Summary
Detta arbete beskriver en robust och enkel metod för att upptäcka och kvantifiera endocannabinoida 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deuterisk standard USA beredd och används för kvantifiering av 2-AG med Isotoputspädning och vätskekromatografi-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Detta arbete presenterar en metod för att förbereda en analytisk standard för att analysera 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) kvalitativt och kvantitativt genom vätskekromatografi-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids är bevarade Lipidmediatorer som reglerar flera biologiska processer i en mängd olika organismer. I C. elegans, 2-AG har befunnits ha olika roller, inklusive modulering av varaktighet formation och kolesterol metabolism. I denna rapport beskrivs en metod för att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaderna och stabiliteten för de deuteras standarder som krävs för beräkning av 2 AG. Förfarandet för syntes av standarden är enkel och kan utföras i alla laboratorier, utan behov av organisk syntes expertis eller särskild utrustning. Dessutom beskrivs en ändring av Folchs metod för att extrahera den deuterta standarden från kulturen i C. elegans . Slutligen beskrivs en kvantitativ och analytisk metod för att detektera 2-AG med hjälp av den stabila isotopiskt märkta analoga 1-AG-d5 , som ger pålitliga resultat i en snabb kromatografisk körning. Förfarandet är användbart för att studera de multipla rollerna av 2-AG i C. elegans och samtidigt vara tillämpliga på andra studier av metaboliter i olika organismer.
Introduction
Endocannabinoids reglera flera biologiska processer i en mängd olika organismer och bevaras Lipidmediatorer1. Den första upptäckta och mest välkarakteriserade Endocannabinoids är anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) och 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoids spela många viktiga roller, inklusive de som deltar i hjärnan belöningssystem samt narkotikamissbruk, minne, humör, och metaboliska processer2. AEA och 2-AG är endast syntetiserade när det behövs och har korta livslängder, och de bryts ned genom transport protein återupptaget och hydrolys3.
Användningen av djurmodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) har blivit viktigt att studera den stora variationen av biologiska processer inklusive apoptos, cellsignalering, cell cykel, cellpolaritet, genreglering, metabolism, åldrande, och könsbestämning4,5. Dessutom är C. elegans en utmärkt modell för att studera de fysiologiska rollerna av fleromättade fettsyror (pufas). AEA har identifierats i C. elegans och reduceras enligt diet restriktioner6. Denna brist förlänger livslängden på Nematoden genom en mekanism för dietrestriktioner som kan dämpas av tillskott med endocannabinoid. Nyligen upptäcktes att 2-AG och AEA spelar grundläggande roller i regleringen av kolesterol handel i C. elegans7. Ännu viktigare, det bestämdes att tillskott med exogena 2-AG kan rädda varaktighet gripande, som orsakas av nedsatt kolesterol handel i Niemann-Pick typ C1 C. elegans mutanter.
För att få en bättre förståelse av 2-AG: s relation med kolesterol handel och andra biologiska processer i Nematoden (dvs., monoaminerga signalering, nociception och förflyttning), är det viktigt att studera denna endogena metabolit och hur det är påverkas under vissa miljö-och diet förhållanden8,9,10,11,12,13. Därför är det viktigt att utforma och optimera en metod för att upptäcka och kvantifiera endogena 2-AG i C. elegans som är enkel att använda för forskare inom olika områden, särskilt de som studerar nematode beteende i förhållande till denna endocannabinoida.
I 2008 lyckades Lethonen och medarbetarna identifiera 2-AG och AEA i C. elegans med hjälp av LC-MS analytiska metoder14. I 2011, lyckades de att utvidga denna teknik till andra Endocannabinoids15. Nyare arbete har visat andra analytiska metoder som har varit framgångsrika i att upptäcka och kvantifiera Endocannabinoids i C. elegans, inklusive masspektrometri och GC-MS16,17,18, och det har också rapporterats att liknande analysmetoder kan utökas till andra modeller19.
Tidigare rapporterade analysmetoder som används för att kvantifiera 2-AG i biologiska prover innebär vanligtvis användning av deutderade standarder som är kommersiellt förvärvade och kräver tillgänglighet för köpet20,21. Många analytiska standarder för LC-MS/MS kvantifiering av Endocannabinoids är kommersiellt tillgängliga från olika leverantörer. Ändå, de är dyra, är känsliga, och blir oxiderade över tiden, på grund av närvaron av flera dubbelbindningar. De vanligaste versionerna av dessa standarder är baserade på den Octa-deutiska arakidsyran och är lämpliga för kvantifiering genom Isotoputspädning LC-MS/MS14,22. Också, de flesta av dessa standarder ersätts i läge 2 av glycerol, vilket gör dem instabila under de flesta förhållanden eftersom de är benägna att Acyl migration19,23.
För att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaderna och stabiliteten i dessa deutade standarder, en bekväm och enkel metod presenteras för att förbereda en analytisk standard baserad på glycerol-d5. Sekvensen för att förbereda den Penta-deutererade standarden kräver ett tre stegs förfarande som resulterar i standard 1-AG-d5, som är stabil och inte genomgår Acyl migration (den viktigaste frågan när man siktar på att syntetisera 2-monoacylglycerols).
Det huvudsakliga målet här är att visa en enkel och reproducerbar metod för att studera 2-AG i C. elegans, inklusive syntesen av den analytiska deutererstandarden, beredning och extraktion av nematodproverna, och analys av LC-MS/MS (figur 1 ). Detta syntetiska förfarande är uppnåeligt utan sofistikerade organiska syntes kunskap eller speciell utrustning, vilket gör det lämpligt för forskare från olika områden som studerar C. elegans beteende under endocannabinoida inflytande. Metoden är också utbyggbar till andra studiemodeller, vilket gör den användbar för olika mål. Standarden, som utarbetats som rapporterats här, har tillämpats för att framgångsrikt utveckla en snabb och tillförlitlig kromatografisk metod som möjliggör effektiv detektering och kvantifiering av 2-AG på ett reproducerbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.1-AG-d5 förberedelse
Anmärkning: för att erhålla 1-AG-d5 som en deuterad intern standard för kvantifiering analyser, följ protokollet som beskrivs nedan.
- Differentiellt skydd
- För att endast skydda primära alkoholer, tillsätt först 38 mg glycerol-d8 till en 10 ml reaktions slang med en Pasteur pipett och tillsätt en magnetisk omrörare.
- Tillsätt 5 mL vattenfri diklormetan (DCM) med hjälp av en 5 mL Hamilton-spruta och fyll röret med torrt N2 för att ge en inert atmosfär.
- Förbered ett bad med en grund Dewar kolv fylld med destillerat etylacetat.
- Montera det hermetiskt slutna reaktionsröret inuti badet och kyla det genom att sakta tillsätta vätska N2 till etylacetat tills spädningsvätskan är fryst.
Försiktighet: vätska våldsamt kokar vid rumstemperatur (RT) och kan orsaka svåra brännskador vid kontakt med ögon och hud. - Tillsätt 54 mg vattenfri collidine med en Hamilton spruta.
Varning: Collidine är flyktig och har en mycket stark och obehaglig doft. - Tillsätt 70 mg tert-butyldimetylsilylklorid och rör om hela lösningen i 3 h vid-78 ° c på en magnetisk omrörare.
- Efter 3 h, lämna reaktionen att värma vid RT och hålla omrörning för ytterligare 12 h.
- Tillsätt 2 mL saltlösning för att släcka reaktionen.
- Extrahera lösningen 3x med 2 mL destillerad diklormetan med hjälp av en separertratt, spara det organiska extraktet varje gång.
- Kombinera de tre organiska extrakten och torka dem över natriumsulfat.
- Avdungra diklormetan under reducerat tryck i en vakuum roterande indunstare noggrant för att undvika lösningsmedel projektioner.
- Rena den råa blandningen genom kolonnkromatografi med kiselgel som stationär fas och en 10% ökande hexan/etylacetat gradient, med början från 100% hexan och efter behandling med 100% etylacetat.
- Kombinera de produkt-innehållande fraktioner och ta bort lösningsmedlet under reducerat tryck i en vakuum roterande indunstare för att få den rena 1-O, 3-O-bis-(TBDMS) glycerol-d5 som en färglös vätska.
- Esterification
- Tillsätt 10 mg av 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-glycerol-d5 (tidigare syntetiserade) till ett 10 ml reaktionsrör med en pastorpipett och tillsätt en magnetisk omrörare.
- Tillsätt 2 mL vattenfri diklormetan med en 5 mL Hamilton-spruta och fyll röret med torrt N2 för att ge en inert atmosfär.
- Kyllösningen till 0 ° c med hjälp av ett isbad.
- Tillsätt 36 mg arakidonsyra Acid med en flervolyms justerbar mikropipett och rör om.
- Tillsätt 15 mg 4-dimethylaminopyridine och rör om.
- Tillsätt 15 mg N,, N'-diisopropylcarbodiimide med en flervolyms justerbar mikropipett och rör om.
- Låt blandningen reagera vid 0 ° c i 3 h.
- Efter 3 h, lämna reaktionen att värma vid RT och hålla omrörning för ytterligare 12 h.
- Tillsätt 2 mL vatten för att släcka reaktionen.
- Extrahera den organiska lösningen 3x med 2 mL destillerad diklormetan (DCM) med hjälp av en separertratt.
- Placera de tre organiska extrakten i samma tub och torka dem över natriumsulfat.
- Avdungra diklormetan under reducerat tryck i en vakuum roterande indunstare noggrant för att undvika lösningsmedel projektioner.
- Rena den råa blandningen genom kolonnkromatografi med kiselgel som stationär fas och en 10% ökande hexan/etylacetat gradient, med början från 100% hexan och efter behandling med 50% hexan/50% etylacetat.
- Kombinera de produkt-innehållande fraktioner och ta bort lösningsmedlet under reducerat tryck i en vakuum roterande indunstare för att få den rena 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 som en gulaktig vätska.
- Deprotection
- Tillsätt 15 mg av 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 (tidigare syntetiserade) till ett 10 ml reaktionsrör med en Pasteur-pipett och tillsätt en magnetomrörare.
- Tillsätt 2 mL vattenfri THF med en 5 mL Hamilton-spruta och fyll röret med torrt N2 för att ge en inert atmosfär.
- Kyllösningen till 0 ° c med hjälp av ett isbad.
- Tillsätt 150 μL droppvis av 1 M Tetrabutylammoniumfluorid lösning i THF med hjälp av en Hamilton spruta.
- Låt reaktionen värma till RT och rör om i 1 h.
- Efter 1 h, tillsätt 2 mL vatten för att släcka reaktionen.
- Extrahera lösningen 3x med 2 mL destillerad diklormetan med hjälp av en separertratt.
- Kombinera de tre organiska extrakten och torka dem över natriumsulfat.
- Avdungra diklormetan under reducerat tryck i en vakuum roterande indunstare för att få den rena 1-AG-d5 som en gulaktig vätska.
- Övervaka alla reaktioner genom tunnskiktskromatografi utförd på kiselgel 60 F254 förbelagda aluminiumplåtar. Visualisera banden under en 254 nm UV-lampa efter färgning med en etanollösning av 4-anisaldehyd.
2. beredning av standardlager och mätlösningar
- Lös 1 mg av den interna standarden 1-AG-d5 i 1 ml ACN och Sonikera i 1 min för att erhålla 1 000 ppm standard stamlösning.
- För att förbereda 1 000 ppb-lösning som används för kvantifiering i maskar, Förbered först en 10 ppm-lösning: ta 10 μL av stamlösningen med en Hamilton-spruta och späd den till en slutlig volym på 1 mL genom att tillsätta 990 μL ACN.
- Ta 100 μL från den lösning som producerades i steg 2,2 med en Hamilton-spruta och späd den till en slutlig volym på 1 mL genom att tillsätta 900 μL ACN för att erhålla den 1 000 ppb-lösning som används för kvantifiering.
- Sonikera för 1 min mellan varje steg för att säkerställa fullständig solubilisering. Förvara lösningarna vid-78 ° c för att bibehålla koncentrationerna och integriteten i standarderna. Efter standardlösningen används, flöde lite kväve innan du stänger injektionsflaskan för att förhindra oxidation.
3. tillväxt och underhåll av C. elegans
Anmärkning: utsäde Nematoden Growth medium (NGM) agar plattor med E. coli OP50 och propagera maskar på dessa plattor.
- Blanda 3 g NaCl med 17 g agar.
- Tillsätt 2,5 g Peptone och tillsätt sedan 975 mL H2O.
- Autoklav för 50 min, sedan svalna kolven till 55 ° c.
- Blanda följande: 1 mL 1 M CaCl2, 1 ml 1 m MgSO4, 25 ml 1 m KH2Po4 -buffert (som alla tidigare varit autoklaverade) och 1 ml 5 mg/ml kolesterol i etanol.
- Samtidigt bibehålla en steril miljö, fördela NGM lösningen i 60 mm petriskålar, fylla plattorna till två tredjedelar av sin volym. Förvara plattorna vid 4 ° c.
- Strimma E. coli bakteriekulturen från a-80 ° c glycerol lager på lb agar plattan. Låt den växa på plattan över natten vid 37 ° c.
- Plocka upp en enda koloni att Inokulera 100 mL flytande LB över natten vid 37 ° c med agitation.
Obs: det är inte nödvändigt att kontrollera O.D. eftersom denna stam kan nå stationär fas under denna tid. - Ta bort de lagrade NGM-plattorna, ta bort locken i laminarflödeshuven och lämna öppna för att tillåta avdunstning av överflödig fukt från plattorna.
- När plattorna är torkade, Använd en Pasteur pipett för att lägga 100 μL av OP50 E. coli till mitten av plattan utan att sprida.
- Lämna OP50 E. coli gräsmattan att växa över natten vid RT eller vid 37 ° c för 8 h.
- Tillsätt önskat antal mask embryon erhållna genom hypokloritbehandling eller "blekning" (avsnitt 4).
Obs: Kylplattorna till RT före tillsats av maskar.
4. blekning teknik för synkronisering av C elegans kulturer
- Utsäde och bit maskar på 6 cm NGM tallrikar.
- Låt maskarna växa i 2-3 dagar för att få tillräckligt med ägg och dräktiga vuxna på tallriken.
- När det finns tillräckligt med ägg/vuxna, Häll 5 mL M9 på plattan.
- Överför maskarna till ett 15 mL centrifugrör med hjälp av en glaspipett.
- Centrifugera röret i 2 min vid 2 000 x g och pellets maskarna.
- Sug ut de flesta av M9, undvika störning av masken pellet.
- Tillsätt 3 mL blekning lösning (2:1:1 förhållandet mellan NaOH: NaOCl: H2O).
- Vänd försiktigt för att blanda lösningen i 5 min eller tills antalet intakta vuxen maskar minskar.
FÖRSIKTIGHET: Använd inte blekmedel i mer än 5 min. - Centrifugera i 1 min vid 2 000 x g och sug upp det mesta av bleknings lösningen utan att störa masken pellet.
- Tillsätt 15 mL M9 och blanda väl.
- Centrifugera igen vid 2000 x g i 1 min.
- Sug ut de flesta av M9 utan att störa masken pellet.
- Upprepa steg 4.10-4.12 en eller två gånger till.
- Tillsätt 5 mL färsk M9 och agitera.
- Låt Äggen kläcks över natten med mjukt gungande.
5. mask provberedning
- Låt de N2-embryon som erhålls genom bleknings förfarandet kläcks över natten i M9-buffert (5 mL i ett 15 mL centrifugeringsrör) vid 20 ° c.
- Skörda den synkroniserade L1s genom centrifugering röret för 2 min vid 2 000 x g.
- Tvätta maskar med M9 buffert 1x, sedan kvantifiera antalet levande L1 maskar.
- Utsäde cirka 10 000 maskar i NGM plattor (10 cm i diameter) med 1 mL OP50 E. coli (tidigare torkade).
- Inkubera plattorna för 48 h vid 20 ° c tills maskar når L4-stadiet.
- Skörda maskar med kallt M9 buffert i en 15 mL Centrifugera röret, tvätta dem 1x, sedan och överföra dem till en 1,5 mL rör.
- Pellets maskarna genom centrifugering vid 2 000 x g för 1 min, eliminera de flesta av supernatanten, sänk rören i flytande kväve, och förvara vid-80 ° c.
6. lipid utvinning
- Tina cirka 100 μL frysta mask pellets som tillhör N2 på is, tillsätt 1,3 mL metanol och Sonikera provet i 4 min.
- Tillsätt 2,6 mL kloroform, och 1,3 mL av 0,5 M KCl/0.08 M H3Po4 till en slutlig kvot på 1:2:1, 1 000 ppb av den interna standarden 1-AG-d5, och butylerad hydroxytoluen som en antioxidant agent vid en slutkoncentration av 50 μg/ml.
- Vortex proverna för 1 min och Sonikera i ett ultraljud vattenbad för 15 min på is.
- Vortex proverna 2x för 1 min och Centrifugera i 10 min vid 2 000 x g för att inducera fasseparation.
- Samla den undre fasen och samla in den i ett rent rör, torka den under kväve och Omsuspendera den fasta återstoden i 100 μL av ACN.
7. endocannabinoid analys av HPLC-MS/MS
- Använd vätskekromatografi tillsammans med en ESI Triple fyrpolig masspektrometer för att detektera och kvantifiera 2-AG från nematodprover.
- Använd följande förhållande för HPLC med omvänd fas: från 0,0-0,5 min H2o:acn (40:60), 0.5-6.5 min h2o:acn (40:60) till (25:75), 6.5-7.5 min h2o:ACN (25:75), 7.5-8.0 min h2o:ACN (25:75) till (40:60), 8.0-12,0 min h2O: ACN (40:60).
- Behåll kolonntemperaturen vid 40 ° c och Ställ in temperaturen för autosampler-facket på 10 ° c.
- Ställ in följande joniseringsförhållanden: Positive-Ion-läge; torknings gas (N2) temperatur = 300 ° c; torkning gas flöde = 10 L/min; nebulisator tryck = 10 UA; och mössa. spänning = 4 kV.
- För analytedetektering, Använd MRM med följande övergångar: 379,2 m/z till 289,2 m/z för 2-AG; och 384,2 m/z till 289,2 m/z för 1-AG-d5.
8. kvantifiering av endocannabinoid i maskar
- Använd den deutade interna standarden 1-AG-d5 och beräkna Analytens topp områdes förhållanden till den interna standarden.
- Använd följande övergångar: 384,2 m/z till 287,2 m/z för 2-AG; och 379,2 m/z till 287,2 m/z för 1-AG-d5.
- Beräkna koncentrationen av den endogena 2-AG genom att jämföra med de högsta områdes kvoterna för den deutärdade standarden med hjälp av koncentrationens värde av standarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En isotopiskt märkt analog har framgångsrikt syntetiserats från kommersiellt tillgängliga d8-glycerol och arakidonsyra Acid med en 3-stegs syntetisk metod (figur 2, figur 3). Dessa steg är enkla och kräver inte sofistikerad utrustning, särskilt kontrollerade förhållanden, eller dyra reagenser. Sålunda, denna metod är robust och kan framgångsrikt utvidgas till att syntetisera monoacylglycerides som innehåller olika fettsyror.
1-AG-d5 präglades strukturellt med hjälp av kärnmagnetisk spektroskopi. 1 H NMR visade den karakteristiska multipletten på 5,44 ppm till 4,93 ppm, som integrerar för de åtta vinyl protoner av arachidonoyl kedjan och triplett på 2,40 ppm, vilket motsvarar de två protoner av alfa position till Karbonylklorid gruppen. I 2D NMR, är det också möjligt att se en 2,9 ppm till 2,7 ppm multiplet assignable till fem deuterium av glycerol portion.
Den kemiskt syntetiserade 1-AG-d5 användes som en intern standard i C. elegans prover. Standarden lades till proverna innan extraktion sedan extraheras med endogena lipider, med hjälp av en enkel metod som anpassats från Folch24. Denna modifierade metod ger ett högt återvinningsvärde av standarden, vilket framgår av HPLC-kvantifiering.
Metoden optimerades med övergångarna 1) 384,2 m/z till 287,2 m/z för 2-AG och 2) 379,2 m/z till 287,2 m/z för 1-AG-d5, där glycerolmolekylerna går förlorade (figur 4). Detektionsgränserna (LOD) och kvantifiering (LOQ) beräknades för standarden med hjälp av en kalibreringskurva, vilket resulterade i värden på 5 ppb respektive 16,6 ppb. Retentionstiden för standarden var 6,8 min.
2-AG endogena från C. elegans proverna detekterades framgångsrikt och kvantifierades genom isotopisk utspädning med den kemiskt syntetiserade 1-AG-d5 med HPLC-MS/MS (figur 5).
Eftersom de ursprungliga koncentrationerna av de deuturade standarderna i proverna 1 och 3 var 1 000 ppb, var det från topparea kvoten möjligt att beräkna den endogena koncentrationen av 2-AG vid 340 ppb för prov 1 och 360 ppm för prov 3, vilket ger ett genomsnitt på 350 ppm ( Tabell 1).
Figur 1: Sammanfattning av syntes, mask provtagning och kvantifiering. För att uppnå en lyckad kvantifiering av den endogena 2-AG, var det nödvändigt att syntetisera dess deutereras analog med hjälp av en tre-stegs sekvens. Efteråt, det lades till Worm prover, extraherade, och analyseras av HPLC-MS/MS. används som en intern standard, syntetiska av 1-AG-d5 var det verktyg som används för att kvantifiera den endogena metaboliten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: syntetiskt system för att erhålla 1-AG-d5. En massa på 10 mg av den deutererade analoga erhölls med hjälp av den trestegs metod som omfattar 1) skydd av glycerol-d8, 2) acylering med arakidsyra, och 3) deprotection. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kemisk struktur för isotopiskt märkta 2-AG analog. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: utvalda fragmenteringar för kvantifiering av 1-AG-d 5 och 2-AG. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: HPLC-kromatogram för 1-AG-d5 och 1-AG som rena standarder och interna standarder i ett mask prov. Det var möjligt att analysera retentionstider och se att 1) masken verkar inte ha endogena 1-AG och 2) det skulle bara ha 2-AG, men standarden 1-AG-d5 kommer fortfarande att fungera som en bra analytisk standard för kvantifiering genom Isotoputspädning. Övergångarna som användes var: 384,2 m/z till 287,2 m/z för 2-AG, och 379,2 m/z till 287,2 m/z för 1-AG-d5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1-AG-d5 | 2-AG | Förhållande (2-AG/1-AG-d5) | |
| Prov 1 | 71964,74 | 210616,08 | 0,34 |
| Prov 3 | 74311,36 | 205648,43 | 0,36 |
Tabell 1: nyckeltal för den deutdade standarden och endogena 2-AG. Kvoterna beräknades som en kvot mellan topp områdena 2-AG och 1-AG-d5 för två isolerade prover, båda med deuterad standard tillsatt före extraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endocannabinoids är en klass av lipider som har varit inblandade i regleringen av varaktighet formation i C. elegans7. Mer specifikt är syntesen av fleromättade fettsyror (PUFAs) viktigt för kolesterol handel och reproduktiva utvecklingen av maskar. Det avslöjas här att 2-AG, en arakidonsyra syra innehåller endocannabinoid, är ansvarig för att restitutera den varaktighet larv till sin normala cykel i maskar som har nedsatt kolesterol metabolism7.
Med tanke på den nyligen upptäckta betydelsen av 2-AG i förbättringen av kolesterol handel och andra biologiska processer och hur lite är känt om hur lipider påverka denna process, en tillförlitlig detektionsmetod för denna endocannabinoida är nödvändigt. Den framgångsrika utvecklingen av denna enkla och robusta syntetiska metod för att erhålla den deuterta analoga 1-AG-d5 är ett centralt steg i detta protokoll.
De flesta av de rapporterade metoderna för att kvantifiera monoacylglyceroler innebär användning av kommersiellt tillgängliga analytiska standarder, som vanligtvis är dyra och instabila under normala lagringsförhållanden. Detta gör dem obekvämt för forskare som behöver större mängder av standarder och färska bestånd. De är också oåtkomliga för lägre budget laboratorier. Men denna metod övervinner detta hinder genom att föreslå syntes av standarden med hjälp av mer tillgängliga utgångsmaterial.
Det är också anmärkningsvärt att i motsats till andra rapporterade metoder (som använder deuterade analytiska normer för 2-substituerade monoacylglycerols som lider Acyl-migration under många förhållanden, så att två kromatografiska toppar ses och påverkar den relativa kvantifiering genom isotopisk utspädning25), använder denna metod effektivt en 1-substituerad deutererade analytisk standard, som är en enda isomer och inte genomgår Acyl-migration.
Den syntetiska metoden är enkel och kräver inga sofistikerade förhållanden, vilket gör den idealisk för alla laboratorier som har minimal utrustning, budget, och tillgång till reaktanter. Det är också en enkel teknik som kan användas av alla forskare som arbetar på området, utan behov av särskild utbildning i organisk syntes. Masken provberedning är den konventionella metoden, utan ytterligare komplikationer. Slutligen, lipid utvinning metod för att få de slutliga proverna är en modifiering från Folch protokoll24 som möjliggör bättre återhämtning värden, eftersom det inte kräver kromatografisk kolonnrening.
Det kritiska steget är att se till att provberedning och lipid utvinning utförs på ett adekvat sätt för att uppnå god och detekterbar återhämtning av standarden. Det är också viktigt att 1) producera färska lagerlösningar varje månad för att bibehålla villkoren i standarden och 2) kontrollera med NMR-spektroskopi eller LC-MS att standarden är fortfarande ren och har inte genomgått oxidation eller nedbrytning. Den enda begränsningen av denna teknik förlitar sig i sin expansion till andra studier som kan ha endogena 2-AG koncentrationer lägre än den presenterade LOQ. I detta fall bör metoden ändras för att säkerställa att koncentrationen faller mellan gränserna.
Vid fel under protokollet, i vilket 1) det inte finns någon synlig kromatografisk signal av standarden eller 2) återvinningsvärdet av standarden efter extraktion är lägre än väntat, det rekommenderas att upprepa provberedning och lipid utvinning. Eftersom den syntetiska rutten innebär syntes av en skyddad deuterad glycerol byggsten som slutligen acylated med arakidonic syra i det sista steget, denna metod kan utvidgas till syntesen av deuterade standarder av andra monoacylglycerols, diacylgliceroler, fosfolipider och strukturellt relaterade metaboliter.
Sammanfattnings, detta nya förfarande beskriver en enkel och reproducerbar metod för att upptäcka och kvantifiera 2-AG, som kommer att bidra till att lösa några av de obesvarade frågor om rollen av denna endocannabinoida i C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., och B.H.C. är stipendiater från CONICET. D.d.M. och GRL är medlemmar i forskningskarriären för CONICET. Vi är tacksamma för att Gonzalo Lamberto (INMET) för LC-MS/MS analys och hjälpsam diskussion. Videoupptagning och-redigering har gjorts av Ramiro Ortega och María Soledad Casasola från Dirección de Comunicación de La Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M.
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
