Summary
Spredning er en kritisk del af cellulær funktion, og en fælles udlæser bruges til at vurdere potentielle toksicitet af nye lægemidler. Måling af spredning er derfor en hyppigt anvendt analyse i cellebiologi. Her præsenterer vi en enkel, alsidig metode til måling af spredning, der kan anvendes i vedlige og ikke-vedlige celler.
Abstract
Evnen af en celle til at formere sig er en integrerende del af den normale funktion af de fleste celler, og dysregulering af spredning er kernen i mange sygdomsprocesser. Af disse grunde er måling af spredning et fælles værktøj, der anvendes til at vurdere celle funktionen. Celle proliferation kan måles ved blot at tælle; Dette er imidlertid et indirekte middel til at måle spredning. Et almindeligt middel til direkte påvisning af celler, der forbereder sig på at opdele, er ved inkorporering af mærkede nukleosid-analoner. Disse omfatter den radioaktive nukleosid analog 3H-thymidin plus ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ' og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU). Inkorporering af EdU opdages ved at klikke kemi, som har flere fordele i forhold til BrdU. I denne betænkning fremlægger vi en protokol til måling af spredning ved inkorporering af EdU. Denne protokol indeholder muligheder for forskellige udlæsninger, sammen med fordele og ulemper ved hver. Vi diskuterer også steder, hvor protokollen kan optimeres eller ændres for at imødekomme de specifikke behov i det planlagte eksperiment. Endelig, vi rører på de måder, at denne grundlæggende protokol kan ændres til måling af andre celle metabolitter.
Introduction
Spredning er en kritisk del af cellulære funktion1,2. Kontrol af spredning påvirker normale processer såsom udvikling, og patologiske processer såsom kræft og hjerte-kar-sygdom. Hyperplastisk vækst af vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, menes at være en forløber for åreforkalkning3. Ændringer i celle spredning anvendes også til at vurdere potentiel toksicitet af nye lægemidler. I betragtning af dens udbredte virkning er måling af spredning en grundpille i mange cellebiologi-baserede laboratorier.
Celle spredning kan måles ved blot at tælle celler, hvis celle populationen af interesse dividerer ret hurtigt. For langsommere vækst celler kan celletal være mindre følsomt. Spredning måles ofte ved inkorporering af mærkede nukleosid analover. Selv om guldstandarden er 3H-thymidin inkorporering, mange laboratorier er at komme væk fra denne metode i betragtning af tilgængeligheden af nyere, ikke-radioaktive alternativer. Disse omfatter cytoplasmiske fluorescerende farvestoffer, påvisning af celle cyklus associerede proteiner, og inkorporering af ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ' og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU)4.
Cytoplasmiske farvestoffer, såsom carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE), detektere spredning, fordi intensiteten af farvestoffet halvdele hver gang cellen deler5. Denne teknik er almindeligt anvendt i flow cytometri for ikke-vedlige celler. Det har ikke været brugt meget for vedlige celler, men med den nye generation af billedplade læsere dette kan ændre sig. Påvisning af celle cyklus associerede proteiner gennem antistof-baserede teknikker (flow cytometri, immun histokemi, etc.) bruges ofte til væv eller ikke-vedhørende celler. Disse celler/væv skal fastgøres og permeabiliseres før farvning. Nukleosid analover BrdU og EdU er ens i tilgang til 3H-thymidin, men uden besværet med radioaktivitet. Inkorporering af BrdU påvises ved anti-BrdU antistoffer, og derfor skal cellerne fastgøres og permeabilized før farvning. Desuden skal cellerne behandles med DNase for at afsløre BrdU epitope.
Inkorporering af EdU detekteres ved at klikke kemi, hvor eller og Azid grupper "Klik" sammen i nærværelse af katalytisk kobber. Begge grupper kan fungere som det biosynthetisk indarbejdet molekyle eller detekterings molekyle4. Kommercielt tilgængelige nukleosid analoner har eller gruppen vedhæftet. For sprednings assays detekteres eller-funktionaliserede nukleosid analog ved en Azid, der er konjugeret til et fluorescerende farvestof eller en anden markør. Inkorporering af EdU har flere fordele i forhold til BrdU. For det første, fordi eller-og Azid-grupper ikke findes i pattedyrsceller, er denne interaktion meget specifik med en lav baggrund6. Da begge grupper er små, behøver cellerne ikke at gennemgå DNA-denaturering for at udsætte nukleosid-analog som krævet for BrdU7. Endelig, klik kemi er meget alsidig, og kan bruges til metabolisk mærkning af DNA, RNA, protein, fedtsyrer, og kulhydrater8,9,10,11. Hvis det metabolisk mærkede mål af interesse er på cellens overflade, kan levende celler mærkes12. Derudover kan cellerne forarbejdes yderligere til immunfluorescent farvning med antistoffer.
Følgende protokol beskriver brugen af EdU inkorporering og klik kemi at måle spredning i humane vaskulære glatte muskelceller (figur 1). Vi viser tre forskellige måder inkorporering af EdU kan måles, repræsentative resultater fra hver, og deres fordele og ulemper. Måling af spredning via Klik kemi er især nyttig for klædige, langsommere voksende celler. Desuden er den morfologi af cellen velholdt og antistof-baseret farvning kan også udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. påvisning af EdU ved hjælp af fluorescerende label
- Stam løsninger
- Forbered en 5 mM EdU-stamopløsning ved at tilsætte 12,5 mg EdU til 10 mL dobbeltdestilleret H2O.
- Klargør komponenterne til mærknings løsningen: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) (100 mg i 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg i 1 ml h2o; Lav frisk), 10 mm Cy3 picolyl-azid (1 mg i 95,3 ml h2o , opbevaret i 5 μL aliquoter ved-20 °C) og 1 M natriumascorbat (200 mg i 1 mL H2O; gør frisk).
- Resazurin-stamopløsningen forberedes i en koncentration på 0,15 mg/mL. Filter Steriliser og opbevar 1 mL aliquoter ved 4 °C.
Bemærk: Picolyl-Azid er tilgængeligt konjugeret til flere forskellige fluorer, biotin og peberrod-peroxidase (HRP).
- Label vaskulære glatte muskelceller (VSMC) med EdU.
Bemærk: humane vsmc'er blev isoleret fra bækkenbens arterier via udvækst fra forklarende stykker væv. Når de dyrkes i serum frie medier med insulin, transferrin, selen disse celler udtrykker VSMC markører smoothelin, glatte muskler myosin tunge kæde (SM-MHC) og SMC αactin13.- Plade vaskulære glatte muskelceller ved 2 x 104/ml i dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM) i en 96 brønd plade.
Bemærk: cellerne dyrkes ved 37 °C i glatte muskulatur celle medier med 2% føtal kvægserum. - Valgfri Tillad flere timer til overnatning for overholdelse. Tilsæt 20 μL resazurin lager til hver brønd. Inkuber ved 37 °C i 3 timer. Læs fluorescens signalet i en plade læser (560ex, 594EM). Udskift mediet med Fresh DMEM.
Bemærk: dette trin er valgfrit. Resazurin bruges til at normalisere cellenumre og tegner til godt-til-brønd variabilitet i plating14. - Tilsæt fosfat bufferet saltvand (PBS) eller trombocytafledt vækstfaktor (PDGF) 30 ng/mL til 3 − 6 brønde pr. behandling ved begyndelsen af dyrkningsperioden og Inkubér i 72 h.
- 5 mM EdU-bestanden fortyndes til 1 mM. Tilsæt 2 μL til hver brønd (slutkoncentration 20 μM) i de sidste 24 timer i kultur perioden 72 h. Føj ikke EdU til ét sæt replikater. Disse brønde vil blive brugt til at bestemme baggrunden fluorescens/luminescens.
Bemærk: varigheden af kultur og mærkning med EdU er optimeret til glatte muskelceller, men kan være nødvendigt at blive ændret pr celletype.
- Plade vaskulære glatte muskelceller ved 2 x 104/ml i dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM) i en 96 brønd plade.
- Fix celler i PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Fjern mediet, og tilsæt 150 μL 4% PFA (i PBS) pr. brønd i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern PFA og tilsæt 150 μL af 1% polyethylenglycol tert-octylphenyl ETHER (TX-100) (i vand) pr. brønd i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern TX-100 ved at vaske tre gange med PBS.
Forsigtig: PFA er giftig, håndtag med omhu.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Faste celler kan lagres i PBS ved 4 °C.
- Registrer inkorporeret EdU.
- Lav en mærknings løsning (10 mL pr. 96 brønd plade ved hjælp af indvendige 60 brønde) lige før brug ved tilsætning af reagenser fra stamopløsninger i følgende rækkefølge: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μl, Cy3 picolyl-Azid 5 μl, na ascorbat 100 ΜL til PBS for et samlet volumen på 10 ml.
- Fjern PBS fra brønde og tilsæt 150 μL mærknings løsning til hver brønd. Inkuber 30 min ved 37 °C. At detektere alle kerner, tilsæt 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til hver brønd. Læses på en fluorescens plade læser (Cy3 550ex, 570EM; DAPI 350ex, 470EM) eller billede på et mikroskop.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Faste og farvede celler kan lagres i PBS ved 4 °c og afbildet på et senere tidspunkt.
2. påvisning af EdU ved hjælp af luminescens
- Komplet afsnit 1.1-1.3.
- Forbered Tris-bufferet saltvand med 0,1% Polysorbat 20 (TBST).
- Bloker brønde.
- Tilsæt 150 μL blokerende buffer (tabel over materialer) til hver brønd og inkuber i 90 min ved stuetemperatur.
- Fjern blokerings bufferen, og vask tre gange med 200 μL PBS.
- Registrer inkorporeret EdU.
- Foretag en mærknings løsning som anvist i trin 1.4.1, og erstat biotin picolyl-Azid for Cy3 picolyl-Azid.
- Vask brønde fem gange med 200 μL TBST, med omrystning, 3 min. pr. vask.
- Quench endogene peroxidaser med 150 μL 0,3% H2O2 for 20 min ved stuetemperatur.
- Fjern H2O2 og vask fem gange med 200 μl tbst med en rystning på 3 min pr. vask.
- Fortyndet streptavidin-peberrod-peroxidase (SA-HRP; 1:200) i TBST og tilsæt 50 μL til hver brønd. Inkuber 1 t ved stuetemperatur.
- Vask fem gange med 200 μL TBST, med omrystning, 3 min. pr. vask.
- Tilsæt 50 μL kemiluminescent enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) substrat (tabel over materialer) til hver brønd.
- Læs straks i plade læseren, som kan detektere luminescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2viser vi resultaterne af tre forskellige eksperimenter, som måler udbredelsen af VSMC som svar på PDGF. Efter dyrkning af cellerne i medierne formuleret til SMCs, vi udførte forsøget i serum fri DMEM, at eliminere eventuelle virkninger af serum eller vækstfaktorer på spredning. I figur 2a sammenligner vi resultater, fra det samme eksperiment, ved hjælp af en fluorescerende vs lysende viser udlæser. For at læse disse plader brugte vi en mikroplade læser med flere tilstande, der kan læse absorbans, fluorescens og luminescens (Se tabel over materialer).
Ved hjælp af pladen læser i scanning godt tilstand, er fluorescerende målinger gennemsnit over hele brønden. Denne tilstand Linderer potentielle unøjagtigheder på grund af forskelle mellem midten og kanterne af brønden. Men hvis meget få kerner er positive, vil læse resultater på denne måde sandsynligvis undervurderer "antallet" af positive celler, når kun nogle få er positive. Tal, med denne udlæser, betyder fluorescens i forhold til en anden brønd, og ikke nøjagtige cellenumre. Hertil kommer, at hvis der er en fiber eller en klump af døde celler, der opfanger fluorescens, vil dette blive inkluderet i området scanning. Men fordelen ved at bruge plade læseren er tid. Mens læsning i scanningstilstand tager 15 − 20 sekunder per brønd, det er automatiseret i modsætning til den personlige tidskrævende metode til at tage billeder og analysere dem ved hjælp af imaging software.
For at korrigere potentielle under estimater fra ovenstående metode, konverterede vi den fluorescerende scanning til en homogen, flydende udlæser, hvor celler, der tager op EdU detekteres med en Azid-biotin-delen, som igen detekteres med streptavidin-peberrod peroxidase (Se figur 1). Mængden af peberrod-peroxidase kvantificeres derefter ved hjælp af et standard substrat, der er formateret til ELISA. Fordelen ved denne teknik er en mere homogen udlæser, og figur 2a, B viser eksempler på eksperimenter, hvor denne metode blev anvendt. Desuden kan pladen læses på få sekunder. Der er ulemper ved denne metode, dog. For det første er baggrunden med denne metode højere end med fluorescens. For at mindske baggrunden, vi indarbejdet et blokerende trin og flere skyller. Som en afspejling af denne baggrund har negative kontroller (ubehandlede celler) tendens til at være højere, og fold stigningen i spredningen er lavere. For det andet, som med fluorescens udlæser, vil alle fibre eller døde celler, der samler detekterings reagenserne, føje til den totale luminescens.
I et forsøg på at mindske variabiliteten i de ovennævnte eksperimenter, normaliserede vi vores resultater til indledende celletal. For spredning assays, normalisering skal ske på levende celler i begyndelsen af analysen, før cellerne kløft. Desuden kan analysen ikke påvirke cellens funktion eller inkorporering af EdU. I betragtning af disse begrænsninger valgte vi at bruge metabolisme som en afspejling af celle nummer via resazurin14. Resultater med og uden normalisering er vist i figur 2b. Men i et separat sæt af eksperimenter fandt vi, at denne metode ikke er følsom nok til at opdage små forskelle i cellenumre. Derudover introducerer en fejl i denne udlæser flere fejl i hele eksperimentet. Af disse grunde har vi valgt at tage ekstraordinær omsorg for plade cellerne så jævnt som muligt og ikke udføre et normaliserings trin.
For at være sikker på, at vi fik de mest præcise resultater muligt, vendte vi tilbage til fluorescerende farvning (afsnit 1) og tælle celler ved hjælp af et inverteret fluorescens mikroskop. Fordelen ved denne metode er, at man fysisk kan se og tælle de positive celler, hvilket sikrer den største nøjagtighed (figur 3). Ethvert fluorescerende snavs kan udelukkes fra optællingen. Baggrund tæller uden EdU er 0, da der ikke er nogen synlig fluorescens, og derfor ingen baggrund for at trække. Den største ulempe ved denne metode er tid. For at tælle kerner i celler belagt i en 96 brønd plade, tager vi 3 billeder pr. brønd af både EdU positive celler og total cells (DAPI), der kræver 6 billeder pr. brønd. Vi tager billeder lodret fra midterdelen af toppen til bunden af brønden, idet vi sørger for ikke at overlappe og tælle celler to gange. Optælling af total celler giver os et andet stykke data, der bekræfter vores sprednings resultater. Men i lyset af den relativt langsomme fordobling af VSMC (36 − 48 h), folden stigning i samlede celler stimuleret med PDGF vs kontrol er meget lavere end folden stigning af EdU positive celler, hvilket er grunden til vi måler inkorporering af EdU (figur 2c).
Den mest effektive og nøjagtige måde at tælle EdU positive og samlede celler er ved hjælp af en billedplade læser. Denne metode kombinerer nøjagtigheden af optælling med hastigheden af automatisering. Den største ulempe er, at dette stykke udstyr ikke er tilgængelig på hver institution. Ved sammenligning af automatiserede vs manuelle optællinger var EdU-positive manuelle optælling i det væsentlige identisk med det automatiserede antal (figur 2c, venstre), ligesom det totale antal ustimulerede tal (figur 2c, højre). Det manuelle antal var dog lavere end det automatiserede antal i totale PDGF-stimulerede celler. Denne forskel er sandsynligvis relateret til cellevækst mønstre. Fordi cellerne har tendens til at vokse i midten af brønden, med mindre tal de automatiserede og manuelle optællinger var næsten identiske. Men med højere tal var der sandsynligvis flere celler i kanterne og manuelle tæller, som ikke fange celler i periferien af brønden, var mindre nøjagtige.
Figur 1: oversigt over EdU-detektion ved fluorescens eller luminescens.
VSMC eller andre vedlige celler behandles under forhold af interesse. EdU er tilføjet for de sidste 24 h af kultur perioden og indarbejdet i DNA af opdeling celler. Indstiftet EdU detekteres derefter ved hjælp af fluorescens (protokol afsnit 1) eller luminescens (protokol afsnit 2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: måling af spredning med forskellige udlæsninger ved brug af EdU og klik kemi.
(A) vsmc'er blev dyrket ved tilstedeværelse eller fravær af PDGF. EdU blev tilføjet de sidste 24 h af kultur, og inkorporering blev opdaget af enten fluorescens (protokol afsnit 1) eller luminescens (protokol afsnit 2). (B) vsmc'er blev behandlet som beskrevet i panel A, og inkorporering af EdU blev målt ved luminescens. Resultaterne blev normaliseret til Initial celletal ved hjælp af resazurin levedygtigheds analyse. C) vsmc'erne blev behandlet som i panel A, og inkorporeringen af EdU blev målt ved fluorescens. EdU-positive celler tælles automatisk ved hjælp af en billedbehandlings plade læser eller manuelt ved billedbehandling og derefter tælle ved hjælp af billedbehandlingssoftware. De viste resultater er den gennemsnitlige ± standardafvigelse på 3 – 6 replikater pr. behandling.
Figur 3: visualisering af EdU-positive celler efter Click fluorescens protokol.
VSMC blev behandlet som beskrevet i figur 2, og inkorporerede EdU blev detekteret ved hjælp af fluorescens (protokol afsnit 1). Hvert billede er en enkelt brønd af en 96 brønd plade. Total kerner er vist i blå (DAPI) og EdU positive kerner er grønne. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkorporering af EdU er en enkel og ligetil måde at målecelle spredning på; Det er især nyttigt for vedsiddende celler13. Vores protokol bruger glatte muskelceller, men det gælder for enhver overholder celle (epitelial, endotelal, etc.). Selv om protokollen ikke er kompliceret, det ene kritiske skridt er at gøre mærkningen løsning-ingredienserne skal tilføjes i den anførte rækkefølge. Hertil kommer, ligesom kemiluminescens Western blots, hvis du bruger luminescens udlæsning pladen skal læses med det samme.
Flere dele af protokollen kan ændres eller optimeres efter behov. En del er varigheden af inkubation med EdU. Fordi vores mål var at opdage så mange prolifererende celler som muligt, vi tilføjede EdU for en fuld 24 h før fastsættelse og farvning. Denne timing måler dog sandsynligvis celler i både S-og G2/M-faser. For kun at mærke cellerne i S-fasen anbefaler Cecchini et al., at selv langsomt dividere celler inkuberet med EdU i højst 6 timer7. En anden del af den protokol, der kan optimeres, er mængden af chelator. Alkyne-Azid-reaktioner kræver en kobber katalysator (CuSO4). Thpta er en kobber compleksonom, der vedligeholder kobber i den nødvendige oxidations tilstand. Forholdet mellem compleksonom og kobber kan varieres, for at øge alkyne-Azid binding. Vi observere lyse farvning med en chelator: kobber ratio på 2:1, i forbindelse med også at bruge picolyl Azid. Picolyl-delen tilføjer Chelat aktivitet, som nedsætter koncentrationen af kobber behov og øger effektiviteten af reaktionen15. Chelator: kobber nøgletal kan øges, normalt op til 5:1, at optimere per investigator behov. En bedre chelator, 2-[4-({BIS [(1-tert-butyl-1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) methyl] amino} methyl)-1H-1, 2, 3-triazol-1-yl] eddikesyre (BTTAA), er nu kommercielt tilgængelige16. Denne compleksonom var ikke kommercielt tilgængelig, da vi først afledt denne protokol. Endelig, selv om vi bruger PARAFORMALDEHYD som fikseringsmiddel i denne protokol, kan cellerne fastgøres med methanol, hvilket også overfløder permeabiliseringtrinet. Fastsættelse med methanol kan være nyttigt, hvis man ønsker at kombinere immunfluorescent farvning af specifikke cellulære proteiner med inkorporering af EdU.
En ulempe ved denne metode er den potentielle cytotoksicitet af EdU, især når løbende mærkning med EdU for dage i modsætning til en puls label af timer. Afhængigt af de anvendte celler, EdU har fundet at forårsage celle cyklus anholdelse eller endda apoptose17. Denne toksicitet menes at skyldes defekt DNA-replikation fra tilsætning af kunstige Nukleosider18. Undersøgelser har vist, at denne toksicitet er cellelinje afhængig og koncentrationsafhængig17. Vi har ikke observere nogen problemer med toksicitet i vores undersøgelser.
Kort sagt, måling af spredning via EdU og klik kemi har flere fordele i forhold til andre almindeligt anvendte metoder såsom BrdU eller 3H-thymidininkorporering. Disse omfatter undgå radioaktivitet, høj specificitet med lav baggrund, og ikke behov for barske denaturering trin. Når det er etableret, klik kemi er meget alsidig, og kan nemt ændres til metabolisk mærkning af RNA, protein, fedtsyrer, og kulhydrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Katie Carroll for teknisk assistance. Vi takker også Dr. David cool og proteomics analyselaboratorium for instruktion om og tilvejebringelse af Cytation Imaging Plate Reader. Dette arbejde blev støttet af en Wright State Foundation Grant (til L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
