Summary
A proliferação é uma parte crítica da função celular, e uma leitura comum usada para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. A medição da proliferação é, portanto, um ensaio freqüentemente usado na biologia celular. Aqui apresentamos um método simples e versátil de medição da proliferação que pode ser usado em células aderentes e não aderentes.
Abstract
A capacidade de uma célula para proliferar é parte integrante da função normal da maioria das células, e a desregulação da proliferação está no coração de muitos processos de doença. Por estas razões, medir a proliferação é uma ferramenta comum usada para avaliar a função celular. A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem; no entanto, este é um meio indireto de medir a proliferação. Um meio comum de detectar diretamente as células se preparando para dividir é a incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Estes incluem o análogo radioradioativo do nucleosídeo 3H-thymidine mais análogos não radioativos do nucleosside tais como o deoxyuridine de 5 bromo-2' (BrdU) e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU). A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, que tem várias vantagens quando comparada à BrdU. Neste relatório, fornecemos um protocolo para medir a proliferação pela incorporação da EdU. Este protocolo inclui opções para várias leituras, juntamente com as vantagens e desvantagens de cada um. Também discutimos locais onde o protocolo pode ser otimizado ou alterado para atender às necessidades específicas do experimento planejado. Finalmente, tocamos nas maneiras que este protocolo básico pode ser modificado para medir outros metabólitos celulares.
Introduction
A proliferação é uma parte crítica da função celular1,2. O controle da proliferação influencia processos normais, como desenvolvimento e processos patológicos, como câncer e doenças cardiovasculares. Acredita-se que o crescimento hiperplástico das células musculares lisas vasculares, por exemplo, seja um precursor da aterosclerose3. Mudanças na proliferação celular também são usadas para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. Dado o seu impacto generalizado, medir a proliferação é um pilar de muitos laboratórios baseados em biologia celular.
A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem de células se a população celular de interesse se dividir rapidamente. Para células de crescimento mais lento, a contagem de células pode ser menos sensível. A proliferação é muitas vezes medida pela incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Embora o padrão ouro seja a incorporação 3H-thymidine, muitos laboratórios estão fugindo desse método, dada a disponibilidade de alternativas mais novas e não radioativas. Estes incluem corantes fluorescentes citoplasmais, detecção de proteínas associadas ao ciclo celular e incorporação de análogos de nucleosídeos não radioativos, como deoxiuridina (BrdU) 5-bromo-2' e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Corantes citoplasmais, como carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), detectam proliferação porque a intensidade do corantes metades cada vez que a célula divide5. Esta técnica é comumente usada em citometria de fluxo para células não aderentes. Não foi usado muito para pilhas aderentes, mas com a geração nova de leitores da placa da imagem latente isto pode mudar. A detecção de proteínas associadas ao ciclo celular através de técnicas baseadas em anticorpos (citometria de fluxo, imunohistoquímica, etc.) é frequentemente usada para tecidos ou células não aderentes. Estas células/tecidos devem ser fixadas e permeabilizadas antes da coloração. Os análogos de nucleosídeo BrdU e EdU são semelhantes na aproximação a 3H-thymidine, mas sem a inconveniência da radioatividade. A incorporação da BrdU é detectada por anticorpos anti-BrdU e, portanto, as células devem ser fixas e permeabilizadas antes da coloração. Além disso, as células devem ser tratadas com DNAse para expor o epítopo brdu.
A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, na qual os grupos de alquino e azida "clicam" juntos na presença de cobre catalítico. Um ou outro grupo pode serir como a molécula biossintética incorporada ou a molécula4da deteção. Análogos nucleosídeos comercialmente disponíveis têm o grupo de alquin. Para ensaios de proliferação, portanto, o análogo nucleosídeo funcionalizado de alquino é detectado por um azide conjugado a um corante fluorescente ou outro marcador. A incorporação da EdU tem várias vantagens sobre a BrdU. Primeiro, como os grupos de alquino e azida não são encontrados em células de mamíferos, essa interação é altamente específica, com um fundo baixo6. Como ambos os grupos são pequenos, as células não precisam se submeter à desnaturação de DNA para expor o análogo nucleosídeo, conforme necessário para o BrdU7. Finalmente, a química do clique é altamente versátil, e pode ser usada para a rotulagem metabólica de DNA, RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos8,9,10,11. Se o alvo metabolicamente rotulado de interesse está na superfície celular, as células vivas podem ser rotulados12. Além disso, as células podem ser processadas para coloração imunofluorescente com anticorpos.
O seguinte protocolo descreve o uso da incorporação da UEd e clique na química para medir a proliferação de células musculares suaves vasculares humanas(Figura 1). Mostramos três maneiras diferentes de incorporação de EdU pode ser medido, resultados representativos de cada um, e suas vantagens e desvantagens. Medir a proliferação através da química do clique é particular útil para células de crescimento mais lentas e aderentes. Além disso, a morfologia da célula é bem conservada e a coloração baseada em anticorpos também pode ser realizada.
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Protocol
1. Detecção de EdU usando rótulo fluorescente
- Soluções de ações
- Prepare uma solução de ações edu de 5 mM adicionando 12,5 mg de EdU a 10 mL de H2O destilado duplo.
- Prepare os componentes da solução de rotulagem: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg em 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg em 1 mL H2O; fazer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg em 95,3 m HL 2 Ol2Ozi2 , armazenados em 5 μL alíquotas a -20 °C) e 1 M de ascorbate de sódio (200 mg em 1 mL H2O; faça fresco).
- Prepare a solução de ações resazurina a uma concentração de 0,15 mg/mL. Filtrar esterilizar e armazenar 1 mL adiantos a 4 °C.
NOTA: Picolyl azide está disponível conjugado a vários fluores diferentes, biotina e peroxidase rábano (HRP).
- Rotular células musculares lisas vasculares (VSMC) com EdU.
NOTA: Vsmcs humanos foram isolados das artérias ilíacas através de conseqüência de pedaços explantados de tecido. Quando cultivadas em mídia livre de soro com insulina, transferrina, selênio, essas células expressam marcadores VSMC smoothelin, cadeia pesada de miosina muscular lisa (SM-MHC) e SMC αactin13.- Células musculares lisas vasculares da placa em 2 x 104/mL no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) em uma placa de 96 poços.
NOTA: As células são cultivadas a 37 °C em mídia de células musculares lisas com 2% de soro bovino fetal. - (Opcional) Deixe várias horas para durante a noite para aadesão. Adicione 20 μL resazurin estoque para cada poço. Incubar a 37 °C para 3 h. Leia o sinal de fluorescência em um leitor de placa (560ex,594em). Substitua a mídia por um Novo DMEM.
NOTA: Esta etapa é opcional. A resazurina é usada para normalizar o número de celulares e explicar a variabilidade bem-a-bem em revestimento14. - Adicione soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) 30 ng/mL a 3 a 6 poços por tratamento no início do período cultural e incubar por 72 h.
- Diluir 5 mM EdU estoque para 1 mM. Adicione 2 μL a cada poço (concentração final 20 μM) para as últimas 24 h do período de cultura de 72 h. Não adicione edu a um conjunto de réplicas. Estes poços serão usados para determinar a fluorescência/luminescência do fundo.
NOTA: A duração da cultura e rotulagem com EdU é otimizada para células musculares lisas, mas pode precisar ser modificada por tipo de célula.
- Células musculares lisas vasculares da placa em 2 x 104/mL no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) em uma placa de 96 poços.
- Fixar células em paraformaldeído (PFA).
- Remover a mídia e adicionar 150 μL de 4% PFA (em PBS) por poço por 10 min à temperatura ambiente.
- Remover PFA e adicionar 150 μL de 1% de polietileno glicol tert-octilfenyl éter (TX-100) (em água) por poço por 30 min à temperatura ambiente.
- Retire o TX-100 lavando três vezes com a PBS.
CUIDADO: PFA é tóxico, lidar com cuidado.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As células fixas podem ser armazenadas na PBS a 4 °C.
- Detectar EdU incorporado.
- Faça a solução de rotulagem (10 mL por placa de 96 poços, usando 60 poços internos) pouco antes de usar, adicionando reagentes de soluções de ações na seguinte ordem: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 picolyl azide 5 μL, Na ascorbate 100 μL à PBS para um volume total de 10 mL.
- Retire pbs de poços e adicionar 150 μL de solução de rotulagem para cada poço. Incubar 30 min a 37 °C. Para detectar todos os núcleos, adicione 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a cada poço. Leia sobre um leitor de placa de fluorescência (Cy3 550ex,570em; DAPI 350ex,470em)ou imagem em um microscópio.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Células fixas e manchadas podem ser armazenadas em PBS a 4 °C e imagems posteriores.
2. Detecção de EdU usando luminescência
- Completa seções 1.1-1.3.
- Prepare sorline tris-buffered com polisorrbato de 0,1% 20 (TBST).
- Bloqueie poços.
- Adicione 150 μL de tampão de bloqueio(Tabela de Materiais)a cada poço e incubar por 90 min à temperatura ambiente.
- Remover o tampão de bloqueio e lavar três vezes com 200 μL de PBS.
- Detectar EdU incorporado.
- Faça a solução de rotulagem como direcionada na etapa 1.4.1, substituindo biotina picolyl azide por Cy3 picolyl azide.
- Lave poços cinco vezes com 200 μL de TBST, com agitação, 3 min por lavagem.
- Saciar peroxidases endógenas com 150 μL de 0,3% H2O2 para 20 min à temperatura ambiente.
- Retire h2o2 e lave cinco vezes com 200 μL de TBST, com agitação 3 min por lavagem.
- Diluir a peroxidase de streptavidin-rábano (SA-HRP; 1:200) no TBST e adicionar 50 μL a cada poço. Incubar 1 h à temperatura ambiente.
- Lave cinco vezes com 200 μL de TBST, com agitação, 3 min por lavagem.
- Adicione 50 μL de substo imunosorbent (ELISA) ligado a enzimas quimiculares (Tabela de Materiais)a cada poço.
- Leia imediatamente no leitor de placas capaz de detectar luminescência.
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Representative Results
Na Figura 2,demonstramos os resultados de três experimentos diferentes que medem a proliferação do VSMC em resposta ao PDGF. Depois de cultivar as células em meios de comunicação formulados para SMCs, realizamos o experimento em DMEM livre de soro, para eliminar quaisquer efeitos potenciais do soro ou fatores de crescimento na proliferação. Na Figura 2A comparamos os resultados, do mesmo experimento, usando uma leitura fluorescente vs luminescente. Para ler essas placas, usamos um leitor de microplacas multimodo que pode ler absorção, fluorescência e luminescência (ver Tabela de Materiais).
Usando o leitor da placa na modalidade bem da exploração, as leituras fluorescentes são calculadas em média sobre o poço inteiro. Este modo alivia imprecisões potenciais devido a diferenças entre o centro e as bordas do poço. No entanto, se muito poucos núcleos são positivos, a leitura resulta desta forma provavelmente subestima o "número" de células positivas quando apenas alguns são positivos. Número, com esta leitura, significa fluorescência em relação ao de outro poço, e não números exatos de células. Além disso, se houver uma fibra ou um aglomerado de células mortas que capta a fluorescência, isso será incluído na varredura da área. No entanto, a vantagem de usar o leitor de placa é o tempo. Enquanto a leitura no modo de digitalização leva de 15 a 20 segundos por poço, ela é automatizada em oposição ao método pessoal de uso intensivo de tempo de tirar fotos e analisá-las usando software de imagem.
Para corrigir o potencial subestima do método acima, convertemos a varredura fluorescente em uma leitura homogênea e líquida em que as células que tomam EdU são detectadas com uma moiety de azide-biotina, que por sua vez é detectada com peroxidase de streptavidin-horseradish (ver Figura 1). A quantidade de peroxidase de rábano é então quantificada usando um substrato padrão formatado para ELISA. A vantagem desta técnica é uma leitura mais homogênea, e a Figura 2A,B mostra exemplos de experimentos onde esse método foi empregado. Além disso, a placa pode ser lida em segundos. No entanto, existem desvantagens para este método. Primeiramente, o fundo com este método é mais elevado do que com fluorescência. Para diminuir o fundo, incorporamos uma etapa de bloqueio e múltiplas lavações. Como reflexo desse contexto, os controles negativos (células não tratadas) tendem a ser maiores, e o aumento da dobra na proliferação é menor. Em segundo lugar, como com a leitura de fluorescência, quaisquer fibras ou células mortas que pegar os reagentes de detecção irá adicionar à luminescência total.
Na tentativa de diminuir a variabilidade nos experimentos acima, normalizamos nossos resultados para a contagem inicial de células. Para ensaios de proliferação, a normalização tem que ser feita em células vivas no início do ensaio antes que as células se dividam. Além disso, o ensaio não pode afetar a função celular ou a incorporação da EdU. Dadas essas restrições, optamos por usar o metabolismo como um reflexo do número celular via resazurin14. Resultados com e sem normalização são mostrados na Figura 2B. No entanto, em um conjunto separado de experimentos, descobrimos que este método não é sensível o suficiente para detectar pequenas diferenças no número de células. Além disso, qualquer erro nesta leitura introduz mais erro em todo o experimento. Por estas razões, optoupor ter um cuidado extraordinário para as células da placa tão uniformemente quanto possível, e não realizar uma etapa de normalização.
Para ter certeza de que estávamos obtendo os resultados mais precisos possíveis, voltamos para coloração fluorescente (seção 1) e contando as células usando um microscópio de fluorescência invertida. A vantagem deste método é que se pode ver fisicamente e contar as células positivas, garantindo a maior precisão(Figura 3). Todos os restos fluorescentes podem ser excluídos da contagem. As contagens de antecedentes sem EdU são 0, pois não há fluorescência visível e, portanto, nenhum fundo para subtrair. A principal desvantagem deste método é o tempo. Para contar núcleos em células banhadas em uma placa de 96 poços, tiramos 3 fotos por poço de células positivas da EdU e células totais (DAPI), exigindo 6 imagens por poço. Tiramos fotos verticalmente do meio da parte superior ao fundo do poço, tomando cuidado para não se sobrepor e contar as células duas vezes. A contagem de células totais nos dá um segundo pedaço de dados que confirma nossos resultados de proliferação. No entanto, à luz do tempo de duplicação relativamente lento do VSMC (36-48 h), o aumento da dobra no total de células estimuladas com PDGF vs controles é muito menor do que o aumento da dobra das células positivas da EdU, razão pela qual medimos a incorporação da EdU(Figura 2C).
A maneira mais eficiente e precisa de contar células positivas e totais da EdU é usando um leitor de placas de imagem. Este método combina a precisão da contagem com a velocidade da automação. A principal desvantagem é que este equipamento não está disponível em todas as instituições. Ao comparar as contagens automatizadas vs manuais, a contagem manual positiva da EdU era essencialmente idêntica à contagem automatizada(Figura 2C,à esquerda), assim como as contagens totais não estimuladas(Figura 2C,à direita). No entanto, a contagem manual foi menor do que a contagem automatizada no total de células estimuladas por PDGF. Esta diferença provavelmente se relaciona com os padrões de crescimento celular. Porque as pilhas tendem a crescer no centro do poço, com números menores as contagens automatizadas e manuais eram quase idênticas. No entanto, com números mais elevados, havia provavelmente mais células nas bordas e as contagens manuais, que não capturavam células na periferia do poço, eram menos precisas.
Figura 1: Visão geral da detecção de EdU por fluorescência ou luminescência.
Vsmc ou outras células aderentes são tratados em condições de interesse. EdU é adicionado para os últimos 24 h do período de cultura e incorporado no DNA das células divisórias. A EdU incorporada é então detectada usando fluorescência (seção de protocolo 1) ou luminescência (seção de protocolo 2). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Medir a proliferação com leituras diferentes usando a incorporação de EdU e clique em química.
(A)VSMCs foram cultivados na presença ou ausência de PDGF. EdU foi adicionado os últimos 24 h da cultura, e a incorporação foi detectada pela fluorescência (seção 1 do protocolo) ou pela luminescência (seção 2 do protocolo). (B) Vsmcs foram tratados como descrito no painel A, e a incorporação da EdU foi medida pela luminescência. Os resultados foram normalizados para a contagem inicial de células usando ensaio de viabilidade da resazurina. Vsmcs foram tratados como no painel A, e a incorporação da EdU foi medida por fluorescência. As células positivas da EdU foram contadas automaticamente, usando um leitor de placas de imagem ou manualmente por imagem e, em seguida, contando usando software de imagem. Os resultados mostrados são o desvio padrão ± médio de 3-6 replica por tratamento.
Figura 3: Visualização de células positivas da EdU após protocolo de fluorescência de cliques.
Vsmc foram tratados conforme descrito na Figura 2,e incorporou EdU foi detectado usando fluorescência (protocolo seção 1). Cada imagem é um único poço de uma placa de 96 poços. Núcleos totais são mostrados em núcleos positivos de azul (DAPI) e EdU são verdes. Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A incorporação da UEd é uma forma simples e direta de medir a proliferação celular; é particularmente útil para as células aderentes13. Nosso protocolo usa células musculares lisas, mas é aplicável a qualquer célula aderente (epiteliais, endoteliais, etc.). Embora o protocolo não seja complicado, o único passo crítico é fazer a solução de rotulagem - os ingredientes devem ser adicionados na ordem listada. Além disso, como as manchas ocidentais quimiiluminescentes, se usar a leitura de luminescência, a placa deve ser lida imediatamente.
Várias partes do protocolo podem ser modificadas ou otimizadas conforme necessário. Uma parte é a duração da incubação com edu. Como nosso objetivo era detectar o maior número possível de células em proliferação, adicionamos edu para um total de 24 h antes de fixação e coloração. No entanto, este calendário provavelmente mede as células em ambas as fases S e G2/M. Para rotular apenas as células na fase S, Cecchini et al. aconselham que mesmo dividindo lentamente as células sejam incubadas com EdU por não mais de 6 horas7. Outra parte do protocolo que pode ser otimizado é a quantidade de quelator. As reações de alquino-azide requerem um catalisador de cobre (CuSO4). Thpta é um quelador de cobre que mantém o cobre no estado de oxidação necessário. A proporção de quelator para cobre pode ser variada, para aumentar a ligação alquino-azide. Observamos manchas brilhantes com uma razão de cobre de 2:1, no contexto de também usar picolyl azide. O picolyl moiety acrescenta atividade quelante que diminui a concentração de cobre necessária e aumenta a eficiência da reação15. Chelator: as proporções de cobre podem ser aumentadas, geralmente até 5:1, para otimizar as necessidades por investigador. Um melhor chelator, 2-[4-({bis[(1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amino}methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]ácido acetic (BTTAA), está agora disponível comercialmente16. Este quelante não estava disponível comercialmente quando derivamos este protocolo. Finalmente, embora utilizemos o paraformaldeído como fixador neste protocolo, as células podem ser fixadas com metanol, o que também evita a etapa de permeabilização. A fixação com metanol pode ser útil se quiser combinar coloração imunofluorescente de proteínas celulares específicas com a incorporação da EdU.
Uma desvantagem deste método é a citotoxicidade potencial da EdU, particularmente quando continuamente rotulando com EdU por dias, em oposição a um rótulo de pulso de horas. Dependendo das células utilizadas, EdU foi encontrado para causar parada no ciclo celular ou mesmo apoptose17. Esta toxicidade é pensada para ser devido à replicação defeituosa do ADN da adição de nucleosides artificiais18. Estudos têm mostrado que essa toxicidade é dependente da linha celular e dependente de concentração17. Não observamos nenhum problema com toxicidade em nossos estudos.
Em resumo, medir a proliferação via EdU e clicar em química tem várias vantagens sobre outros métodos comumente usados, como a incorporação BrdU ou 3H-tilmidina. Estes incluem evitar a radioatividade, alta especificidade com baixo fundo, e não há necessidade de duras etapas de desnaturação. Uma vez estabelecida, a química do clique é altamente versátil, e pode ser facilmente modificada para a rotulagem metabólica de RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Katie Carroll por assistência técnica. Agradecemos também ao Dr. David Cool e ao Laboratório de Análise Proteômica por instruções e fornecimento do leitor de placas de imagem Cytation. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Wright State Foundation (para L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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