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Biology

क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के प्रसार को मापने

Published: October 30, 2019 doi: 10.3791/59930
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

Summary

प्रसार सेलुलर समारोह का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और एक आम readout नई दवाओं की संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया. मापने प्रसार है, इसलिए, सेल जीव विज्ञान में एक बार इस्तेमाल किया परख. यहाँ हम प्रसार है कि अनुयायी और गैर-अनुकूल कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है को मापने के लिए एक सरल, बहुमुखी विधि पेश करते हैं.

Abstract

एक सेल की क्षमता को आगे बढ़ने के लिए सबसे कोशिकाओं के सामान्य समारोह का अभिन्न अंग है, और प्रसार के disविनियमन कई रोग प्रक्रियाओं के दिल में है. इन कारणों के लिए, प्रसार को मापने एक आम उपकरण सेल समारोह का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सेल प्रसार बस गिनती से मापा जा सकता है; हालांकि, यह प्रसार को मापने का एक अप्रत्यक्ष साधन है। सीधे विभाजित करने की तैयारी कोशिकाओं का पता लगाने का एक आम साधन लेबल न्यूक्लिओसाइड एनालॉग का समावेश द्वारा है. इनमें रेडियोधर्मी न्यूक्लिओसाइड एनालॉग 3एच-थाइमिडीन प्लस गैर-रेडियोएक्टिव न्यूक्लिओसाइड एनालॉग जैसे 5-ब्रोमो-2' डिऑक्सीयूरिडीन (ब्रडू) और 5-एथयिनिल-2-डेऑक्सीयूरिन (ईयू) शामिल हैं। EdU का समावेश क्लिक रसायन विज्ञान, जो कई फायदे हैं जब BrdU की तुलना में द्वारा पता चला है. इस रिपोर्ट में, हम EdU के समावेश द्वारा प्रसार को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल विभिन्न readouts के लिए विकल्प भी शामिल है, लाभ और प्रत्येक के नुकसान के साथ. हम उन स्थानों पर भी चर्चा करते हैं जहां प्रोटोकॉल को नियोजित प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है या परिवर्तित किया जा सकता है. अंत में, हम तरीके है कि इस बुनियादी प्रोटोकॉल अन्य सेल चयापचयों को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है पर स्पर्श.

Introduction

प्रसार सेल्यूलर प्रकार्य1,2का एक महत्वपूर्ण भाग है . प्रसार का नियंत्रण सामान्य प्रक्रियाओं जैसे विकास, और कैंसर और हृदय रोग जैसी रोगसंबंधी प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है। संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के Hyperplastic विकास, उदाहरण के लिए, atherosclerosis3के लिए एक अग्रदूत माना जाता है. सेल प्रसार में परिवर्तन भी नई दवाओं की संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इसके व्यापक प्रभाव को देखते हुए, प्रसार को मापने के कई सेल जीव विज्ञान आधारित प्रयोगशालाओं का एक मुख्य आधार है.

सेल प्रसार बस कोशिकाओं की गिनती से मापा जा सकता है अगर ब्याज की कोशिका आबादी काफी तेजी से विभाजित करता है. धीमी बढ़ती कोशिकाओं के लिए, सेल गिनती कम संवेदनशील हो सकता है. प्रसार अक्सर लेबल न्यूक्लिओसाइड एनालॉग के समावेश द्वारा मापा जाता है। हालांकि सोने के मानक है 3एच थाइमिडीन निगमन, कई प्रयोगशालाओं नए, गैर रेडियोएक्टिव विकल्प की उपलब्धता को देखते हुए इस विधि से दूर हो रही है. इनमें साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोसेंट रंग, सेल चक्र से जुड़े प्रोटीन का पता लगाना, और गैर-रेडियोसक्रिय न्यूक्लिओसाइड एनालॉग्स जैसे 5-ब्रोमो-2' डिऑक्सीयूरिडीन (ब्रडू) और 5-एथोनिल-2-डियूरिऑक्सीडीन (ईयू)4शामिल हैं।

साइटोप्लाज्मिक रंग, जैसे कार्बोक्सीफ्लूओरेसिन डाइऐसीटेट सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई), प्रसार का पता लगाते हैं क्योंकि हर बार कोशिका विभाजित होने पर डाई की तीव्रता5हो जाती है। इस तकनीक का उपयोग आमतौर पर गैर-अनुकूल कोशिकाओं के लिए प्रवाह साइटोमेट्री में किया जाता है। यह अनुयायी कोशिकाओं के लिए ज्यादा इस्तेमाल नहीं किया गया है, लेकिन इमेजिंग प्लेट पाठकों की नई पीढ़ी के साथ यह बदल सकता है. एंटीबॉडी आधारित तकनीकों (प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, आदि) के माध्यम से जुड़े सेल चक्र से जुड़े प्रोटीन का पता लगाना अक्सर ऊतकों या गैर-अनुकूल कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है। इन कोशिकाओं/ऊतकों को स्थिर किया जाना चाहिए और धुंधला करने से पहले permebilized किया जाना चाहिए। न्यूक्लिओसाइड एनालॉग BrdU और EdU के दृष्टिकोण में समान हैं 3एच-थाइमिडीन, लेकिन रेडियोधर्मिता की असुविधा के बिना. BrdU का समावेश विरोधी BrdU एंटीबॉडी द्वारा पता चला है, और इसलिए कोशिकाओं को तय किया जाना चाहिए और धुंधला करने से पहले permebilized. इसके अलावा, कोशिकाओं DNase के साथ इलाज किया जाना चाहिए BrdU epitope बेनकाब करने के लिए.

EdU का समावेश क्लिक रसायन विज्ञान, जिसमें alkyne और azide समूहों "क्लिक करें" उत्प्रेरक तांबे की उपस्थिति में एक साथ द्वारा पता चला है. या तो समूह जैव संश्लेषित रूप से निगमित अणु या संसूचन अणु4के रूप में कार्य कर सकता है . वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिओसाइड एनालॉग में ऐल्किन समूह जुड़ा हुआ है। प्रसार परख के लिए, इसलिए, alkyne functionalized न्यूक्लिओसाइड अनुरूप एक फ्लोरोसेंट डाई या अन्य मार्कर के लिए संयुग्मी एक azide द्वारा पता चला है. EdU के शामिल BrdU पर कई फायदे हैं. सबसे पहले, क्योंकि alkyne और azide समूहों स्तनधारी कोशिकाओं में नहीं पाए जाते हैं, इस बातचीत के एक कम पृष्ठभूमि6के साथ अत्यधिक विशिष्ट है. क्योंकि दोनों समूह छोटे हैं, कोशिकाओं को डीएनए विकृतीकरण से गुजरना करने की जरूरत नहीं है के रूप में BrdU7के लिए आवश्यक न्यूक्लिओसाइड अनुरूप बेनकाब. अंत में, क्लिक रसायन अत्यधिक बहुमुखी है, और डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, फैटी एसिड, और कार्बोहाइड्रेट8,9,10,11की चयापचय लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि उपापचयी रूप से ब्याज का लक्ष्य कोशिका सतह पर है, तो जीवित कोशिकाओं को12लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल EdU निगमन के उपयोग का वर्णन करता है और मानव संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में प्रसार को मापने के लिए रसायन विज्ञान पर क्लिक करें (चित्र 1)। हम EdU के शामिल तीन अलग अलग तरीके दिखाने के लिए मापा जा सकता है, प्रत्येक से प्रतिनिधि परिणाम, और उनके फायदे और नुकसान. क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से प्रसार को मापने के अनुयायी, धीमी बढ़ती कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इसके अलावा, सेल की आकृति विज्ञान अच्छी तरह से बनाए रखा है और एंटीबॉडी आधारित धुंधला भी किया जा सकता है.

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Protocol

1. फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग कर EdU का पता लगाने

  1. स्टॉक समाधान
    1. डबल आसुत एच2व् के 10 एमएल में 12.5 मिलीग्राम एयू को जोड़कर 5 एमएम एयू स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. लेबलिंग समाधान घटक ों को तैयार करें: 200 एमएम ट्राइस (3-हाइड्रॉक्सीप्रोपाइलट्राइयाजोलमेथिल) अमीन (THPTA) (100 मिलीग्राम में 1.15 एमएल एच2ओ), 100 एमएम क्यूएसओ4 (15.95 मिलीग्राम में 1 एमएल एच2ओ; ताजा बनाएं), 10 एमएम साइकोरिल-एजी-एजीडी (1 एम.एल. , -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 डिग्री एल एलिकोट्स में संग्रहीत किया जाता है, और 1 एम सोडियम ऐस्कोरबेट (200 मिलीग्राम 1 एमएल एच2ओ में; ताजा बनाएं)।
    3. 0.15 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर रेज़ुरिन स्टॉक समाधान तैयार करें। फ़िल्टर नसबंदी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल alicots की दुकान।
      नोट: Picolyl azide कई अलग fluors, बायोटिन, और horsradish peroxidase (एचआरपी) के लिए संयुग्मी उपलब्ध है।
  2. EdU के साथ लेबल संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (VSMC).।
    नोट: मानव VSMCs ऊतक के explanted टुकड़े से वृद्धि के माध्यम से iliac धमनियों से अलग थे. जब इंसुलिन के साथ सीरम मुक्त मीडिया में बड़े हो, transferrin, सेलेनियम इन कोशिकाओं VSMC मार्करों smoothelin व्यक्त, चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला (एसएम-MHC) और एसएमसी ज़ेक्टिन13.
    1. प्लेट संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं पर 2 x 104/ mL Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में (DMEM) एक 96 अच्छी तरह से थाली में.
      नोट: कोशिकाओं 2% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ चिकनी मांसपेशी सेल मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे हैं।
    2. (वैकल्पिक) पालन के लिए रात भर के लिए कई घंटे की अनुमति दें. प्रत्येक अच्छी तरह से 20 $L resazurin स्टॉक जोड़ें. 3 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट एक प्लेट रीडर (560पूर्व, 594एम )में फ्लोरोसेंट संकेत पढ़ें। ताजा DMEM के साथ मीडिया बदलें.
      नोट: यह चरण वैकल्पिक है। Resazurin सेल संख्या को सामान्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है और14चढ़ाना में अच्छी तरह से अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता के लिए खाते.
    3. संस्कृति अवधि की शुरुआत में फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) या प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) 30 एनजी/एमएल को 3 डिग्री 6 कुओं में डालकर 72 ज के लिए उपचार के प्रति कूप जोड़ें।
    4. 1 एमएम के लिए 5 एमएम ईयू स्टॉक को पतला करें। 72 ज संस्कृति अवधि के अंतिम 24 एच के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से (अंतिम एकाग्रता 20 डिग्री सेल्सियस) के लिए 2 $L जोड़ें। प्रतिकृति का एक सेट करने के लिए EdU न जोड़ें। इन कुओं पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट /
      नोट: संस्कृति और EdU के साथ लेबलिंग की अवधि चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है, लेकिन सेल प्रकार प्रति संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है.
  3. पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करें।
    1. मीडिया निकालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से 4% पीएफए (पीबीएस में) के 150 $L जोड़ें।
    2. पीएफए निकालें और 1% पॉलीथीन ग्लाइकोल टर्ट-ऑक्टाइलफ़ेनिल ईथर (TX-100) (पानी में) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से 150 $L जोड़ें।
    3. पीबीएस के साथ तीन बार धोने से TX-100 निकालें.
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त है, देखभाल के साथ संभाल.
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। फिक्स्ड कोशिकाओं को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. शामिल EdU का पता लगाएँ.
    1. लेबलिंग समाधान (10 एमएल प्रति 96 अच्छी तरह से थाली, आंतरिक 60 कुओं का उपयोग कर) बस निम्नलिखित क्रम में स्टॉक समाधान से अभिकर्मकों को जोड़ने के द्वारा उपयोग करने से पहले: THPTA 20 $L, CuSO4 20 $L, Cy3 picolylde 5 $L, Na ascorbate 100 $L पीबीएस के लिए 10 एमएल की कुल मात्रा के लिए 10 एमएल.
    2. कुओं से पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से लेबलिंग समाधान के 150 $L जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेट। सभी नाभिक का पता लगाने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से 4 ",6-diamidino-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई) जोड़ें। एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर पढ़ें (Cy3 550पूर्व, 570em; DAPI 350पूर्व, 470एम) या एक माइक्रोस्कोप पर छवि.
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। फिक्स्ड और दाग कोशिकाओं को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में छवि की जा सकती है।

2. संदीप्ति का उपयोग कर के ईयू का पता लगाने

  1. पूरा अनुभाग 1.1-1.3.
  2. 0.1% पॉलीसमोरेट 20 (TBST) के साथ Tris-buffered नमकीन तैयार करें।
  3. ब्लॉक कुओं.
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से और कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए बफर (सामग्री की तालिका)को अवरुद्ध करने के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. ब्लॉकिंग बफर निकालें और PBS के 200 $L के साथ तीन बार धो लें।
  4. शामिल EdU का पता लगाएँ.
    1. चरण 1.4.1 में निर्देशित के रूप में लेबलिंग समाधान करें, Cy3 पिकोलिल अज़ीदे के लिए बायोटिन पिकोलिल अज़ीदे को प्रतिस्थापित करें।
    2. TBST के 200 $L के साथ पांच बार कुओं को धोएं, मिलाते हुए, 3 मिनट प्रति धोने के साथ।
    3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.3% एच2ओ2 के 150 $एल के साथ अंतर्जात peroxidases।
    4. एच2हे2 निकालें और 200 डिग्री सेल्सियस के साथ पांच बार धो लें, धोने के प्रति 3 मिनट मिलाते हुए।
    5. TBST में पतला स्ट्रेप्टाविडिन-हॉर्सराडिश peroxidase (एसए-एचआरपी; 1:200) और प्रत्येक अच्छी तरह से 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट 1 एच।
    6. TBST के 200 $L के साथ पांच बार धो, मिलाते हुए के साथ, धोने प्रति 3 मिनट.
    7. प्रत्येक कूप में रसायन-सेजुड़े एन्ज़ाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) सब्सट्रेट(सामग्री तालिका) के50 डिग्री एल जोड़ें।
    8. संदीप् ति का पता लगाने में सक्षम प्लेट रीडर में तुरंत पढ़ें।

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Representative Results

चित्र 2 में,हम PDGF के प्रत्युत्तर में VSMC के प्रसार को मापने के तीन अलग अलग प्रयोगों के परिणामों को प्रदर्शित करते हैं. SMCs के लिए तैयार मीडिया में कोशिकाओं को बढ़ने के बाद, हम सीरम मुक्त DMEM में प्रयोग किया, प्रसार पर सीरम या विकास कारकों के किसी भी संभावित प्रभाव को खत्म करने के लिए. चित्र 2क में हम एक फ्लोरोसेंट बनाम दीप्ति र्ंकिन रीडआउट का उपयोग करते हुए एक ही प्रयोग से परिणामों की तुलना करते हैं। इन प्लेटों को पढ़ने के लिए, हम एक multimode microplate पाठक है कि अवशोषण, फ्लोरोसेंट, और luminscence पढ़ सकते हैं इस्तेमाल किया (सामग्री की मेजदेखें).

अच्छी तरह से मोड स्कैनिंग में प्लेट रीडर का उपयोग करना, फ्लोरोसेंट रीडिंग पूरे अच्छी तरह से अधिक औसत रहे हैं. इस मोड केंद्र और अच्छी तरह से के किनारों के बीच मतभेदों के कारण संभावित inaccuracies को कम. हालांकि, अगर बहुत कुछ नाभिक सकारात्मक हैं, इस तरह से पढ़ने के परिणाम की संभावना सकारात्मक कोशिकाओं की "संख्या" कम करके आंका जब केवल कुछ ही सकारात्मक हैं. संख्या, इस readout के साथ, एक और अच्छी तरह से है कि के सापेक्ष फ्लोरोसेंट का मतलब है, और नहीं सटीक सेल संख्या. इसके अलावा, अगर वहाँ एक फाइबर या मृत कोशिकाओं है कि फ्लोरोसेंट उठाता है की एक झुरमुट है, यह क्षेत्र स्कैन में शामिल किया जाएगा. हालांकि, प्लेट रीडर का उपयोग करने का लाभ समय है. जबकि स्कैनिंग मोड में पढ़ने के प्रति अच्छी तरह से 15 डिग्री 20 सेकंड लेता है, यह तस्वीरें लेने और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उन्हें विश्लेषण करने के व्यक्तिगत समय गहन विधि के विरोध के रूप में स्वचालित है.

उपरोक्त विधि से संभावित कम करके आंकने को सही करने के लिए, हमने फ्लोरोसेंट स्कैन को एक समरूप में परिवर्तित कर दिया, तरल रीडआउट जिसमें ईडू लेने वाली कोशिकाओं को एक अज़ीडे-बायोटिन मोइटी के साथ पाया जाता है, जो कि स्ट्रेप्टविडिन-हॉर्स्राडिश पेरोक्सिडेस के साथ पता लगाया जाता है। (चित्र 1देखें )। घोड़े की मात्रा peroxidase तो ELISA के लिए स्वरूपित एक मानक सब्सट्रेट का उपयोग कर मात्रा निर्धारित है. इस तकनीक का लाभ एक अधिक समरूप पठन-पाठन है, और चित्र 2क,ख उन प्रयोगों के उदाहरण दिखाता है जहाँ इस विधि का प्रयोग किया गया था। इसके अलावा, थाली सेकंड में पढ़ा जा सकता है. इस विधि के लिए नुकसान कर रहे हैं, लेकिन. सबसे पहले, इस विधि के साथ पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के साथ की तुलना में अधिक है। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, हमने एक ब्लॉकिंग चरण और एकाधिक washes को शामिल किया है। इस पृष्ठभूमि का एक प्रतिबिंब के रूप में, नकारात्मक नियंत्रण (अशोधित कोशिकाओं) अधिक हो जाते हैं, और प्रसार में गुना वृद्धि कम है. दूसरा, फ्लोरोसेंट readout के साथ के रूप में, किसी भी फाइबर या मृत कोशिकाओं है कि पता लगाने अभिकर्मकों लेने कुल luminescence के लिए जोड़ देगा.

उपरोक्त प्रयोगों में परिवर्तनशीलता को कम करने के प्रयास में, हमने प्रारंभिक कक्ष गणना के लिए अपने परिणामों को सामान्यीकृत किया। प्रसार परख के लिए, सामान्यीकरण कोशिकाओं को विभाजित करने से पहले परख की शुरुआत में जीवित कोशिकाओं पर किया जाना है. इसके अलावा, परख सेल समारोह या EdU के शामिल को प्रभावित नहीं कर सकता. इन बाधाओं को देखते हुए, हम resazurin14के माध्यम से सेल संख्या का एक प्रतिबिंब के रूप में चयापचय का उपयोग करने के लिए चुना है। के साथ और सामान्यीकरण के बिना परिणाम चित्र 2Bमें दिखाए गए हैं। तथापि, प्रयोगों के एक अलग सेट में हमने पाया कि यह विधि सेल संख्याओं में छोटे अंतरों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है। इसके अतिरिक्त, इस readout में कोई भी त्रुटि पूरे प्रयोग में अधिक त्रुटि का परिचय देती है. इन कारणों के लिए, हम समान रूप से संभव के रूप में प्लेट कोशिकाओं के लिए असाधारण देखभाल करने के लिए चुना है, और एक सामान्यीकरण कदम नहीं है.

यह सुनिश्चित करने के लिए कि हम सबसे सटीक परिणाम संभव हो रहे थे, हम फ्लोरोसेंट धुंधला करने के लिए वापस आ गए (अनुभाग 1) और एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती. इस विधि का लाभ यह है कि कोई व्यक्ति धनात्मक कोशिकाओं को भौतिक रूप से देख और गिन सकता है, जिससे सबसे सटीकता सुनिश्चित हो सकती है (चित्र 3)। किसी भी फ्लोरोसेंट मलबे गिनती से बाहर रखा जा सकता है. EdU के बिना पृष्ठभूमि मायने रखता है 0 के रूप में वहाँ कोई दिखाई फ्लोरोसेंट है, और इसलिए कोई पृष्ठभूमि घटाना. इस विधि का मुख्य नुकसान समय है. एक 96 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया कोशिकाओं में नाभिक गिनती करने के लिए, हम दोनों EdU सकारात्मक कोशिकाओं और कुल कोशिकाओं (DAPI) की अच्छी तरह से प्रति 3 तस्वीरें ले, अच्छी तरह से प्रति 6 छवियों की आवश्यकता होती है. हम ऊपर के midsection से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए खड़ी तस्वीरें ले, ध्यान रखने के लिए ओवरलैप और दो बार कोशिकाओं की गिनती नहीं. कुल कोशिकाओं की गिनती हमें डेटा का एक दूसरा टुकड़ा है कि हमारे प्रसार परिणामों की पुष्टि देता है. हालांकि, VSMC के अपेक्षाकृत धीमी दोहरीकरण समय के प्रकाश में (36 डिग्री 48 एच), कुल कोशिकाओं में गुना वृद्धि PDGF बनाम नियंत्रण के साथ प्रेरित EdU सकारात्मक कोशिकाओं की गुना वृद्धि की तुलना में बहुत कम है, यही वजह है कि हम EdU के निगमन को मापने (चित्र 2C).

सबसे कुशल और सटीक तरीका है EdU सकारात्मक और कुल कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक इमेजिंग प्लेट रीडर का उपयोग करके है. इस विधि स्वचालन की गति के साथ गिनती की सटीकता को जोड़ती है. मुख्य दोष यह है कि उपकरणों का यह टुकड़ा हर संस्थान में उपलब्ध नहीं है. स्वचालित बनाम मैनुअल गिनती की तुलना में, EdU सकारात्मक मैनुअल गिनती अनिवार्य रूप से स्वचालित गिनती के समान था (चित्र 2C,छोड़ दिया), के रूप में कुल unstimulated मायने रखता था (चित्र 2C, सही). हालांकि, मैनुअल गिनती कुल PDGF-उत्तेजित कोशिकाओं में स्वचालित गिनती से कम था. यह अंतर संभावना सेल विकास पैटर्न से संबंधित है. क्योंकि कोशिकाओं को अच्छी तरह से के केंद्र में विकसित करते हैं, छोटी संख्या के साथ स्वचालित और मैनुअल मायने रखता है लगभग समान थे. हालांकि, उच्च संख्या के साथ किनारों पर अधिक कोशिकाओं की संभावना थी और मैनुअल मायने रखता है, जो अच्छी तरह से की परिधि में कोशिकाओं पर कब्जा नहीं किया था, कम सटीक थे.

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट या संदीप्ति द्वारा EdU का पता लगाने का अवलोकन.
वीएसएमसी या अन्य अनुयायी कोशिकाओं को ब्याज की शर्तों के तहत इलाज किया जाता है। EdU संस्कृति अवधि के पिछले 24 एच के लिए जोड़ा जाता है और विभाजन कोशिकाओं के डीएनए में शामिल किया गया है. शामिल EdU तो फ्लोरोसेंट (प्रोटोकॉल अनुभाग 1) या luminscence (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) का उपयोग कर पता चला है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: EdU और क्लिक करें रसायन विज्ञान के समावेश का उपयोग कर विभिन्न readouts के साथ प्रसार मापने.
(क)वीएसएमसी पीडीजीएफ की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत थे। EdU संस्कृति के पिछले 24 एच जोड़ा गया था, और निगमन या तो फ्लोरोसेंट (प्रोटोकॉल अनुभाग 1) या luminscence (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) द्वारा पता लगाया गया था। (ख)वीएसएमसी को पैनल ए में वर्णित माना गया था, और ईयू का समावेश संदीप्ति द्वारा मापा गया था। परिणाम resazurin व्यवहार्यता परख का उपयोग कर प्रारंभिक सेल गिनती के लिए सामान्यीकृत किया गया. (ग)वीएसएमसी को पैनल ए में माना गया और ईयू को शामिल करने को फ्लोरोसेंट से मापा गया। EdU सकारात्मक कोशिकाओं स्वचालित रूप से गिना गया, एक इमेजिंग प्लेट रीडर का उपयोग कर, या मैन्युअल रूप से इमेजिंग द्वारा और फिर इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गिनती. दिखाए गए परिणाम औसत - प्रति उपचार 3-6 प्रतिकृति के मानक विचलन हैं।

Figure 3
चित्र 3: क्लिक करें फ्लोरोसेंट प्रोटोकॉल के बाद EdU सकारात्मक कोशिकाओं का दृश्य।
VSMC चित्र 2में वर्णित के रूप में इलाज किया गया, और शामिल EdU फ्लोरोसेंट (प्रोटोकॉल अनुभाग 1) का उपयोग कर पाया गया था। प्रत्येक छवि एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से है. कुल नाभिक नीले (डीएपीआई) में दिखाए जाते हैं और एडू धनात्मक नाभिक हरे रंग के होते हैं। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

EdU का समावेश सेल प्रसार को मापने के लिए एक सरल, सीधा तरीका है; यह विशेष रूप से अनुशील कोशिकाओं13के लिए उपयोगी है. हमारे प्रोटोकॉल चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का उपयोग करता है, लेकिन यह किसी भी अनुशीलन सेल (एपथील, एंडोथेलियल, आदि) के लिए लागू है। हालांकि प्रोटोकॉल जटिल नहीं है, एक महत्वपूर्ण कदम लेबलिंग समाधान कर रहा है - सामग्री सूचीबद्ध क्रम में जोड़ा जाना चाहिए. इसके अलावा, कीमियुमिनेंट पश्चिमी धब्बा की तरह, यदि संदीप्ति readout का उपयोग कर प्लेट तुरंत पढ़ा जाना चाहिए.

प्रोटोकॉल के कई भागों को संशोधित या आवश्यकतानुसार ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है. एक हिस्सा EdU के साथ ऊष्मायन की अवधि है. क्योंकि हमारा लक्ष्य संभव के रूप में कई proliferating कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया था, हम एक पूर्ण 24 एच फिक्सिंग और धुंधला करने से पहले के लिए EdU जोड़ा. तथापि, इस समय की संभावना एस और जी 2/एम चरणों दोनों में कोशिकाओं को मापता है। S चरण में केवल कोशिकाओं को लेबल करने के लिए, Cecchini एट अल. सलाह है कि धीरे धीरे विभाजित कोशिकाओं EdU के साथ अब से अधिक 6 घंटे7के लिए incubated किया जा . प्रोटोकॉल का एक अन्य हिस्सा है कि अनुकूलित किया जा सकता है chelator की राशि है. Alkyne-azide प्रतिक्रियाओं एक तांबे उत्प्रेरक की आवश्यकता होती है (CuSO4). THPTA एक तांबे chelator है कि आवश्यक ऑक्सीकरण राज्य में तांबे का कहना है. केलेटर से तांबे के अनुपात में परिवर्तन किया जा सकता है, एल्कीन-अजीड बाइंडिंग को बढ़ाने के लिए। हम एक chelator के साथ उज्ज्वल धुंधला निरीक्षण: 2:1 के copper अनुपात, भी picolyl azide का उपयोग करने के संदर्भ में. पिकोलिल मोइटी में चेल्टिंग क्रियाएं होती हैं जो आवश्यक तांबे की सांद्रता कम कर देती हैं और अभिक्रिया की दक्षता15में वृद्धि करती हैं . Chelator:कॉप अनुपात बढ़ाया जा सकता है, आमतौर पर अप करने के लिए 5:1, प्रति अन्वेषक की जरूरत का अनुकूलन करने के लिए. एक बेहतर chelator, 2-[4-([bis](1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)मेथिल[amino]मिथाइल)-1H-1,2,3-triazol-1-yl-acetic एसिड (BTTAA), अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है16. जब हमने पहली बार इस प्रोटोकॉल को व्युत्पन्न किया था तो यह चेलेटर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं था। अंत में, हालांकि हम इस प्रोटोकॉल में एक फिक्सेटिव के रूप में पैराफॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं को मेथनॉल के साथ तय किया जा सकता है, जो permebilization कदम को भी रोकता है। मेथनॉल के साथ फिक्सिंग उपयोगी हो सकता है अगर एक EdU के समावेश के साथ विशिष्ट सेलुलर प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला गठबंधन करना चाहता है।

इस विधि का एक दोष EdU की संभावित cytotoxicity है, खासकर जब लगातार दिनों के लिए EdU के साथ लेबलिंग के रूप में घंटे की एक पल्स लेबल के लिए विरोध किया. इस्तेमाल किया कोशिकाओं के आधार पर, EdU सेल चक्र गिरफ्तारी या यहां तक कि apoptosis17पैदा करने के लिए पाया गया है. यह विषाक्तता कृत्रिम न्यूक्लिओसाइड्स18के अलावा से दोषपूर्ण डीएनए प्रतिकृति के कारण माना जाता है। अध्ययनों से पता चला है कि यह विषाक्तता सेल लाइन पर निर्भर और एकाग्रता पर निर्भर17है . हम अपने अध्ययन में विषाक्तता के साथ किसी भी समस्याओं का पालन नहीं किया.

सारांश में, EdU और क्लिक करें रसायन विज्ञान के माध्यम से प्रसार को मापने के अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों जैसे BrdU या 3एच-थाइमदीन निगमन पर कई फायदे हैं. ये रेडियोधर्मिता से बचने में शामिल हैं, कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च विशिष्टता, और कठोर विकृतीकरण कदम के लिए कोई ज़रूरत नहीं है. एक बार स्थापित, क्लिक करें रसायन विज्ञान अत्यधिक बहुमुखी है, और आसानी से आरएनए, प्रोटीन, फैटी एसिड, और कार्बोहाइड्रेट की चयापचय लेबलिंग के लिए संशोधित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए केटी कैरोल धन्यवाद. हम भी पर निर्देश और Cytation इमेजिंग प्लेट रीडर के प्रावधान के लिए डॉ डेविड कूल और Proteomics विश्लेषण प्रयोगशाला धन्यवाद. यह काम एक राइट स्टेट फाउंडेशन अनुदान (L.E.W. करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Carbosynth NE08701
biotin picolyl azide Click Chemistry Tools 1167-5
CuSO4 Fisher Scientific C1297-100G
Cy3 picolyl azide Click Chemistry Tools 1178-1
Cytation Plate Reader Biotek
EVOS Microscope Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763
Na ascorbate Sigma-Aldrich 11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes Invitrogen R37606 DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 blocking buffer
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15710
PBS Fisher Scientific SH3002802
Sodium Chloride Sigma Life Science S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate Life Technologies S911
Super Signal ELISA Femto Thermo Scientific PI137075 ELISA substrate
Synergy Plate Reader Biotek
THPTA Click Chemistry Tools 1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) Fisher Scientific BP153-500
Triton X 100 Bio-Rad 1610407
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100

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References

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जीव विज्ञान अंक 152 क्लिक करें रसायन विज्ञान प्रसार संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं अनुलग्न कोशिकाओं फ्लोरोसेंट EdU
क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के प्रसार को मापने
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Wong, V., Arumugam, P., Wrenshall, L. E. Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (152), e59930, doi:10.3791/59930 (2019).

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