Summary
Spredning er en kritisk del av mobilnettet funksjon, og en felles avlesning brukes til å vurdere potensiell toksisitet av nye legemidler. Måling av spredning er derfor en hyppig brukt analyse i cellebiologi. Her presenterer vi en enkel, allsidig metode for å måle spredning som kan brukes i tilhenger og ikke-tilhenger celler.
Abstract
Evnen til å spre en celle er en vesentlig del av den normale funksjonen til de fleste celler, og feilregulering av spredning er kjernen i mange sykdoms prosesser. Av disse grunner er måling av spredning et vanlig verktøy som brukes til å vurdere celle funksjon. Celle spredning kan måles bare ved å telle; Dette er imidlertid en indirekte måte å måle spredning. En vanlig måte å direkte oppdage celler forbereder å dele er ved inkorporering av merket nukleosid analogs. Disse inkluderer det radioaktive nukleosid analoge 3H-tymidin pluss ikke-radioaktive nukleosid analogs, for eksempel 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (BrdU) og 5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). Innlemmelse av EdU oppdages ved å klikke kjemi, som har flere fordeler sammenlignet med BrdU. I denne rapporten gir vi en protokoll for måling av spredning ved inkorporering av EdU. Denne protokollen inkluderer alternativer for ulike readouts, sammen med fordeler og ulemper ved hver. Vi diskuterer også steder der protokollen kan optimaliseres eller endres for å imøtekomme de spesifikke behovene til planlagt eksperiment. Til slutt berører vi på måter som denne grunnleggende protokollen kan endres for å måle andre celle metabolitter.
Introduction
Spredning er en kritisk del av cellulær funksjon1,2. Kontroll av spredning påvirker normale prosesser som utvikling, og patologisk prosesser som kreft og kardiovaskulær sykdom. Hyperplastisk vekst av vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, antas å være en forløper til aterosklerose3. Endringer i celle spredning brukes også til å vurdere potensiell toksisitet av nye legemidler. Gitt den utbredte virkningen, er måling av spredning en bærebjelke i mange cellebiologi-baserte laboratorier.
Celle spredning kan måles ved å bare telle celler hvis cellen befolkning av interesse skiller ganske raskt. Celle antall kan være mindre følsomme for tregere voksende celler. Spredning måles ofte ved innlemmelse av merket nukleosid analogs. Selv om gullstandarden er 3H-tymidin innlemmelse, mange laboratorier får bort fra denne metoden gitt tilgjengeligheten av nyere, ikke-radioaktive alternativer. Disse inkluderer cytoplasmatiske fluorescerende fargestoffer, påvisning av celle syklus assosierte proteiner, og innlemmelse av ikke-radioaktive nukleosid analogs som 5-bromo-2 ' deoxyuridine (BrdU) og 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Cytoplasmatiske fargestoffer, for eksempel carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester (CFSE), oppdage spredning fordi intensiteten av Dye halvdelene hver gang cellen skiller5. Denne teknikken brukes vanligvis i flyt flowcytometri for ikke-tilhenger celler. Det har ikke vært brukt mye for tilhenger celler, men med den nye generasjonen av bilde plate lesere dette kan endre seg. Påvisning av celle syklus forbundet proteiner gjennom antistoff-baserte teknikker (Flow flowcytometri, immunhistokjemi, etc.) brukes ofte for vev eller ikke-tilhenger celler. Disse cellene/vev må festes og permeabilized før farging. Nukleosid analogs BrdU og EdU er like i tilnærming til 3H-tymidin, men uten at det inntrufne radioaktivitet. Inkorporering av BrdU oppdages av anti-BrdU-antistoffer, og derfor må cellene festes og permeabilized før farging. I tillegg må celler behandles med DNase for å eksponere BrdU-epitope.
Innlemmelse av EdU oppdages ved å klikke kjemi, der alkyne og Natriumazid grupper "Klikk" sammen i nærvær av katalysator kobber. Begge grupper kan tjene som biosynthetically innarbeidet molekyl eller deteksjon molekyl4. Kommersielt tilgjengelige nukleosid analogs har alkyne gruppen vedlagt. For spredning analyser, derfor alkyne funksjonalisert nukleosid analoge oppdages av en Natriumazid bøyd til et fluorescerende fargestoff eller annen markør. Innlemmelse av EdU har flere fordeler fremfor BrdU. Først fordi alkyne og Natriumazid grupper ikke finnes i pattedyrceller, er denne interaksjonen svært spesifikk med en lav bakgrunn6. Fordi begge gruppene er små, trenger ikke cellene å gjennomgå DNA-denaturering for å eksponere nukleosid analog som kreves for BrdU7. Til slutt, klikk kjemi er svært allsidig, og kan brukes til metabolsk merking av DNA, RNA, protein, fettsyrer, og karbohydrater8,9,10,11. Hvis metabolically merket mål av interesse er på celleoverflaten, kan levende celler være merket12. I tillegg kan celler bli ytterligere behandlet for immunofluorescent farging med antistoffer.
Følgende protokoll beskriver bruken av EdU innlemmelse og klikk kjemi for å måle spredning i menneskelige vaskulære glatte muskelceller (figur 1). Vi viser tre forskjellige måter innlemmelse av EdU kan måles, representative resultater fra hver, og deres fordeler og ulemper. Måling av spredning via Klikk kjemi er spesielt nyttig for tilhenger, tregere voksende celler. I tillegg er morfologi av cellen godt vedlikeholdt og antistoff-baserte flekker kan også utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. påvisning av EdU med fluorescerende etikett
- Stock-løsninger
- Forbered en 5 mM EdU lagerløsning ved å legge 12,5 mg EdU til 10 mL dobbel destillert H2O.
- Klargjør komponentene for merkings løsningen: 200 mM Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) (100 mg i 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg i 1 ml H2O; lag fersk), 10 mm Cy3 picolyl-Natriumazid (1 mg i 95,3 ml h2o , lagret i 5 μL alikvoter ved-20 ° c), og 1 M natrium ascorbate (200 mg i 1 mL H2O; lag fersk).
- Forbered resazurin lagerløsning ved en konsentrasjon på 0,15 mg/mL. Filteret steriliseres og oppbevares 1 mL alikvoter ved 4 ° c.
Merk: Picolyl Natriumazid er tilgjengelig som bøyes likt til flere forskjellige fluors, biotin og pepperrot peroksidase (HRP).
- Label vaskulære glatte muskelceller (VSMC) med EdU.
Merk: Human VSMCs ble isolert fra iliaca arterier via utvekst fra eksplanterte biter av vev. Når dyrket i serum frie medier med insulin, transferrin, selen disse cellene uttrykker VSMC markører smoothelin, glatt muskel myosin tung kjede (SM-MHC) og SMC αactin13.- Plate vaskulær glatte muskelceller ved 2 x 104/ml i Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) i en 96 brønn plate.
Merk: cellene dyrkes på 37 ° c i glatt muskel celle Media med 2% fosterets storfe serum. - Valgfritt Tillat flere timer til over natten for etterlevelse. Tilsett 20 μL resazurin lager til hver brønn. Ruge ved 37 ° c for 3 h. Les fluorescens signalet i en plate leser (560ex, 594EM). Erstatt medier med frisk DMEM.
Merk: dette trinnet er valgfritt. Resazurin brukes til å normalisere celle tall og gjøre rede for brønn-til-brønn variasjon i plating14. - Legg til fosfat bufret saltvann (PBS) eller blodplate avledet vekstfaktor (PDGF) 30 ng/mL til 3 − 6 brønner per behandling ved begynnelsen av kultur perioden og ruge for 72 h.
- Fortynne 5 mM EdU lager til 1 mM. Tilsett 2 μL i hver brønn (siste konsentrasjon 20 μM) for de siste 24 h av 72 h kultur perioden. Ikke Legg til EdU i ett sett med replikeres. Disse brønnene vil bli brukt til å bestemme bakgrunns fluorescens/luminescence.
Merk: varigheten av kultur og merking med EdU er optimalisert for glatte muskelceller, men må kanskje endres per celle type.
- Plate vaskulær glatte muskelceller ved 2 x 104/ml i Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) i en 96 brønn plate.
- Fiks celler i paraformaldehyde (PFA).
- Fjern Media og tilsett 150 μL av 4% PFA (i PBS) per brønn i 10 min ved romtemperatur.
- Fjern PFA og tilsett 150 μL av 1% polyetylen glykol tert-octylphenyl ETER (TX-100) (i vann) per brønn i 30 min ved romtemperatur.
- Fjern TX-100 ved å vaske tre ganger med PBS.
FORSIKTIG: PFA er giftig, håndteres med forsiktighet.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Faste celler kan lagres i PBS ved 4 ° c.
- Registrer innlemmet EdU.
- Lag merkings løsning (10 mL per 96 brønn plate ved bruk av indre 60 brønner) like før bruk ved å legge til reagenser fra lager løsninger i følgende rekkefølge: THPTA 20 μL, CuSO4 20 ΜL, Cy3 picolyl Natriumazid 5 ΜL, Na ascorbate 100 ΜL til PBS for et total volum på 10 ml.
- Fjern PBS fra brønner og tilsett 150 μL av merkings løsning til hver brønn. Ruge 30 min ved 37 ° c. Å oppdage alle kjerner, tilsett 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til hver brønn. Les på en fluorescens plate leser (Cy3 550ex, 570EM; DAPI 350ex, 470EM) eller bildet på et mikroskop.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Faste og fargede celler kan lagres i PBS ved 4 ° c og avbildet på et senere tidspunkt.
2. påvisning av EdU med luminescence
- Komplette seksjoner 1.1 – 1.3.
- Klargjør Tris-bufret saltvann med 0,1% polysorbat 20 (TBST).
- Blokker brønner.
- Tilsett 150 μL av blokkerings buffer (materialfortegnelsen) i hver brønn og ruge i 90 min. ved romtemperatur.
- Fjern blokkerende buffer og vask tre ganger med 200 μL av PBS.
- Registrer innlemmet EdU.
- Gjør merking løsning som anvist i trinn 1.4.1, erstatte biotin picolyl Natriumazid for Cy3 picolyl Natriumazid.
- Vask brønner fem ganger med 200 μL av TBST, med risting, 3 min per vask.
- Slukke endogene peroxidases med 150 μL av 0,3% H2O2 for 20 min ved romtemperatur.
- Fjern H2O2 og vask fem ganger med 200 μL av TBST, med risting 3 min per vask.
- Fortynne streptavidin-pepperrot peroksidase (SA-HRP; 1:200) i TBST og tilsett 50 μL til hver brønn. Ruge 1 time ved romtemperatur.
- Vask fem ganger med 200 μL av TBST, med risting, 3 min per vask.
- Tilsett 50 μL av chemiluminiscerende enzym-koblet immunosorbentanalyse-analyse (ELISA) substrat (tabell av materialer) til hver brønn.
- Les umiddelbart i plate leser i stand til å oppdage luminescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2viser vi utfallet av tre ulike eksperimenter som måler SPREDNING av VSMC som svar på PDGF. Etter å ha vokst cellene i Media formulert for SMCs, utførte vi eksperimentet i serum gratis DMEM, for å eliminere eventuelle effekter av serum eller vekstfaktorer på spredning. I figur 2a sammenligner vi resultater, fra samme eksperiment, ved hjelp av et fluorescerende vs selvlysende avlesning. For å lese disse platene brukte vi en multimode mikroplate leser som kan lese absorbansen, fluorescens og luminescence (se tabell over materialer).
Ved hjelp av plate leseren i skanne brønn modus, er fluorescerende målinger gjennomsnitt over hele brønnen. Denne modusen reduserer potensielle unøyaktigheter på grunn av forskjeller mellom midten og kantene av brønnen. Men hvis svært få kjerner er positive, lesing resultater på denne måten trolig undervurderer "antall" av positive celler når bare noen få er positive. Nummer, med denne avlesning, betyr fluorescens forhold til at en annen brønn, og ikke eksakt celle tall. I tillegg, hvis det er en fiber eller en klump av døde celler som plukker opp fluorescens, vil dette bli inkludert i området skanningen. Men fordelen med å bruke plate leseren er tid. Stund lesing inne skanning måte tar 15 − 20 sekunder per frisk, det er en automatisert i motsetning til det personlig tid-intens metoden av tar kinofilmene og analyserer seg benytter tenkelig programvare.
For å korrigere potensielle undervurderer fra ovenstående metode, konverterte vi den fluorescerende skanningen til en homogen, væske avlesning der celler som tar opp EdU oppdages med en Natriumazid-biotin-moiety, som igjen oppdages med streptavidin-pepperrot peroksidase (se figur 1). Mengden av pepperrot peroksidase er deretter kvantifisert ved hjelp av et standard substrat formatert for ELISA. Fordelen med denne teknikken er en mer homogen avlesning, og figur 2a, B viser eksempler på eksperimenter der denne metoden var ansatt. I tillegg kan platen leses i sekunder. Det er ulemper til denne metoden, imidlertid. For det første er bakgrunnen med denne metoden høyere enn med fluorescens. For å redusere bakgrunnen, har vi innarbeidet et blokkerings trinn og flere vasker. Som en refleksjon av denne bakgrunnen, negative kontroller (ubehandlede celler) tendens til å være høyere, og fold økningen i spredning er lavere. For det andre, som med fluorescens avlesning, vil eventuelle fibre eller døde celler som plukker opp deteksjon reagensene legge til den totale luminescence.
I et forsøk på å redusere variasjon i eksperimentene ovenfor, normalisert vi resultatene til innledende celle tellinger. For spredning analyser, normalisering må gjøres på levende celler i begynnelsen av analysen før cellene skillet. I tillegg kan ikke analysen påvirke celle funksjon eller implementering av EdU. Gitt disse begrensningene, valgte vi å bruke metabolisme som en refleksjon av celle nummer via resazurin14. Resultater med og uten normalisering er vist i figur 2b. Men i et eget sett med eksperimenter fant vi at denne metoden ikke er følsom nok til å oppdage små forskjeller i celle tall. I tillegg introduserer eventuelle feil i denne avlesning mer feil i hele eksperimentet. Av disse grunner, har vi valgt å ta ekstraordinære forsiktighet til plate celler så jevnt som mulig, og ikke utføre en normalisering trinn.
For å være sikker på at vi får mest mulig nøyaktige resultater, vi tilbake til fluorescerende flekker (del 1) og telling celler ved hjelp av en invertert fluorescens mikroskop. Fordelen med denne metoden er at man kan fysisk se og telle de positive cellene, noe som sikrer mest mulig nøyaktighet (Figur 3). Eventuelle fluorescerende rusk kan utelukkes fra tellingen. Bakgrunn teller uten EdU er 0 som det ikke er synlig fluorescens, og derfor ingen bakgrunn å trekke. Den største ulempen med denne metoden er tid. For å telle kjerner i celler belagt i en 96 brønn plate, tar vi 3 bilder per brønn av både EdU positive celler og totalt celler (DAPI), som krever 6 bilder per brønn. Vi tar bilder vertikalt fra midsection av toppen til bunnen av brønnen, ta vare ikke å overlappe og telle celler to ganger. Telling av totale celler gir oss en andre del av data som bekrefter våre sprednings resultater. Men i lys av den relativt langsomme dobling av VSMC (36 − 48 h), er fold økningen i total celler stimulert med PDGF vs kontroller mye lavere enn den fold økningen av EdU positive celler, som er grunnen til at vi måler innlemmelse av EdU (figur 2C).
Den mest effektive og nøyaktige måten å telle EdU-positive og totale celler på, er ved hjelp av en bilde plate leser. Denne metoden kombinerer nøyaktigheten av telling med hastigheten på automatisering. Den største ulempen er at denne delen av utstyret ikke er tilgjengelig på hver institusjon. Ved sammenligning av automatiserte kontra manuelle tellinger var EdU-den positive manuelle tellingen i hovedsak identisk med den automatiserte tellingen (figur 2C, Left), og det samme var de totale unstimulated tallene (figur 2C, høyre). Imidlertid var manuell telling lavere enn den automatiserte telle i totalt PDGF-stimulert celler. Denne forskjellen er sannsynligvis relatert til cellevekst mønstre. Fordi cellene har en tendens til å vokse i sentrum av brønnen, med mindre tall den automatiserte og manuelle teller var nesten identiske. Men med høyere tall var det sannsynlig flere celler på kantene og den manuelle teller, som ikke fange celler i utkanten av brønnen, var mindre nøyaktig.
Figur 1: oversikt over EdU deteksjon av fluorescens eller luminescence.
VSMC eller andre tilhenger celler behandles under forhold av interesse. EdU er lagt til for de siste 24 h av kultur perioden og innlemmet i DNA av å dele celler. Deretter blir Incorporated oppdaget ved hjelp av fluorescens (protokoll del 1) eller luminescence (protokoll del 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: måle spredning med ulike readouts ved hjelp av innlemmelse av EdU og klikk kjemi.
(A) VSMCs ble kultivert i nærvær eller fravær av PDGF. EdU ble lagt til de siste 24 h av kulturen, og innlemmelse ble oppdaget av enten fluorescens (protokoll del 1) eller luminescence (protokoll del 2). (B) VSMCs ble behandlet som beskrevet i panel A, og innlemmelse av EdU ble målt ved luminescence. Resultatene ble normalisert til første celle teller med resazurin levedyktighet analysen. (C) VSMCs ble behandlet som i panel A, og innlemmelse av EdU ble målt ved fluorescens. EdU positive celler ble automatisk telt, ved hjelp av en bilde plate leser, eller manuelt av bildebehandling og deretter telle ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Resultatene som vises er gjennomsnittlig ± standardavvik på 3 – 6 replikerer per behandling.
Figur 3: visualisering av EdU positive celler følgende Klikk fluorescens protokoll.
VSMC ble behandlet som beskrevet i figur 2, og innlemmet EdU ble oppdaget ved hjelp av fluorescens (protokoll del 1). Hvert bilde er en enkelt brønn av en 96 brønn plate. Totalt kjerner er vist i blått (DAPI) og EdU positive kjerner er grønne. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innlemmelse av EdU er en enkel og grei måte å måle celle spredning på; Det er spesielt nyttig for tilhenger celler13. Vår protokoll bruker glatte muskelceller, men det gjelder for alle tilhenger celle (epitel, endothelial, etc.). Selv om protokollen ikke er komplisert, er det en kritisk trinn gjør merkings løsningen-ingrediensene må legges i den rekkefølgen som er oppført. I tillegg, som chemiluminiscerende vestlige blots, hvis du bruker luminescence avlesning platen må leses umiddelbart.
Flere deler av protokollen kan endres eller optimaliseres etter behov. En del er varigheten av inkubasjons med EdU. Fordi målet vårt var å oppdage så mange voksende celler som mulig, la vi til EdU for en full 24 h før innfesting og farging. Men dette timing sannsynlig måler celler i både S og G2/M faser. For å merke bare celler i S-fase, Cecchini et al. anbefaler at selv langsomt dele celler skal inkubert med EdU for ikke lenger enn 6 timer7. En annen del av protokollen som kan optimaliseres er mengden av chelator. Alkyne-Natriumazid reaksjoner krever en kobber katalysator (CuSO4). THPTA er en kobber chelator som opprettholder kobber i den nødvendige oksidasjons tilstanden. Forholdet mellom chelator og kobber kan varieres, for å øke alkyne-Natriumazid binding. Vi observerer lyse flekker med en chelator: kobber forhold på 2:1, i sammenheng med også ved hjelp av picolyl Natriumazid. Den picolyl moiety legger chelaterande aktivitet som reduserer konsentrasjonen av kobber nødvendig og øker effektiviteten av reaksjonen15. Chelator: kobber forholdstall kan økes, vanligvis opp til 5:1, for å optimalisere per etterforsker behov. En bedre chelator, 2-[4-({BIS [(1-tert-butyl-1H-1, 2, 3-triazol-4-YL) methyl] amino} metyl)-1H-1, 2, 3-triazol-1-YL] eddiksyre (BTTAA), er nå kommersielt tilgjengelig16. Denne chelator var ikke kommersielt tilgjengelig da vi først utledet denne protokollen. Til slutt, selv om vi bruker paraformaldehyde som en bindemiddel i denne protokollen, kan celler festes med metanol, som også obviates permeabilization trinnet. Festing med metanol kan være nyttig hvis man ønsker å kombinere immunofluorescent farging av spesifikke cellulære proteiner med innlemmelse av EdU.
En ulempe med denne metoden er den potensielle cytotoksisitet av EdU, spesielt når du kontinuerlig merker med EdU for dager i motsetning til en puls etikett på timer. Avhengig av cellene som brukes, har EdU blitt funnet å forårsake celle syklus arrestasjon eller til og med apoptose17. Denne toksisitet antas å skyldes defekt DNA replikering fra tilsetning av kunstige nucleosides18. Studier har vist denne toksisitet å være cellelinje avhengig og konsentrasjon avhengig17. Vi observerte ikke noen problemer med toksisitet i våre studier.
Oppsummert har måling av spredning via EdU og klikk kjemi flere fordeler fremfor andre ofte brukte metoder som BrdU eller 3H-tymidin innlemmelse. Disse inkluderer å unngå radioaktivitet, høy spesifisitet med lav bakgrunn, og ikke behov for harde denaturering trinn. Når etablert, klikk kjemi er svært allsidig, og kan enkelt endres for metabolsk merking av RNA, protein, fettsyrer, og karbohydrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Katie Carroll for teknisk assistanse. Vi takker også Dr. David Cool og Proteomikk analyselaboratorium for instruksjon på og levering av Cytation Imaging plate leseren. Dette arbeidet ble støttet av en Wright State Foundation stipend (til L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
