer mit M9-Puffer 1x, dann quantifizieren Sie die Anzahl der lebenden L1-Würmer.
- Säen Sie ca. 10.000 Würmer in NGM-Platten (10 cm Durchmesser) mit 1 ml OP50 E. coli (zuvor getrocknet).
- Inkubieren Sie die Platten für 48 h bei 20 °C, bis die Würmer die L4-Stufe erreichen.
- Die Würmer mit einem kalten M9-Puffer in einem 15 ml Zentrifugenrohr ernten, 1x waschen und in ein 1,5 ml Rohr geben.
- Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 1 min, eliminieren die meisten der Überstand, tauchen Sie die Rohre in flüssigen Stickstoff, und lagern bei -80 °C.
6. Lipidextraktion
- Etwa 100 L gefrorene Wurmpellets von N2 auf Eis auftauen, 1,3 ml Methanol hinzufügen und die Probe 4 min beschallen.
- 2,6 ml Chloroform und 1,3 ml 0,5 M KCl/0,08 M H3PO4 zu einem Endverhältnis von 1:2:1, 1.000 ppb des internen Standards 1-AG-d5und Butyliertem Hydroxytoluol als Antioxidans bei einer Endkonzentration von 50 g/ml hinzufügen.
- Wirbeln Sie die Proben für 1 min und beschallen Sie in einem Ultraschall-Wasserbad für 15 min auf Eis.
- Wirbel n. Chr. die Proben 2x für 1 min und Zentrifuge für 10 min bei 2.000 x g, um die Phasentrennung zu induzieren.
- Sammeln Sie die untere Phase und sammeln Sie sie in einem sauberen Rohr, trocknen Sie sie unter Stickstoff und setzen Sie den festen Rückstand in 100 l ACN wieder auf.
7. Endocannabinoid-Analyse durch HPLC-MS/MS
- Verwenden Sie die Flüssigchromatographie in Verbindung mit einem ESI-Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer, um 2-AG aus Nematodenproben zu erkennen und zu quantifizieren.
- Verwenden Sie das folgende Verhältnis für umgekehrte Phase HPLC: von 0,0-0,5 min H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H2O:ACN (40:60) bis (25:75), 6.5-7,5 min H2O:ACN (25:75), 7.5-8.0 min H2O:ACN (25:75) bis (40:60), 8.0-12.0 min H2O: ACN (40:60).
- Halten Sie die Säulentemperatur bei 40 °C und stellen Sie die Autosampler-Traytemperatur auf 10 °C ein.
- Legen Sie die folgenden Ionisationsbedingungen fest: Positiv-Ionen-Modus; Trocknungsgas (N2) Temperatur = 300 °C; Trocknungsgasdurchfluss = 10 l/min; Verneblerdruck = 10 UA; und Kappe. Spannung = 4 kV.
- Für die Analyterkennung verwenden Sie MRM mit folgenden Übergängen: 379,2 m/z bis 289,2 m/z für 2-AG; und 384,2 m/z bis 289,2 m/z für 1-AG-d5.
8. Endocannabinoid-Quantifizierung in Würmern
- Verwenden Sie deuterated internen Standard 1-AG-d5 und berechnen Sie die Spitzenflächenverhältnisse des Analyten zum internen Standard.
- Verwenden Sie die folgenden Übergänge: 384,2 m/z bis 287,2 m/z für 2-AG; und 379,2 m/z bis 287,2 m/z für 1-AG-d5.
- Berechnen Sie die Konzentration der endogenen 2-AG, indem Sie die Spitzenflächenverhältnisse des deuterated Standards unter Verwendung des Konzentrationswertes der Norm vergleichen.
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Representative Results
Ein isotopisch beschriftetes Analogon wurde erfolgreich aus handelsüblichen d 8-Glycerin und Arachidonsäure mit einem 3-stufigen synthetischen Verfahren synthetisiert (Abbildung 2, Abbildung 3). Diese Schritte sind einfach und erfordern keine ausgeklügelte Ausrüstung, speziell kontrollierte Bedingungen oder teure Reagenzien. Somit ist diese Methode robust und kann erfolgreich erweitert werden, um Monoacylglyceride zu synthetisieren, die verschiedene Fettsäuren enthalten.
1-AG-d5 wurde strukturell durch Kernmagnetspektroskopie charakterisiert. 1 H NMR zeigte das charakteristische Multiplet bei 5,44 ppm bis 4,93 ppm, das sich für die acht Vinylprotonen der Arachidonoylkette und das Triplet bei 2,40 ppm integriert, was den beiden Protonen der Alpha-Position zur Carbonylgruppe entspricht. In 2D NMR ist es auch möglich, ein 2,9 ppm bis 2,7 ppm Multiplet zu sehen, das dem fünf Deuterium des Glycerinanteils zuordenbar ist.
Die chemisch synthetisierte 1-AG-d5 wurde als interner Standard in C. elegans Proben verwendet. Der Standard wurde den Proben vor der Extraktion hinzugefügt und dann mit den endogenen Lipiden extrahiert, mit einer einfachen Methode, die von Folch24angepasst wurde. Diese modifizierte Methode bietet einen hohen Wiederherstellungswert des Standards, wie die HPLC-Quantifizierung zeigt.
Das Verfahren wurde mit den Übergängen 1) 384,2 m/z bis 287,2 m/z für 2-AG und 2) 379,2 m/z bis 287,2 m/z für 1-AG-d5optimiert, bei denen die Glycerinmoleküle verloren gehen (Abbildung 4). Die Grenzen der Detektion (LOD) und Quantifizierung (LOQ) wurden für den Standard mit Hilfe einer Kalibrierkurve berechnet, was zu Werten von 5 ppb bzw. 16,6 ppb führte. Die Retentionszeit für die Norm betrug 6,8 min.
2-AG endogen aus den C. elegans Proben wurde erfolgreich nachgewiesen und durch Isotopenverdünnung mit der chemisch synthetisierten 1-AG-d5 mit HPLC-MS/MS quantifiziert (Abbildung 5).
Da die ursprünglichen Konzentrationen der deuterated Standards in den Proben 1 und 3 jeweils 1.000 ppb betrugen, konnte ab dem Spitzenflächenverhältnis die endogene Konzentration von 2-AG bei 340 ppb für die Probe 1 und 360 ppm für Probe 3 berechnet werden, was einem Durchschnitt von 350 ppm () entspricht ( Tabelle 1).
Abbildung 1: Zusammenfassung der Synthese, Der Schneckenprobenahme und Quantifizierung. Um eine erfolgreiche Quantifizierung der endogenen 2-AG zu erreichen, war es notwendig, ihr deuterated analog mit einer dreistufigen Sequenz zu synthetisieren. Danach wurde es Wurmproben hinzugefügt, extrahiert und von HPLC-MS/MS analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Synthetisches Schema zum Erhalt von 1-AG-d5. Eine Masse von 10 mg des deuterated analog wurde mit dem dreistufigen Verfahren mit 1) Schutz der Glycerin-d8, 2) Acylation mit Arachidonsäure und 3) Deprotection erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Chemische Struktur des isotopisch beschrifteten 2-AG Analog. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ausgewählte Fragmentierungen zur Quantifizierung von 1-AG-d5 und 2-AG. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: HPLC-Chromatogramme für 1-AG-d5 und 1-AG als reine Normen und interne Normen in einer Schneckenprobe. Es war möglich, Retentionszeiten zu analysieren und zu sehen, dass 1) der Wurm nicht endogene 1-AG zu haben scheint und 2) er nur 2-AG hätte, aber die Norm 1-AG-d5 wird weiterhin als guter analytischer Standard für die Quantifizierung durch Isotopverdünnung funktionieren. Die verwendeten Übergänge waren: 384,2 m/z bis 287,2 m/z für 2-AG und 379,2 m/z bis 287,2 m/z für 1-AG-d5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| 1-AG-d5 | 2-AG | Verhältnis (2-AG/1-AG-d5) | |
| Beispiel 1 | 71964.74 | 210616.08 | 0.34 |
| Beispiel 3 | 74311.36 | 205648.43 | 0.36 |
Tabelle 1: Spitzenflächenverhältnisse für den deuterated Standard und endogene 2-AG. Die Verhältnisse wurden als Quotient zwischen den Spitzenflächen von 2-AG bzw. 1-AG-d5 für zwei isolierte Proben berechnet, die beide vor der Extraktion mit deuterated Standard zugesetzt wurden.
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Discussion
Endocannabinoide sind eine Klasse von Lipiden, die in die Regulierung der Dauerbildung in C. elegans7verwickelt sind. Genauer gesagt ist die Synthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) wichtig für den Cholesterinhandel und die fortpflanzungsfördernde Entwicklung von Würmern. Hier zeigt sich, dass 2-AG, eine Arachidonsäure, die Endocannabinoid enthält, für die Wiederherstellung der Dauerlarve in ihrem normalen Zyklus bei Würmern verantwortlich ist, die den Cholesterinstoffwechsel beeinträchtigt haben7.
Angesichts der kürzlich entdeckten Bedeutung der 2-AG bei der Verbesserung des Cholesterinhandels und anderer biologischer Prozesse und der geringen Bekanntheit darüber, wie Lipide diesen Prozess beeinflussen, ist eine zuverlässige Nachweismethode für dieses Endocannabinoid notwendig. Die erfolgreiche Entwicklung dieser einfachen und robusten synthetischen Methode zur Erlangung des deuterated analog 1-AG-d5 ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll.
Die meisten der gemeldeten Methoden zur Quantifizierung von Monoacylglycerolen beinhalten die Verwendung kommerziell verfügbarer analytischer Standards, die in der Regel teuer und instabil unter regelmäßigen Lagerungsbedingungen sind. Dies macht sie unbequem für Forscher, die größere Mengen an Standards und frische Vorräte benötigen. Sie sind auch für Laboratorien mit niedrigerem Budget nicht erreichbar. Diese Methode überwindet dieses Hindernis jedoch, indem sie eine Synthese der Norm unter Verwendung leichter zugänglicher Ausgangsmaterialien vorschlägt.
Bemerkenswert ist auch, dass im Gegensatz zu anderen gemeldeten Methoden (die deuterated analytische Standards von 2-substituierten Monoacylglycerolen verwenden, die unter vielen Bedingungen acylmigration leiden, so dass zwei chromatographische Spitzen gesehen werden und die relative Quantifizierung durch Isotopenverdünnung25) verwendet bei dieser Methode effizient einen 1-substituierten deuterated analytischen Standard, der ein einzelnes Isomer ist und keiner Acylmigration unterzogen wird.
Die synthetische Methode ist einfach und erfordert keine ausgeklügelten Bedingungen, was sie ideal für jedes Labor mit minimaler Ausrüstung, Budget und Zugang zu Reaktanten macht. Es ist auch eine einfache Technik, die von jedem Wissenschaftler auf dem Gebiet verwendet werden kann, ohne die Notwendigkeit für eine spezielle Ausbildung in der organischen Synthese. Die Schneckenprobenvorbereitung ist die herkömmliche Methode, ohne weitere Komplikationen. Schließlich ist die Lipidextraktionsmethode zur Gewinnung der endgültigen Proben eine Modifikation aus Folchs Protokoll24, die bessere Wiederherstellungswerte ermöglicht, da sie keine chromatographische Säulenreinigung erfordert.
Der entscheidende Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Probenvorbereitung und Lipidextraktion angemessen durchgeführt werden, um eine gute und nachweisbare Wiederherstellung des Standards zu erreichen. Es ist auch wichtig, 1) frische Lagerlösungen monatlich zu produzieren, um die Bedingungen des Standards aufrechtzuerhalten, und 2) durch NMR-Spektroskopie oder LC-MS zu überprüfen, ob der Standard noch rein ist und keiner Oxidation oder Degradation unterzogen wurde. Die einzige Einschränkung dieser Technik beruht auf ihrer Expansion auf andere Studien, die endogene 2-AG-Konzentrationen haben können, die niedriger sind als die vorgestellte LOQ. In diesem Fall sollte die Methode geändert werden, um sicherzustellen, dass die Konzentration zwischen den Grenzwerten liegt.
Im Falle eines Ausfalls während des Protokolls, in dem 1) kein sichtbares chromatographisches Signal des Standards oder 2) der Wiederherstellungswert des Standards nach der Extraktion niedriger ist als erwartet, wird empfohlen, die Probenvorbereitung und Lipidextraktion zu wiederholen. Da der synthetische Weg die Synthese eines geschützten deuterierten Glyzerinbausteins beinhaltet, der schließlich im letzten Schritt mit Arachidonsäure acylatiert wird, kann diese Methode auf die Synthese von deuterated Standards anderer Monoacylglycerine erweitert werden, Diazylglicerrole, Phospholipide und strukturell verwandte Metaboliten.
Zusammenfassend beschreibt dieses neue Verfahren eine einfache und reproduzierbare Methode zur Erkennung und Quantifizierung von 2-AG, die dazu beitragen wird, einige der unbeantworteten Fragen zur Rolle dieses Endocannabinoids in C. eleganszu beantworten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der Agencia Nacional de Promocién Cientéfica y Tecnol-gica (ANPCyT, PICT 2014-3693) unterstützt. J.F.d.L., G.P. und B.H.C. sind Fellows von CONICET. D.d.M. und G.R.L. sind Mitglieder der Forschungskarriere von CONICET. Wir danken Gonzalo Lamberto (INMET) für die LC-MS/MS Analyse und hilfreiche Diskussion. Die Videoaufnahmen und -bearbeitungen wurden von Ramiro Ortega und Maria Soledad Casasola von Direccién de Comunicacién de la Ciencia, Facultad de Ciencia Polética y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario in Rosario, Argentinien, durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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