Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Syntese af en deutereret standard for kvantificering af 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

Published: September 21, 2019 doi: 10.3791/59882
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,3
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

Summary

Dette arbejde beskriver en robust og ligetil metode til at detektere og kvantificere endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deutereret standard os tilberedt og anvendt til kvantificering af 2-AG ved isotop fortynding og væskekromatografi-elektro spray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Dette arbejde præsenterer en metode til at udarbejde en analytisk standard til analyse af 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) kvalitativt og kvantitativt ved væskekromatografi-elektro spray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoider er bevaret lipid mediatorer, der regulerer flere biologiske processer i en række organismer. I C. elegans, 2-AG har været fundet at besidde forskellige roller, herunder graduering af Dauer dannelse og kolesterol metabolisme. I denne rapport beskrives en metode til at overvinde de vanskeligheder, der er forbundet med omkostninger og stabilitet i de deutererede standarder, der kræves til kvantificering af 2 AG. Proceduren for syntesen af standarden er enkel og kan udføres i ethvert laboratorium, uden behov for organisk syntese ekspertise eller særligt udstyr. Desuden er en ændring af Folch metode til at udtrække den er standard fra C. elegans kultur er beskrevet. Endelig beskrives en kvantitativ og analytisk metode til påvisning af 2-AG ved hjælp af den stabile isotopisk mærkede analoge 1-AG-d5 , som giver pålidelige resultater i en hurtig kromatografisk kørsel. Proceduren er nyttig til at studere de mange roller 2-AG i C. elegans , mens også gælder for andre undersøgelser af metabolitter i forskellige organismer.

Introduction

Endocannabinoider regulere flere biologiske processer i en række organismer og er bevaret lipid mediatorer1. De første opdagede og mest velkarakteriserede endocannabinoider er anandamid (arachidonoylethanolamid, AEA) og 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoider spille mange kritiske roller, herunder dem, der er involveret i hjernen belønning systemer samt stofmisbrug, hukommelse, humør, og metaboliske processer2. AEA og 2-AG er kun syntetiseret når det er nødvendigt og har korte levetid, og de nedbrydes gennem transport protein reuptake og hydrolyse3.

Brugen af dyremodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) er blevet vigtigt at studere de mange forskellige biologiske processer, herunder apoptose, celle signalering, celle cyklus, celle polaritet, genregulering, metabolisme, aldring, og kønsbestemmelse4,5. Derudover er C. elegans en glimrende model til at studere de fysiologiske roller af flerumættede fedtsyrer (pufas). AEA er blevet identificeret i C. elegans og er reduceret under kosten begrænsning6. Denne mangel forlænger levetiden af fyrretræsnematoden gennem en kost begrænsning mekanisme, der kan undertrykkes af tilskud med endocannabinoid. For nylig blev det opdaget, at 2-AG og AEA spiller grundlæggende roller i reguleringen af kolesterol handel i C. elegans7. Endnu vigtigere, det blev fastslået, at tilskud med udefrakommende 2-AG kan redde Dauer anholdelse, som er forårsaget af den svækkede kolesterol handel i Niemann-pick type C1 C. elegans mutanter.

For at få en bedre forståelse af 2-ag's forhold til kolesterol handel og andre biologiske processer i fyrretræsnematoden (dvs. monoaminerge signalering, nociception og bevægelse), er det afgørende at studere denne endogene metabolit og hvordan det er påvirket under visse miljømæssige og ernæringsmæssige forhold8,9,10,11,12,13. Derfor er det bydende nødvendigt at designe og optimere en metode til at detektere og kvantificere endogene 2-AG i C. elegans , der er enkel at bruge for forskere i forskellige områder, især dem, der studerer nematode adfærd i forhold til denne endocannabinoide.

I 2008 lykkedes det for Leth onen og kolleger at identificere 2-AG og AEA i C. elegans ved hjælp af LC-MS analytiske metoder14. I 2011, de formåede at udvide denne teknik til andre endocannabinoider15. Nyere arbejde har vist andre analytiske metoder, der har haft succes med at påvise og kvantificere endocannabinoider i C. elegans, herunder massespektrometri og GC-MS 16,17,18, og det har også blevet rapporteret, at lignende analytiske metoder kan udvides til andre modeller19.

Tidligere rapporterede analysemetoder, der anvendes til kvantificering af 2-AG i biologiske prøver, indebærer normalt brug af deutererede standarder, der er erhvervet kommercielt, og som kræver tilgængelighed for købet20,21. Mange analytiske standarder for LC-MS/MS kvantificering af endocannabinoider er kommercielt tilgængelige fra forskellige udbydere. Ikke desto mindre, de er dyre, er følsomme, og bliver oxideret over tid, på grund af tilstedeværelsen af flere dobbelt obligationer. De mest almindeligt forekommende versioner af disse standarder er baseret på den OCTA-deutererede arachidonsyre og egner sig til kvantificering ved isotop fortynding LC-MS/MS14,22. Også, de fleste af disse standarder er erstattet i position 2 af glycerol, hvilket gør dem ustabile under de fleste betingelser, da de er tilbøjelige til acyl migration19,23.

For at overvinde vanskelighederne forbundet med omkostningerne og stabiliteten af disse er standarder, en bekvem og enkel metode er præsenteret for at udarbejde en analytisk standard baseret på glycerol-d5. Sekvensen til at forberede Penta-deuterated standard kræver en tre-trins procedure, der resulterer i standard 1-AG-d5, som er stabil og ikke undergår acyl migration (det vigtigste spørgsmål, når de sigter mod at syntetisere 2-monoacylglyceroler).

Hovedformålet er her at vise en enkel og reproducerbar metode til at studere 2-AG i C. elegans, herunder syntesen af den analytiske er standard, klargøring og ekstraktion af fyrretræsnematoden prøverne, og analyse af LC-MS/MS (figur 1 ). Denne syntetiske procedure er opnåelig uden den sofistikerede organiske syntese viden eller specialudstyr, hvilket gør det velegnet til forskere fra forskellige områder, der studerer C. elegans opførsel under endocannabinoide indflydelse. Metoden kan også udvides til andre studie modeller, hvilket gør den anvendelig til forskellige mål. Standarden, udarbejdet som rapporteret her, er blevet anvendt til med succes at udvikle en hurtig og pålidelig kromatografi metode, der giver mulighed for effektiv påvisning og kvantificering af 2-AG i en reproducerbar måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.1-AG-d5 forberedelse

Bemærk: for at opnå 1-AG-d5 som en deutereret intern standard for kvantificerings analyser, Følg protokollen som beskrevet nedenfor.

  1. Differentieret beskyttelse
    1. For kun at beskytte primære alkoholer skal der først tilsættes 38 mg glycerol-d8 til et 10 ml reaktions slange med en Pasteur-pipette og tilsættes en magnetisk omrører.
    2. Der tilsættes 5 mL vandfri dichlormethan (DCM) ved hjælp af en 5 mL Hamilton-sprøjte, og røret fyldes med tør N2 for at give en inaktiv atmosfære.
    3. Forbered et bad ved hjælp af en lavvandet Dekrigs kolbe fyldt med destilleret ethylacetat.
    4. Den hermetisk lukkede reaktions slange monteres i badet og afkøles ved langsomt at tilsætte væske N2 til ethylacetat, indtil solvensen er frosset.
      Forsigtig: væske koger voldsomt ved stuetemperatur (RT) og kan forårsage alvorlige forbrændinger ved kontakt med øjne og hud.
    5. Tilsæt 54 mg vandfri collidin ved hjælp af en Hamilton-sprøjte.
      Forsigtig: Collidine er flygtige og har en meget stærk og ubehagelig duft.
    6. Tilsæt 70 mg tert-butyldimethylsilylchlorid og rør hele opløsningen i 3 timer ved-78 °C på en magnetisk omrører.
    7. Efter 3 h, lad reaktionen til at varme på RT og holde omrøring for yderligere 12 h.
    8. Tilsæt 2 mL saltlage for at slukke reaktionen.
    9. Opløsningen udtrækkes 3x med 2 mL destilleret dichlormethan ved hjælp af en skilletragt, hvorved det organiske ekstrakt gemmes hver gang.
    10. Kombiner de tre organiske ekstrakter og tør dem over natriumsulfat.
    11. Dichlormethan fordampes under reduceret tryk i en vakuum rotationsfordamper omhyggeligt for at undgå opløsningsmiddel projektioner.
    12. Den rå blanding ved kolonne kromatografi renser ved hjælp af silicagel som stationær fase og en 10% stigende hexan/ethylacetat gradient, begyndende fra 100% hexan og efter behandling med 100% ethylacetat.
    13. Kombiner de produkt indeholdende fraktioner og fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk i en vakuum roterende fordamper for at opnå den rene 1-O, 3-O-bis-(TBDMS) glycerol-d5 som en farveløs væske.
  2. Esterificering
    1. Tilsæt 10 mg af 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-glycerol-d5 (tidligere syntetiseret) til et 10 ml reaktions slange ved hjælp af en Pasteur-pipette og tilsæt en magnetisk omrører.
    2. Der tilsættes 2 mL vandfri dichlormethan ved hjælp af en 5 mL Hamilton-sprøjte, og røret fyldes med tør N2 for at give en inaktiv atmosfære.
    3. Afkøl opløsningen til 0 °C ved hjælp af et isbad.
    4. Tilsæt 36 mg arachidonsyre ved hjælp af en multi-volume justerbar mikropipette og rør.
    5. Tilsæt 15 mg af 4-dimethylaminopyridin og rør.
    6. Tilsæt 15 mg N, N'-diisopropylcarbodiimide ved hjælp af en multi-volume justerbar mikropipette og rør.
    7. Lad blandingen reagere ved 0 °C i 3 timer.
    8. Efter 3 h, lad reaktionen til at varme på RT og holde omrøring for yderligere 12 h.
    9. Tilsæt 2 mL vand for at slukke for reaktionen.
    10. Udpak den organiske opløsning 3x med 2 mL destilleret dichlormethan (DCM) ved hjælp af en skilletragt.
    11. Placer de tre organiske ekstrakter i samme rør og tør dem over natriumsulfat.
    12. Dichlormethan fordampes under reduceret tryk i en vakuum rotationsfordamper omhyggeligt for at undgå opløsningsmiddel projektioner.
    13. Den rå blanding ved kolonne kromatografi renser ved hjælp af silicagel som stationær fase og en 10% stigende hexan/ethylacetat gradient, begyndende fra 100% hexan og efter behandling med 50% hexan/50% ethylacetat.
    14. Kombiner de produkt indeholdende fraktioner, og fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk i en vakuum rotationsfordamper for at opnå den rene 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 som en gullig væske.
  3. Debeskyttelse
    1. Der tilsættes 15 mg 1-O, 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-d5 (tidligere syntetiseres) til et 10 ml reaktions slange ved hjælp af en Pasteur-pipette og tilsættes en magnetisk omrører.
    2. Der tilsættes 2 mL vandfri THF ved hjælp af en 5 mL Hamilton-sprøjte, og røret fyldes med tør N2 for at give en inaktiv atmosfære.
    3. Afkøl opløsningen til 0 °C ved hjælp af et isbad.
    4. Tilsæt 150 μl dråbevis af 1 M tetrabutylammoniumhydroxid fluorid opløsning i THF ved hjælp af en Hamilton sprøjte.
    5. Lad reaktionen varme til RT og rør i 1 h.
    6. Efter 1 time tilsættes 2 mL vand for at slukke reaktionen.
    7. Opløsningen udtrækkes 3x med 2 mL destilleret dichlormethan ved hjælp af en skilletragt.
    8. Kombiner de tre organiske ekstrakter og tør dem over natriumsulfat.
    9. Dichlormethan fordampes under reduceret tryk i en vakuum rotationsfordamper for at opnå den rene 1-AG-d5 som en gullig væske.
  4. Overvåg alle reaktioner ved tyndtlagkromatografi udført på silicagel 60 F254 præbelagte aluminiumsplader. Visualiser båndene under en 254 nm UV-lampe efter farvning med en ethanolisk opløsning af 4-anisaldehyd.

2. klargøring af standardlager-og måleopløsninger

  1. 1 mg af den interne standard 1-AG-d5 opløses i 1 ml ACN og sonikere i 1 min. for at opnå 1.000 ppm standard stamopløsning.
  2. For at klargøre den 1.000 PPB-opløsning, der anvendes til kvantificering i orme, skal du først tilberede en 10 ppm-opløsning: Tag 10 μL af stamopløsningen ved hjælp af en Hamilton-sprøjte, og fortynd den til et endeligt volumen på 1 mL ved at tilføje 990 μL ACN.
  3. Tag 100 μL fra opløsningen fremstillet i trin 2,2 ved hjælp af en Hamilton-sprøjte, og fortynd den til et endeligt volumen på 1 mL ved at tilsætte 900 μL ACN for at opnå den 1.000 PPB-opløsning, der anvendes til kvantificeringen.
  4. Sonicate i 1 min mellem hvert trin for at sikre fuldstændig solubilisering. Løsningerne skal opbevares ved-78 °C for at opretholde standarderne og integriteten. Når standardopløsningen er brugt, skal du flyde nogle nitrogen, før du lukker hætteglasset for at forhindre oxidation.

3. vækst og vedligeholdelse af C. elegans

Bemærk: frø fyrretræsnematoden vækstmedium (NGM) agar plader med E. coli OP50 og udbrede orme på disse plader.

  1. Bland 3 g NaCl med 17 g agar.
  2. Tilsæt 2,5 g pepton, og tilsæt derefter 975 mL H2O.
  3. Autoklave i 50 min., afkøles kolben til 55 °C.
  4. Bland følgende: 1 mL 1 M CaCl2, 1 ml 1 m mgso4, 25 ml 1 m KH2po4 buffer (alle tidligere har været autoklave) og 1 ml 5 mg/ml kolesterol i ethanol.
  5. Mens der opretholdes et sterilt miljø, dispenserer NGM-opløsningen til 60 mm Petri plader og fylder pladerne til to tredjedele af deres volumen. Pladerne opbevares ved 4 °C.
  6. Strejf E. coli bakteriel kultur fra a-80 °c glycerol bestand på lb agar pladen. Lad det vokse på pladen natten over ved 37 °C.
  7. Saml en enkelt koloni op for at inokulere 100 mL flydende LB natten over ved 37 °C med agitation.
    Bemærk: det er ikke nødvendigt at kontrollere OD, fordi denne stamme kan nå stationær fase i løbet af denne tid.
  8. Fjern de lagrede NGM-plader, Fjern lågene i laminar flow hætten, og lad den stå åben for at tillade fordampning af overskydende fugt fra pladerne.
  9. Når pladerne er tørret, brug en Pasteur pipette til at tilføje 100 μL af OP50 E. coli til midten af pladen uden at sprede.
  10. Lad OP50 E. coli plænen vokse natten over ved rt eller ved 37 °c i 8 timer.
  11. Tilsæt det ønskede antal orme embryoner opnået ved hypochlorit behandling eller "blegning" (punkt 4).
    Bemærk: Afkøl pladerne til RT før tilsætning af orme.

4. blegning teknik til synkronisering C elegans kulturer

  1. Frø og chunk orme på 6 cm NGM plader.
  2. Lad ormene vokse i 2-3 dage for at få et tilstrækkeligt antal æg og gravid voksne på pladen.
  3. Når der er nok æg/voksne, hæld 5 mL M9 på pladen.
  4. Ormene overføres til et 15 mL centrifugerør med en glas pipette.
  5. Centrifuger røret i 2 min ved 2.000 x g og pellet ormene.
  6. Suge de fleste af M9, undgå forstyrrelse af ormen pellet.
  7. Tilsæt 3 mL blegning opløsning (2:1:1 forholdet mellem NaOH: NaOCl: H2O).
  8. Vend forsigtigt for at blande opløsningen i 5 min, eller indtil antallet af intakte voksne orme falder.
    Forsigtig: må ikke blegemiddel i mere end 5 min.
  9. Centrifuge i 1 min ved 2.000 x g og sug det meste af blegning opløsningen uden at forstyrre orme pellet.
  10. Tilsæt 15 mL M9 og bland godt.
  11. Centrifugeres igen ved 2000 x g i 1 min.
  12. Suge de fleste af M9 uden at forstyrre ormen pellet.
  13. Gentag trin 4.10-4.12 en eller to gange mere.
  14. Tilsæt 5 mL frisk M9 og agitate.
  15. Lad æggene klækkes natten over med blid Rocking.

5. forberedelse af orme prøver

  1. Lad de N2-embryoner, der er opnået ved blegning, luge natten over i M9-buffer (5 mL i et 15 mL centrifugeglas) ved 20 °C.
  2. Høst den synkroniserede L1s ved at centrifuger røret i 2 min ved 2.000 x g.
  3. Vask ormene med M9 buffer 1x, og Kvantificer derefter antallet af levende L1-orme.
  4. Frø ca. 10.000 orme i NGM-plader (10 cm i diameter) med 1 mL OP50 E. coli (tidligere tørret).
  5. Pladerne inkubates i 48 h ved 20 °C, indtil orme er nået til L4-stadiet.
  6. Høst orme ved hjælp af kold M9 buffer i en 15 mL centrifuge tube, vaske dem 1x, derefter og overføre dem til en 1,5 mL rør.
  7. Pellet ormene ved centrifugering ved 2.000 x g i 1 min, fjerne det meste af supernatanten, nedsænke rørene i flydende nitrogen, og opbevares ved-80 °c.

6. lipid ekstraktion

  1. Der tø ca. 100 μL frosne orm pellets, der tilhører N2 på is, tilsættes 1,3 mL methanol og sonisierer prøven i 4 minutter.
  2. Der tilsættes 2,6 mL chloroform og 1,3 mL 0,5 M KCl/0,08 M H3po4 til et endeligt forhold på 1:2:1, 1.000 PPB af den interne standard 1-AG-d5og butylhydroxytoluen som antioxidant middel ved en endelig koncentration på 50 μg/ml.
  3. Vortex prøverne i 1 min og sonier i et ultralydvandbad i 15 minutter på is.
  4. Vortex prøverne 2x i 1 min og centrifugeres i 10 minutter ved 2.000 x g for at inducere faseseparationen.
  5. Saml den nedre fase og Saml den i et rent rør, tør den under nitrogen, og resuspender den faste rest i 100 μL ACN.

7. endocannabinoid-analyse af HPLC-MS/MS

  1. Brug væskekromatografi kombineret med et ESI Triple fire pole massespektrometer til at detektere og kvantificere 2-AG fra fyrretræsnematoden prøver.
  2. Brug følgende forhold for HPLC med omvendt fase: fra 0,0-0,5 min H2o:acn (40:60), 0,5-6,5 min h2o:acn (40:60) til (25:75), 6,5-7,5 min h2o:ACN (25:75), 7,5-8,0 min h2o:ACN (25:75) til (40:60), 8,0-12.0 min h2O: ACN (40:60).
  3. Hold kolonne temperaturen ved 40 °C, og Indstil Autosampler-bakke temperaturen til 10 °C.
  4. Angiv følgende ioniserings betingelser: positiv-ion-tilstand; tørring gas (N2) temperatur = 300 °c; tørring gas strømningshastighed = 10 L/min; nebulisator tryk = 10 UA; og Cap. spænding = 4 kV.
  5. Til analysand-detektion skal du bruge MRM med følgende overgange: 379,2 m/z til 289,2 m/z for 2-AG; og 384,2 m/z til 289,2 m/z for 1-AG-d5.

8. endokannabinoid kvantificering i orme

  1. Brug er intern standard 1-AG-d5 og Beregn toparealet af analysand til den interne standard.
  2. Brug følgende overgange: 384,2 m/z til 287,2 m/z for 2-AG; og 379,2 m/z til 287,2 m/z for 1-AG-d5.
  3. Koncentrationen af det endogene 2-AG beregnes ved at sammenligne med toparealet af den deutererede standard ved hjælp af standard koncentrationsværdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En isotopisk mærket analog blev med held syntetiseret fra kommercielt tilgængelig d8-glycerol og arachidonsyre ved hjælp af en 3-trins syntetisk metode (figur 2, figur 3). Disse trin er ligetil og kræver ikke sofistikeret udstyr, specielt kontrollerede forhold, eller dyre reagenser. Således, denne metode er robust og kan med succes udvides til at syntetisere monoacylglycerider indeholdende forskellige fedtsyrer.

1-AG-d5 var strukturelt karakteriseret ved hjælp af nuklear magnetisk spektroskopi. 1 H NMR viste den karakteristiske multiplet ved 5,44 ppm til 4,93 ppm, som integrerer for de otte vinyl protoner af arachidonoyl kæde og triplet ved 2,40 ppm, svarende til de to protoner af alpha position til carbonyl gruppen. I 2D NMR, er det også muligt at se en 2,9 ppm til 2,7 ppm multiplet overdrages til de fem deuterium af glycerol portion.

Den kemisk syntetiserede 1-AG-d5 blev brugt som en intern standard i C. elegans prøver. Standarden blev føjet til prøverne før ekstraktion derefter ekstraheret med de endogene lipider, ved hjælp af en ligetil metode tilpasset fra Folch24. Denne modificerede metode giver en høj genvindings værdi af standarden, som vist ved HPLC kvantificering.

Metoden blev optimeret ved hjælp af overgangene 1) 384,2 m/z til 287,2 m/z for 2-AG og 2) 379,2 m/z til 287,2 m/z for 1-AG-d5, hvor glycerol molekyler er tabt (figur 4). Detektionsgrænserne (LOD) og kvantificeringen (LOQ) blev beregnet for standarden ved hjælp af en kalibreringskurve, hvilket resulterede i værdier på henholdsvis 5 PPB og 16,6 PPB. Opbevaringstiden for standarden var 6,8 min.

2-AG endogene fra C. elegans prøverne blev registreret og kvantificeret ved isotop fortynding med den kemisk syntetiserede 1-AG-d5 ved hjælp af HPLC-MS/MS (figur 5).

Da de oprindelige koncentrationer af de deutererede standarder i prøve 1 og 3 var hver 1.000 PPB, fra topareal forholdet, var det muligt at beregne den endogene koncentration af 2-AG ved 340 PPB for eksempel 1 og 360 ppm for prøve 3, hvilket giver et gennemsnit på 350 ppm ( Tabel 1).

Figure 1
Figur 1: Resumé af syntese, orm prøvetagning, og kvantificering. For at opnå en vellykket kvantificering af den endogene 2-AG, det var nødvendigt at syntetisere sin er analog ved hjælp af en tre-trins sekvens. Bagefter blev det føjet til orm prøver, ekstraheret, og analyseret af HPLC-MS/MS. anvendes som en intern standard, syntetisk af 1-AG-d5 var det værktøj, der anvendes til at kvantificere den endogene metabolit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: syntetisk ordning for opnåelse af 1-AG-d5. En masse på 10 mg af den er analog blev opnået ved hjælp af tre-trins metode, der involverer 1) beskyttelse af glycerol-d8, 2) acylering med arachidonsyre, og 3) debeskyttelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kemisk struktur af den isotopisk mærkede 2-AG analog. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: udvalgte fragmenteringer til kvantificering af 1-AG-d 5 og 2-AG. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: HPLC-kromatogrammer for 1-AG-d5 og 1-AG som rene standarder og interne standarder i en orm prøve. Det var muligt at analysere opbevaringstider og se, at 1) ormen synes ikke at have endogene 1-AG og 2) det ville kun have 2-AG, men standard 1-AG-d5 vil stadig fungere som en god analytisk standard for kvantificering ved isotop fortynding. De anvendte overgange var: 384,2 m/z til 287,2 m/z for 2-AG, og 379,2 m/z til 287,2 m/z for 1-AG-d5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1-AG-d5 2-AG Ratio (2-AG/1-AG-d5)
Prøve 1 71964,74 210616,08 0,34
Prøve 3 74311,36 205648,43 0,36

Tabel 1: peak Area ratio for den er standard og endogene 2-AG. Kvotienterne blev beregnet som en kvotient mellem toparealerne for henholdsvis 2-AG og 1-AG-d5 for to isolerede prøver, begge med deutereret standard tilsat før ekstraktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endocannabinoider er en klasse af lipider, som har været impliceret i reguleringen af Dauer dannelse i C. elegans7. Mere specifikt, syntesen af flerumættede fedtsyrer (PUFAs) er vigtig for kolesterol handel og reproduktiv udvikling af orme. Det er afsløret her, at 2-AG, en arachidonsyre, der indeholder endocannabinoid, er ansvarlig for at restituere Dauer larve til sin normale cyklus i orme, der har nedsat kolesterol metabolisme7.

I betragtning af den nyligt opdagede betydning af 2-AG i forbedringen af kolesterol handel og andre biologiske processer, og hvor lidt vides om, hvordan lipider påvirker denne proces, en pålidelig detekterings metode for denne endocannabinoide er nødvendig. Den vellykkede udvikling af denne enkle og robuste syntetiske metode til at opnå den er analog 1-AG-d5 er et vigtigt skridt i denne protokol.

De fleste af de rapporterede metoder til kvantificering af monoacylglyceroler indebærer anvendelse af kommercielt tilgængelige analytiske standarder, som normalt er dyre og ustabile under normale opbevaringsforhold. Dette gør dem generende for forskere, der kræver større mængder af standarder og friske bestande. De er også uopnåelige for lavere budget laboratorier. Men denne metode overvinder denne hindring ved at foreslå syntese af standarden ved hjælp af mere tilgængelige udgangsmaterialer.

Det er også bemærkelsesværdigt, at i modsætning til andre rapporterede metoder (som anvender er analytiske standarder for 2-substituerede monoacylglyceroler, der lider acyl-migration under mange betingelser, således at to kromatografiske toppe ses og påvirker den relative kvantificering ved isotop fortynding25), anvender denne metode effektivt en 1-substitueret er analytisk standard, som er en enkelt isomer og ikke gennemgår acyl-migration.

Den syntetiske metode er ligetil og kræver ingen sofistikerede betingelser, hvilket gør den ideel til ethvert laboratorium, der har minimal udstyr, budget og adgang til reactanter. Det er også en simpel teknik, som kan bruges af enhver videnskabsmand, der arbejder i marken, uden behov for særlig uddannelse i organisk syntese. Ormen prøveforberedelse er den konventionelle metode, uden yderligere komplikationer. Endelig er lipid ekstraktionsmetoden for at opnå de endelige prøver en modifikation fra Folch's protokol24 , der giver mulighed for bedre genvindings værdier, da det ikke kræver kromatografikolonne rensning.

Det kritiske skridt er at sikre, at prøveforberedelsen og lipid ekstraktion udføres tilstrækkeligt for at opnå god og detekterbar genopretning af standarden. Det er også vigtigt at 1) producere friske stamopløsninger månedlige for at opretholde betingelserne for standarden og 2) check af NMR-spektroskopi eller LC-MS, at standarden er stadig ren og ikke har undergået oxidation eller nedbrydning. Den eneste begrænsning af denne teknik er afhængig af dens ekspansion til andre undersøgelser, der kan have endogene 2-AG koncentrationer lavere end den præsenterede LOQ. I dette tilfælde bør metoden ændres for at sikre, at koncentrationen falder mellem grænserne.

I tilfælde af svigt i løbet af den protokol, hvor 1) der ikke er noget synligt kromatografisk signal af standarden eller 2) restitutions værdien af standarden efter ekstraktion er lavere end forventet, anbefales det at gentage prøveforberedelse og lipid ekstraktion. Da syntetisk rute involverer syntese af en beskyttet er glycerol byggesten, der er endelig østradiol acyleret med arachidonsyre i det sidste trin, denne metode kan udvides til syntesen af er standarder for andre monoacylglyceroler, diacylgliceroler, phospholipider og strukturelt beslægtede metabolitter.

Sammenfattende beskriver denne nye procedure en enkel og reproducerbar metode til påvisning og kvantificering af 2-AG, som vil bidrage til at løse nogle af de ubesvarede spørgsmål om rollen af denne endocannabinoide i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et forskningsstipendium fra Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. og B.H.C. er stipendiater fra CONICET. D.d.M. og G.R.L. er medlemmer af CONICETS forskningskarriere. Vi er taknemmelige for Gonzalo Lamberto (INMET) for LC-MS/MS analyse og hjælpsom diskussion. Video optagelse og-redigering er blevet udført af Ramiro Ortega og María Soledad Casasola fra Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
  3. Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
  6. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
  7. Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
  8. Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
  9. Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
  10. Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
  11. Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
  12. Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
  13. Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
  14. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
  15. Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
  16. Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
  17. Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
  18. Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
  19. Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
  20. Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
  21. Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
  22. Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
  23. Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).

Tags

Biokemi endocannabinoider C. elegans syntese er analoner 2-AG Dauer MAGs HPLC-MS/MS isotop fortynding kvantificering
Syntese af en deutereret standard for kvantificering af 2-Arachidonoylglycerol i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández de Luco, J., Prez,… More

Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter