Summary
増殖は細胞機能の重要な部分であり、新薬の潜在的な毒性を評価するために使用される一般的な読み出しである。したがって、増殖の測定は、細胞生物学において頻繁に使用されるアッセイである。ここでは、接着細胞および非付着細胞に使用できる増殖を測定するシンプルで汎用性の高い方法を提示します。
Abstract
細胞が増殖する能力は、ほとんどの細胞の正常な機能に不可欠であり、増殖の調節不全は多くの疾患プロセスの中心にある。これらの理由から、増殖の測定は細胞機能を評価するために使用される一般的なツールです。細胞増殖は、単にカウントすることによって測定することができます。しかし、これは増殖を測定する間接的な手段です。分裂する準備をする細胞を直接検出する一般的な手段の1つは、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによるものである。これらには、放射性ヌクレオシドアナログ3H-チミジンおよび5-ブロモ-2'デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)などの非放射性ヌクレオシド類似体が含まれる。EdUの組み込みは、BrdUと比較していくつかの利点を有するクリック化学によって検出される。本報告では、EdUの組み込みによる増殖を測定するためのプロトコルを提供する。このプロトコルには、さまざまな読み出しのオプションと、それぞれの長所と短所が含まれています。また、計画された実験の特定のニーズを満たすためにプロトコルを最適化または変更できる場所についても説明します。最後に、この基本的なプロトコルを他の細胞代謝産物を測定するために変更する方法について説明します。
Introduction
増殖は細胞機能1、2の重要な部分である。増殖の制御は、発達などの正常なプロセス、および癌および心血管疾患のような病理学的プロセスに影響を与える。血管平滑筋細胞の過形成成長は、例えば、アテローム性動脈硬化症3の前駆体であると考えられている。細胞増殖の変化は、新薬の潜在的な毒性を評価するためにも使用されます。その広範な影響を考えると、増殖の測定は多くの細胞生物学ベースの研究室の主力です。
細胞増殖は、目的の細胞集団がかなり急速に分裂する場合、単に細胞を数えることによって測定することができる。成長が遅い細胞の場合、細胞数の感度が低下する可能性があります。増殖は、多くの場合、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによって測定される。ゴールドスタンダードは3H-チミジンの組み込みですが、多くの研究所は、新しい非放射性代替品の入手可能性を考えると、この方法から脱却しています。これらには、細胞傷害性蛍光色素、細胞周期関連タンパク質の検出、および5-ブロモ-2'デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)4のような非放射性ヌクレオシド類似体の組み込みが含まれる。
カルボキシフルオレセインジアセテートコハシニジルエステル(CFSE)などの細胞質色素は、細胞が5個分裂するたびに色素の強度が半分になるため増殖を検出する。この技術は、非付着細胞のフローサイトメトリーで一般的に使用されます。接着細胞にはあまり使用されていませんが、新世代のイメージングプレートリーダーではこれが変わる可能性があります。抗体ベースの技術(フローサイトメトリー、免疫組織化学など)による細胞周期関連タンパク質の検出は、組織または非付着細胞にしばしば使用される。これらの細胞/組織は、染色前に固定し、透過する必要があります。ヌクレオシド類似体BrdUおよびEdUは、3H-チミジンへのアプローチが似ているが、放射能の不便さがない。BrdUの組み込みは抗BrdU抗体によって検出されるため、細胞は染色前に固定され、透過する必要があります。さらに、細胞はBrdUエピトープを露出させるためにDNaseで処理されなければならない。
EdUの組み込みは、アルキンとアジドが触媒銅の存在下で一緒に「クリック」をグループ化するクリックケミストリーによって検出されます。いずれの基も、生合成的に組み込まれた分子または検出分子4として機能することができる。市販のヌクレオシド類似体は、アルキン基が付着している。増殖アッセイの場合、従って、アルキン機能化ヌクレオシドアナログは、蛍光色素または他のマーカーに共役したアジドによって検出される。EdUの組み込みには、BrdUに対していくつかの利点があります。まず、アルキン基とアジド基は哺乳動物細胞に見つからないため、この相互作用は低いバックグラウンド6で非常に特異的である。両方の基が小さいので、細胞はBrdU7に必要な核酸類似体を露出させるためにDNA変性を受ける必要はない。最後に、クリックケミストリーは汎用性が高く、DNA、RNA、タンパク質、脂肪酸、および炭水化物8、9、10、11の代謝標識に使用することができる。目的とする代謝標識ターゲットが細胞表面上にある場合、生細胞は12と標識することができる。さらに、細胞は抗体による免疫蛍光染色のためにさらに処理することができる。
次のプロトコルは、ヒト血管平滑筋細胞における増殖を測定するためのEdU組み込みおよびクリック化学の使用について説明する(図1)。EdUの組み込み方法、それぞれ代表的な結果、長所と短所の3つの異なる方法を示します。クリックケミストリーによる増殖の測定は、付着性、成長の遅い細胞に特に有用である。また、細胞の形態は良好に維持され、抗体ベースの染色も行うことができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 蛍光標識を用いたEdUの検出
- ストックソリューション
- 二重蒸留H2Oの10 mLにEdUの12.5 mgを加えて5 mM EdUのストックソリューションを準備します。
- ラベリング液成分を調製する: 200 mM トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン (THPTA) (1.15 mL H2O で 100 mg), 100 mM CuSO4 (1 mL H 2 O; 1 mL H2O;10 mM S3 ピコリルアジド (1 mg in 95.3L で 1 mg)-20°Cで5μLアリコート、および1Mアスコルビン酸ナトリウム(1mLH2Oで200mg;新鮮にする)に保存する。
- 0.15 mg/mLの濃度でレサズリン原液を調製する。フィルター滅菌し、4 °Cで1 mLのアリコートを保存します。
注:ピコリルアジドは、いくつかの異なるフッ素、ビオチン、および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に共役して利用可能です。
- 血管平滑筋細胞(VSMC)にEdUでラベルを付けます。
注:ヒトVSMCは、剥離した組織からの増殖を介して腸骨動脈から単離した。インスリンを用いた血清遊離媒体で増殖すると、トランスフェリン、これらの細胞はVSMCマーカースムーセリン、平滑筋ミオシン重鎖(SM-MHC)およびSMCαactin13を発現する。- 96ウェルプレート中のダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の2 x 104/mLの板血管平滑筋細胞。
注:細胞は、2%の胎児ウシ血清を有する平滑筋細胞媒性で37°Cで増殖する。 - (省略可能) このオプションを選択します。付着のために一晩に数時間を許可します。各井戸に20°Lレサズリンストックを加えます。37°Cで3時間インキュベートし、プレートリーダー(560 ex、594em)で蛍光信号を読み取ります。メディアを新しい DMEM に置き換えます。
注: この手順はオプションです。レサズリンは、細胞番号を正規化し、めっき14の十分な変動を考慮するために使用されます。 - リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または血小板由来成長因子(PDGF)30ng/mLを培養期間開始時の治療あたり3−6ウェルに添加し、72時間インキュベートする。
- 5 mM EdU ストックを 1 mM に希釈します。72時間培養期間の最後の24時間に2μLを各ウェル(最終濃度20μM)を加えます。1 セットのレプリケートに EdU を追加しないでください。これらの井戸は、バックグラウンド蛍光/発光を決定するために使用されます。
注:EdUによる培養およびラベリングの持続時間は、平滑筋細胞用に最適化されていますが、細胞タイプごとに変更する必要がある場合があります。
- 96ウェルプレート中のダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の2 x 104/mLの板血管平滑筋細胞。
- パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。
- メディアを取り外し、室温で10分間、ウェルあたり4%PFA(PBS)の150 μLを加えます。
- PFAを取り出し、室温で30分間ウェルあたり150μLのポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル(TX-100)(水中)を加えます。
- PBSで3回洗ってTX-100を取り外します。
注意:PFAは有毒であり、注意して取り扱います。
注: プロトコルはここで一時停止できます。固定細胞は、4°CでPBSに保存することができる。
- 組み込まれた EdU を検出します。
- バーラリング溶液(96ウェルプレートあたり10mL、インナー60ウェルを使用)を製造する直前に、ストック溶液から試薬を次の順序で追加します:THPTA 20 μL、CuSO4 20 μL、Cy3ピコリルアジド5μL、ナアスコルビン酸100μLをPBSに10mLの総体積で追加します。
- 井戸からPBSを取り出し、各ウェルに150°Lのラベリング液を追加します。37°Cで30分インキュベートする。すべての核を検出するには、各ウェルに4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を追加します。蛍光プレートリーダーで読む (Cy3 550ex,570em;DAPI 350ex、470em)または顕微鏡上の画像。
注: プロトコルはここで一時停止できます。固定および染色された細胞は4°CでPBSに貯蔵し、後でイメージすることができる。
2. 発光を用いたEdUの検出
- セクション1.1~1.3を完了します。
- 0.1%ポリソルベート20(TBST)でトリス緩衝生理線を調製します。
- 井戸をブロックします。
- 150°Lのブロッキングバッファ(材料表)を各ウェルに加え、室温で90分間インキュベートします。
- ブロッキングバッファを取り外し、200μLのPBSで3回洗浄します。
- 組み込まれた EdU を検出します。
- ステップ1.4.1の指示に従ってラベリング液を作り、Cy3ピコリルアジ化物にビオチンピコリルアジ化物を置き換えます。
- TBSTの200°Lで5回、振り回し、1回の洗浄で3分を洗浄します。
- 室温で20分間0.3%H2O2の150°Lの内因性ペルオキシダーゼをクエンチ。
- H2O2を取り出し、TBSTの200°Lで5回洗浄し、1回の洗浄につき3分振ります。
- TBSTでストレプトアビジンワサビエペルオキシダーゼ(SA-HRP;1:200)を希釈し、各ウェルに50 μLを加えます。室温で1時間インキュベートする。
- TBSTの200°Lで5回、振って、1回の洗浄で3分を洗浄します。
- 化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)基質(材料表)をそれぞれウェルに50μL加えます。
- 発光を検出できるプレートリーダーですぐに読みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図2では、PDGFに応答してVSMCの増殖を測定する3つの異なる実験の結果を示す。SMC用に配合された媒介で細胞を増殖させた後、血清フリーDMEMで実験を行い、血清または増殖因子の増殖に対する潜在的な影響を排除した。図2Aでは、同じ実験の結果を、蛍光対発光読み出しを用いて比較する。これらのプレートを読み取るために、吸光度、蛍光、発光を読み取ることができるマルチモードマイクロプレートリーダーを使用しました(材料表を参照)。
スキャンウェルモードでプレートリーダーを使用して、蛍光測定値は井戸全体にわたって平均化されます。このモードは、井戸の中心とエッジの違いによる潜在的な不正確さを軽減します。しかし、非常に少数の核が陽性である場合、この方法で読み取ると、陽性細胞の「数」が過小に過ぎない可能性が高くなります。この読み出しを使用する数値は、別の井戸の蛍光に対する蛍光を意味し、正確な細胞番号ではありません。さらに、蛍光を拾う繊維や死んだ細胞の塊がある場合、これはエリアスキャンに含まれます。ただし、プレートリーダーを使用する利点は時間です。スキャンモードでの読み取りは井戸あたり15~20秒かかりますが、画像を撮ってイメージングソフトウェアを使用して分析する個人的な時間のかかる方法とは対照的に自動化されています。
上記の方法から潜在的な過小評価を修正するために、我々は、EdUを取る細胞がアジドビオチン部分で検出される均質な液体読み出しに蛍光スキャンを変換し、ストレプトアビジンワサビドペルオキシダーゼで検出される(図 1を参照)。その後、わさびペルオキシダーゼの量は、ELISA用にフォーマットされた標準基板を用いて定量される。この技術の利点は、より均質な読み出しであり、図2A,Bは、この方法が採用された実験の例を示す。さらに、版は数秒で読み取ることができる。ただし、この方法には欠点があります。まず、この方法の背景は蛍光よりも高い。背景を減らすために、ブロッキングステップと複数のワッシュを組み込んだ。この背景の反射として、陰性対照(未処理細胞)は高くなる傾向があり、増殖のフォールド増加は低い。第二に、蛍光読み出しと同様に、検出試薬を拾う繊維または死んだ細胞は、総発光に追加されます。
上記の実験で変動性を低下させようと、結果を初期細胞数に正規化しました。増殖アッセイの場合、細胞が分裂する前にアッセイの開始時に生細胞で正規化を行う必要があります。さらに、アッセイは、細胞機能またはEdUの組み込みに影響を与えることはできません。これらの制約を考えると、レサズリン14を介して細胞数の反射として代謝を使用することを選択した。正規化の有無にかかわらず結果を図2Bに示します。しかし、別の実験セットでは、この方法は細胞数の小さな違いを検出するのに十分な感度ではないことがわかりました。さらに、この読み出しでエラーが発生すると、実験全体でより多くのエラーが発生します。これらの理由から、我々は可能な限り均等にプレートセルに特別な注意を払い、正規化のステップを実行しないことを選択しました。
可能な限り正確な結果を得るために、蛍光染色(セクション1)に戻し、反転蛍光顕微鏡を使用して細胞をカウントしました。この方法の利点は、正の細胞を物理的に見てカウントし、最も正確さを確保できることです (図 3)。任意の蛍光破片は、カウントから除外することができます。EdU を使用しないバックグラウンドカウントは、目に見える蛍光がないため、0 であるため、減算する背景はありません。この方法の主な欠点は時間です。96ウェルプレートでめっきされた細胞の核を数えるために、EdU陽性細胞と全細胞(DAPI)の両方のウェルごとに3枚の写真を撮り、ウェルごとに6枚の画像を必要とします。上部の中央から井戸の下まで垂直に写真を撮り、セルが重なり合ったりカウントしたりしないように注意します。総細胞数は、増殖結果を確認する2番目のデータを提供します。しかし、VSMCの比較的遅い倍増時間(36−48時間)に照らして、PDGF対コントロールで刺激された全細胞の折り畳み増加はEdU陽性細胞のフォールド増加よりもはるかに低く、そのためEdUの組み込みを測定する(図2C)。
EdU陽性および総細胞を数える最も効率的で正確な方法は、イメージングプレートリーダーを使用することです。この方法は、カウントの精度と自動化の速度を組み合わせたものです。主な欠点は、この機器がすべての機関で利用できるわけではないということです。自動カウントと手動カウントを比較する場合、EdU 陽性手動カウントは、アテンスされていない合計数 (図 2C右) と同じように、基本的に自動カウント (図 2C、左) と同じでした。しかしながら、手動カウントは、PDGF刺激細胞の総における自動カウントよりも低かった。この違いは、細胞の成長パターンに関連する可能性が高い.細胞は井戸の中心で成長する傾向があるため、数が少ない場合、自動数と手動カウントはほぼ同じでした。しかし、数値が大きいほど、エッジにはより多くのセルがあり、井戸の周辺で細胞を捕捉しなかった手動カウントは精度が低かった。
図1:蛍光または発光によるEdU検出の概要
VSMCまたは他の付着細胞は、目的の条件下で処理される。EdUは、培養期間の最後の24時間のために添加され、分裂細胞のDNAに組み込まれる。組み込まれたEdUは、次いで、蛍光(プロトコルセクション1)または発光(プロトコルセクション2)を使用して検出される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EdUの組み込みとクリックケミストリーを用いて、異なる読み出しで増殖を測定する。
(A)VSMCは、PDGFの有無において培養した。EdUは培養の最後の24時間を添加し、組み込みは蛍光(プロトコルセクション1)または発光(プロトコルセクション2)のいずれかによって検出された。(B)VSMCはパネルAに記載のように処理し、EdUの組み込みを発光により測定した。結果は、レサズリン生存率アッセイを用いて初期細胞数に正規化した。(C)VSMCをパネルAのように処理し、EdUの組み込みを蛍光法で測定した。EdU陽性細胞を自動的にカウントし、撮像プレートリーダーを用いて、またはイメージングソフトウェアを用いて手動でカウントした。示された結果は、治療あたりの3〜6反復の平均±標準偏差である。
図3:クリック蛍光プロトコルに続くEdU陽性細胞の可視化
VSMCを図2に記載のように処理し、組み込まれたEdUを蛍光を用いて検出した(プロトコルセクション1)。各画像は、96ウェルプレートの単一のウェルです。全核は青色(DAPI)で示され、EdU陽性核は緑色である。スケール バー = 50 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EdUの組み込みは、細胞増殖を測定するための簡単で簡単な方法です。これは、接着細胞13に特に有用である。当社のプロトコルは平滑筋細胞を使用しますが、任意の付着細胞(上皮、内皮など)に適用可能です。プロトコルは複雑ではありませんが、1つの重要なステップはラベリングソリューションを作ることであり、成分はリストされている順序で追加する必要があります。また、化学発光ウェスタンブロットと同様に、発光読み出しを使用する場合は、プレートを直ちに読み取る必要があります。
プロトコルのいくつかの部分は、必要に応じて変更または最適化できます。1 つの部分は、EdU でのインキュベーションの持続時間です。私たちの目標は、できるだけ多くの増殖細胞を検出することだったので、固定および染色の前に完全な24時間EdUを追加しました。ただし、このタイミングは、S フェーズと G2/M フェーズの両方でセルを測定する可能性があります。S相の細胞のみを標識するには、Cecchiniらからでも、ゆっくりと分裂した細胞を6時間以内にEdUでインキュベートすることをアドバイスする。最適化できるプロトコルのもう 1 つの部分は、キレートの量です。アルキンアジド反応には銅触媒(CuSO4)が必要です。THPTAは、必要な酸化状態で銅を維持する銅キレート剤です。銅に対するキレート剤の比率は、アルキンアジド結合を増加させるために変化させることができる。キレート剤で明るい染色を観察する:銅比2:1、ピコリルアジドも使用した場合。ピコリル部分は、必要な銅の濃度を低下させ、反応15の効率を高めるキレート活性を追加する。Chelator:銅比は、通常は最大5:1まで増やすことができ、調査者ごとのニーズを最適化します。より良いキレート剤は、2-[{bis[(1-tert-ブチル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-yl)メチル}メチル}メチル)-1H-1,2,2,3-トリアゾール-1-イル]酢酸(BTTAA)が市販されている16.このキレートは、最初にこのプロトコルを取得したとき市販されていませんでした。最後に、このプロトコルではパラホルムアルデヒドを固定剤として使用しますが、細胞はメタノールで固定することができ、これも透過工程を回避します。メタノールによる固定は、特定の細胞タンパク質の免疫蛍光染色とEdUの組み込みを組み合わせたい場合に役立ちます。
この方法の欠点の1つは、特に時間のパルス標識とは対照的に数日間EdUで連続的に標識する場合に、EdUの潜在的な細胞傷害性である。使用される細胞に応じて、EdUは細胞周期停止またはアポトーシス17を引き起こすことが分かった。この毒性は、人工ヌクレオシド18の添加によるDNA複製の欠陥によるものと考えられている。研究は、この毒性が細胞株依存および濃度依存性17であることを示している。我々の研究では毒性に関する問題は観察されなかった。
要約すると、EdUおよびクリック化学を介して増殖を測定することは、BrdUまたは3H-チミジン組み込みのような他の一般的に使用される方法よりもいくつかの利点を有する。これには、放射能の回避、低い背景を持つ高い特異性、過酷な変性ステップの必要がないことが含まれます。いったん確立されると、クリックケミストリーは汎用性が高く、RNA、タンパク質、脂肪酸、炭水化物の代謝標識のために容易に変更することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
ケイティ・キャロルの技術支援に感謝します。また、ドクター・デビッド・クールとプロテオミクス解析研究所のサイエンスイメージングプレートリーダーの指導と提供に感謝します。この作品はライト州財団の助成金(L.E.W.へ)によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
