Summary
Aquí, presentamos un protocolo de trasplante aórtico heterotópico en ratones utilizando la técnica del manguito no sutura en un modelo de murina cervical. Este modelo se puede utilizar para estudiar la patología subyacente de la vasculopatía por aloinjerto crónico (CAV) y puede ayudar a evaluar nuevos agentes terapéuticos para prevenir su formación.
Abstract
Con la introducción de potentes protocolos inmunosupresores, se pueden realizar diferentes avances en la prevención y terapia de episodios de rechazo agudo. Sin embargo, sólo se pudo observar una mejora menor en los resultados a largo plazo de los órganos sólidos trasplantados en las últimas décadas. En este contexto, la vasculopatía por aloinjerto crónico (CAV) sigue representando la principal causa de insuficiencia orgánica tardía en el trasplante cardíaco, renal y pulmonar.
Hasta ahora, la patogénesis subyacente del desarrollo de CAV sigue sin estar clara, explicando por qué actualmente faltan estrategias de tratamiento eficaces y haciendo hincapié en la necesidad de modelos experimentales pertinentes para estudiar la fisiopatología subyacente que conduce a Formación de CAV. El siguiente protocolo describe un modelo de trasplante aórtico cervical heterotópico murino utilizando una técnica de manguito no sutura modificada. En esta técnica, un segmento de la aorta torácica se interposiciona en la arteria carótida común derecha. Con el uso de la técnica del manguito no sutura, se puede establecer un modelo fácil de aprender y reproducible, minimizando la posible heterogeneidad de las micro anastomosas vasculares suturadas.
Introduction
En las últimas seis décadas, el trasplante de órganos sólidos ha evolucionado de un procedimiento experimental a un estándar de atención para el tratamiento de la insuficiencia orgánica terminal1. Debido a la mejora de los agentes antimicrobianos, las técnicas quirúrgicas y el avance en los regimientos inmunosupresores, la tasa de éxito temprana del trasplante de órganos sólidos ha aumentado significativamente en las últimas décadas2.
Sin embargo, las tasas de supervivencia del injerto a largo plazo no han mejorado significativamente de la misma manera3. El desarrollo de CAV es el principal factor que limita la supervivencia a largo plazo4,5,6. Esta patología se caracteriza por la formación de una capa neointimal concéntrica que consiste en células musculares lisas, lo que conduce al estrechamiento progresivo del vaso y a la malperfusión consecutiva del órgano sólido trasplantado. En los receptores de trasplante de corazón, las lesiones de CAV se pueden diagnosticar en hasta el 75% de los pacientes 3 años después del trasplante7.
La fisiopatología de CAV aún no se entiende completamente. Parece estar relacionado con numerosos factores inmunológicos y no inmunológicos, lo que conduce a daños endoteliales con posterior activación endotelial y disfunción8. Hasta ahora, no existe ninguna opción de tratamiento causal para la prevención de la CAV, haciendo hincapié en la necesidad de un modelo animal pequeño reproducible con el fin de estudiar la formación y la posible terapia de CAV.
Con el uso de modelos de trasplante aórtico murino, CAV como lesiones se puede ver 4 semanas después del trasplante. Esas lesiones consisten principalmente en células musculares lisas vasculares, por lo tanto, que se asemejan a la patología humana. Debido a una amplia variedad de ratones transgénicos y noqueadores, el uso de modelos de ratón en patologías asociadas al trasplante ofrece una oportunidad única para identificar nuevas opciones terapéuticas y comprender su desarrollo. Debido al pequeño diámetro de los vasos trasplantados sin embargo, el uso de modelos de ratón se asocia comúnmente con largas curvas de aprendizaje y una alta tasa de complicaciones inicial9. Con la introducción de la técnica del manguito no sutura, esta parte más desafiante de la operación se puede facilitar y el diámetro de la anastomosis se mantiene constante10,11.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la ley alemana de bienestar animal (TierSchG.) (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).
1. Alojamiento animal
- Para experimentos, utilice ratones machoC57BL/6 y BALB/c que pesen 20-25 g con ratones C57BL/6 como animales receptores y ratones BALB/c como animales donantes.
- Comprar los animales y la casa en una instalación libre de patógenos de barrera, de acuerdo con las directrices de FELASA para el monitoreo de la salud12.
- Mantenga a los ratones en jaulas estándar de Makrolon con material de anidamiento de enriquecimiento. Proporcionar ad libitum acceso al agua y los alimentos peletizares en un ciclo día/noche de 12 h.
- Mantener la temperatura ambiente a 22oC y la humedad relativa a 55oC 5%.
2. Preparación del destinatario
- En primer lugar, anestesiar al animal receptor (C57BL/6) con una inyección intraperitoneal de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/ml), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/ml) y fentanilo (0,05 mg/kg; 0,05 mg/ml).
NOTA: La profundidad correcta de la anestesia debe alcanzarse en 5-10 min.- Pellizca los pies traseros con fórceps para comprobar si hay reflejos para confirmar la profundidad de la anestesia.
- Corta todo el cabello de la región lateral cervical con una cortapelos eléctrica para animales pequeños y aplica un pomada oftálmica con hisopos de algodón para evitar que los ojos se sequen durante el procedimiento.
- Coloque al animal en posición supina en una almohadilla de calentamiento debajo del microscopio y pegue suavemente sus patas a la mesa de operaciones con tiras de yeso sensibles a la piel.
- Incline la cabeza hacia atrás y frote el campo operativo varias veces con alcohol.
- Haga una incisión cutánea desde la incisión yugular hasta la mandíbula inferior derecha con tijeras pequeñas.
- Retire el lóbulo inferior derecho de la glándula submandibular a través de la cautela bipolar del pediculo del vaso y posterior escisión con microtijeras.
- Retire el músculo esternocleidomastoideo derecho a través de la cauterización bipolar de la parte superior e inferior y posterior escisión con microtijeras para acceder a la arteria carótida común.
- Movilice la arteria carótida común lo más lejos posible, distalmente y proximalmente, desmontando el tejido conectivo circundante con fórceps finos.
- Ate dos ligaduras de seda 7-0 con una distancia mínima entre cada una alrededor de la mitad de la arteria carótida común y transforce la arteria carótida común con microtijeras finas entre las ligaduras.
- Pase el extremo proximal y ligado a través del manguito y fíjelo con una pequeña abrazadera arterial.
NOTA: Los manguitos que se utilizaron en este procedimiento fueron cortados con microtijeras de tubos de poliimida con un diámetro exterior de 0,610 mm y un espesor de pared de 0,0254 mm. Los puños terminados tenían una longitud de 2 mm con la mitad, que se utiliza para el proceso de manguito, siendo un cilindro completo y la otra mitad, que está sujetado, siendo un medio cilindro. - Retire la ligadura con microtijeras finas, lo más cerca posible de la ligadura, y enjuague el lumen con salina heparinizada (50 UI/ml) con una aguja de 30 G, mientras se cuida de no dañar las paredes del vaso.
- Dispinta el lumen abierto usando dilatadores vasculares finos y evert el muñón carótida sobre el brazalete tirando suavemente sobre el tubo de poliimida.
- Inmediatamente fijar la carótida everted con un bucle de seda 7-0 libremente pre-atado.
NOTA: Adelántese holgadamente 4 bucles de seda 7-0 con un diámetro de aproximadamente 1,5 mm antes de la cirugía para hacer el procedimiento de esposado más suave y más fácil. - Realice el mismo procedimiento (2.10-2.13) en el otro extremo de la arteria carótida.
- Deje a un lado al animal receptor e hidratar el campo operativo con salina hasta que se explantee el segmento aórtico.
3. Operación del donante
- Anestetizar el ratón donante (BALB/c) de la misma manera que el animal receptor.
- Pellizca los pies traseros con fórceps para comprobar si hay reflejos para confirmar la anestesia suficiente.
- Corta todo el cabello de la región abdominal y torácica con un cortapelos eléctrico para animales pequeños y aplica un pomada oftálmica con hisopos de algodón para evitar que los ojos se sequen durante el procedimiento.
- Coloque al animal en posición supina en una almohadilla de calentamiento debajo del microscopio y pegue suavemente sus patas a la mesa de operaciones con tiras de yeso sensibles a la piel.
- Frote el campo operativo varias veces con alcohol.
- Realizar una laparotomía abdominal de línea media con tijeras pequeñas y empujar los intestinos ligeramente hacia arriba para exponer la vena cava inferior (IVC).
- Inyectar la vena cava inferior (IVC) con 1 ml de salina heparinizada usando una aguja de 30 G.
- Cortar la aorta abdominal y la CIV por debajo de las arterias renales con tijeras pequeñas para exsanguinar al animal donante. Coloque una compresa en el abdomen para absorber la sangre.
- Realice una toracotomía en el desvío bilateral de las costillas con tijeras e incline la pared tórax anterior cranealmente con una abrazadera quirúrgica para exponer el mediastino.
- Corte el CIV y el esófago directamente por encima del diafragma con microtijeras.
- Retire el corazón y los pulmones inclinándolos hacia arriba con fórceps sosteniendo el corte IVC/esófago y luego exciándolos con microtijeras de su base para tener acceso a la aorta torácica en el mediastinum dorsal.
- Movilizar la aorta torácica de su tejido circundante tirando del tejido conectivo circundante y la grasa con fórceps finos, teniendo cuidado de no dañar ninguna arteria intercostal.
- Cauterizar todas las ramas de la aorta torácica con fórceps de cauterio bipolar e extirpar el segmento aórtico entre el diafragma y el arco aórtico utilizando microtijeras.
- Enjuague el segmento aórtico extirpado con salina heparinizada con una aguja de 30 G, mientras se cuida de no dañar las paredes del vaso, de eliminar la sangre o coágulos restantes y transferir el injerto al animal receptor.
NOTA: Coloque directamente el injerto aórtico en la posición más o menos correcta en el recipiente durante la transferencia. Si hay problemas para confundir los diferentes extremos del injerto en el animal receptor, una ligadura suelta alrededor del extremo distal podría ayudar.
4. Implantación
- Tire del extremo proximal del segmento aórtico del donante sobre el manguito proximal en la parte superior de la arteria carótida everted con fórceps finos e inmediatamente fijarlo con un bucle de seda 7-0 libremente alado.
- Recorte el extremo distal y libre del injerto aórtico con microtijeras para que la longitud del injerto se ajuste a la distancia entre los dos puños.
- Repita el paso 4.1 en el otro extremo de la aorta con el otro brazalete para completar la anastomosis.
- Retire la abrazadera distal para permitir la perfusión retrógrada.
- Después de lograr la hemostasis, retire la abrazadera proximal para completar la anastomosis.
- Finalmente, cierre la herida con sutura continua 6-0.
5. Cuidado postoperatorio
- Supervise el ratón de cerca en las primeras 6 horas después de la operación y luego varias veces al día durante las primeras 72 horas después del trasplante para detectar cualquier complicación al instante.
- Para la analgesia postoperatoria, inyectar el ratón trasplantado con buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por vía subcutánea directamente después del trasplante y luego cada 12 h durante 72 h para proporcionar una analgesia adecuada y a largo plazo.
6. Explicaciones del injerto aórtico
- Anestetizar al animal trasplantado con una inyección intraperitoneal de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/ml), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/ml) y fentanilo (0,05 mg/kg; 0,05 mg/ml) 4 semanas después del trasplante.
- Pellizca los pies traseros con fórceps para comprobar si hay reflejos para confirmar la anestesia suficiente.
- Corta todo el cabello de la región abdominal, torácica y cervical con un cortapelos eléctrico para animales pequeños.
- Coloque al animal en posición supina en una almohadilla de calentamiento debajo del microscopio y pegue suavemente sus patas a la mesa de operaciones con tiras de yeso sensibles a la piel.
- Frote el campo operativo varias veces con alcohol.
- Realizar una laparotomía abdominal de línea media con tijeras pequeñas y empujar los intestinos ligeramente hacia arriba para exponer la vena cava inferior (IVC).
- Inyectar la vena cava inferior (IVC) con 1 ml de salina heparinizada usando una aguja de 30 G.
- Cortar la aorta abdominal y la CIV por debajo de las arterias renales con tijeras pequeñas para exsanguinar al animal donante. Coloque una compresa en el abdomen para absorber la sangre.
- Haga una incisión cutánea desde la incisión yugular hasta la mandíbula inferior derecha con pequeñas tijeras correspondientes a la incisión cutánea realizada durante el procedimiento de trasplante.
- Identifique el injerto aórtico trasplantado junto con el brazalete distal y proximal y retire con telón con fórceps cualquier tejido circundante con fórceps.
- Usando microtijeras, corte a través de la arteria carótida común distal y proximal al injerto aórtico con los puños con el fin de explantar el injerto aórtico junto con los dos extremos del manguito.
- Cortar el segmento aórtico por la mitad y conservar las muestras para análisis posteriores (secciones congeladas, secciones incrustadas de parafina, material congelado a presión)13,14.
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Representative Results
En el modelo de trasplante totalmente mHC-no coincidente, se puede ver una capa neointimal concéntrica 4 semanas después del trasplante(Figura 2). Esta capa consiste principalmente en células musculares lisas vasculares como la tinción inmunohistológica para SM22 (un marcador selectivo para las células musculares lisas vasculares maduras) revelado. Como se indicó anteriormente, estas células musculares lisas vasculares son patognomónicas para las lesiones que se ven en la vasculopatía de aloinjerto crónico. Para análisis posteriores, los segmentos aórticos deben ser seccionados y manchados por La tinción de Elastica van Gieson. Aquí, la capa neointimal se puede diferenciar fácilmente a las fibras elásticas de la membrana elástica interna, dividiendo la intima Tunica de los medios de Tunica.
Con el fin de evaluar un posible efecto terapéutico en este modelo, la relación neointimia-medios, así como el estrechamiento de la zona transversal luminal, se pueden medir en esas muestras seccionadas13,15. En nuestro modelo modificado descrito de trasplante aórtico no suturado, se podría lograr una tasa de éxito técnico de >91% en más de 300 trasplantes aórticos realizados. Esta alta tasa de éxito se podría lograr mediante el uso de un manguito hecho de tubo de poliimida con un diámetro exterior de 0,610 mm y un espesor de pared de 0,0254 mm.
Figura 1: Imágenes intraoperatorias. (A) Cortar la arteria carótida ligada. (B) Extremo carótido sujeto después de quitar la ligadura y enjuagar el extremo con salina heparinizada. (C) Procedimiento de manguito. (D) Preparación completa del receptor (ambas carótidas terminan con puños). (E) Segmento aórtico trasplantado antes y (F) después de la reperfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Muestra histológica de segmentos aórticos trasplantados 4 semanas después del trasplante. (A) Tinción inmunohistológica representativa con SM22 (fluorescencia verde) y DAPI (fluorescencia azul) que muestra la gruesa capa neointimal que consiste en células musculares lisas vasculares. Las fibras elásticas se muestran en fluorescencia roja (aumento de 20x). (B) Tinción Elastica-van-Gieson (aumento 10x). (C) Segmento aórtico trasplantado singéneo 4 semanas después del trasplante (aumento de 10x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La vasculopatía crónica de aloinjerto es la principal causa de pérdida tardía del injerto después del trasplante de órganos sólidos del corazón y probables aloinjertos renales y pulmonares8. Hasta el momento, no se podría desarrollar ningún régimen terapéutico causal para prevenir la formación de CAV.
La fisiopatología de CAV es multifactorial e implica aspectos inmunológicos y no inmunológicos16. El uso de modelos de roedores en trasplantes ha sido esencial para entender la fisiopatología subyacente de los procesos de rechazo de aloinjertos en el trasplante de órganos sólidos y ha ayudado a identificar nuevos enfoques terapéuticos que previenen el rechazo17 . CAV se caracteriza por la formación de una capa neointimal que consiste en células musculares lisas vasculares que conducen al estrechamiento consecutivo del vaso y malperfusión del órgano trasplantado con el posterior deterioro de la función del órgano7.
En el modelo de trasplante aórtico murino descrito, la formación neointimal concéntrica se puede observar en injertos aórticos totalmente MHC (H-2d a H-2b) injertos aórticos torácicos desajustes 4 semanas después del trasplante. Esas lesiones consisten principalmente en células musculares lisas vasculares(Figura 2). Shi et al. describieron el primer modelo de ratón de arteriosclerosis trasplantada en 199418. Injertaron un segmento de la arteria carótida en la arteria carótida por el extremo a la sutura lateral. En 1996, Koulack y otros establecieron el primer modelo de trasplante aórtico de ratón abdominal injertando un segmento aórtico a la aorta infrarrenal mediante anastomosis de extremo a extremo19. Dietrich et al. describieron por primera vez el uso de una técnica de manguito sin sutura para el trasplante de un segmento aórtico torácico a la arteria carótida en 200011.
En comparación con los modelos de ratón que utilizan anastomosis microvascular para trasplantar segmentos aórticos, la técnica del manguito ofrece varios beneficios. En primer lugar, el procedimiento es más simple y fácil de aprender. En segundo lugar, el tiempo isquémico del segmento aórtico injertado es constante, ya que el animal receptor se prepara primero para la anastomosis antes de que se realice la adquisición del segmento aórtico del donante, minimizando el tiempo de isquemia fría y cálida. En tercer lugar, el diámetro de la anastomosis se mantiene constante debido al carácter rígido del manguito de poliimida. Por lo tanto, las estenosis de la región anastomótica pueden ser descuidadas.
Además, el procedimiento quirúrgico es menos traumático para el animal receptor en comparación con la técnica con la incisión abdominal. Además, la implementación de la técnica del manguito ofrece la posibilidad de varios tipos diferentes de trasplante de órganos sólidos utilizando la misma técnica en el animal receptor11,20,21.
A pesar de que estamos convencidos de que esta técnica microquirúrgica es más fácil de aprender que otros modelos de trasplante aórtico descritos en la literatura, hay algunos escollos posibles durante el procedimiento. Durante la operación del receptor, asegúrese de cauterizar adecuadamente el músculo esternocleidomastoideo antes de cortarlo. El músculo está bien vascularizado y puede producirse sangrado severo si los vasos que lo acompañan no están coagulados a fondo. Estas hemorragias son difíciles de controlar, ya que el músculo se retraerá una vez completamente diseccionado. Además, mientras moviliza la arteria carótida común, asegúrese de no agarrar directamente la arteria en sí.
El procedimiento del manguito en sí es la parte más difícil de la operación con mucho y más susceptible al fracaso. Por lo tanto, es vital trabajar con la longitud correcta de la arteria carótida. Al principio, los cirujanos tienden a preparar muy poca longitud de la arteria carótida, lo que hace que el procedimiento sea mucho más difícil de completar. Además, al principio, los cirujanos tienden a establecer la ligadura divisoria alrededor de la arteria carótida común justo en el centro del campo de operación. Esto puede conducir a dificultades al realizar el manguito más craneal, ya que este segmento de extremo carotídeo es bastante rígido y difícil de movilizar. Mientras tanto, una porción significativa de la arteria carótida común puede ser movilizada por una ligera tensión desde el área debajo de la clavícula. Por lo tanto, sugerimos ligar la arteria carótida un poco más proximalpara para dejar más longitud a la parte craneal de la arteria carótida común. Una vez diseccionada la arteria carótida común y se pasan los extremos a través de los puños y se fijan con las abrazaderas vasculares, se debe realizar la dilatación de la arteria carótida. En esta parte de la operación, es muy importante no estirar demasiado el recipiente, ya que esto puede dañar la pared del recipiente, lo que conduce a un fallo durante el procedimiento de esposado. Girar todo el campo operativo para que la tracción esté en línea con la alineación de la abrazadera arterial en el manguito facilita el procedimiento.
Mientras adquieres el segmento aórtico, asegúrate de no arrancar ninguna arteria intercostal u otras ramas de la aorta torácica. Por otro lado, tenga cuidado de no cauterizar demasiado cerca de la aorta torácica para evitar daños del injerto con mayor riesgo de trombosis del injerto después del trasplante.
Al implantar el segmento aórtico, asegúrese de que ambos extremos estén correctamente alineados para evitar la torsión del injerto. Además, el segmento aórtico debe acortarse a la longitud correcta para evitar la torsión durante la reperfusión. Al reperfundir el injerto, asegúrese de abrir siempre la abrazadera más craneal primero para observar la hemostasis. Las pequeñas hemorragias de arterias intercostales no completamente coaguladas se pueden controlar aplicando una presión suave con un pequeño hisopo de algodón.
Todo el trasplante debe tardar menos de una hora con un máximo de 30 minutos para la preparación del receptor y un máximo de 15 minutos cada uno para la operación e implantación del donante.
La desventaja más discutida de este método es que el manguito persistirá en la anastomosis durante la duración del experimento. Esto podría conducir a una cierta reacción del cuerpo extraño y un posible mayor riesgo de trombosis. Sin embargo, los análisis histopatológicos de especímenes trasplantados con la técnica del manguito revelaron sólo una leve reacción en cuerpo extraño del injerto y el tubo22. Otra limitación discutida del procedimiento es la colocación heterotópica de la aorta torácica en la arteria carótida común. Debido a los diferentes diámetros de los vasos entre la aorta torácica y la arteria carótida común, se podría esperar un flujo más turbulento en el segmento aórtico trasplantado en comparación con una interposición ortotrópica aórtica. Esto podría dar lugar a cambios intimales basados en metódicos. Sin embargo, los segmentos trasplantados sinémicos revelaron sólo poca formación de neointima que descartaba un sesgo metódico (ver Figura 2).
Este trabajo tiene como objetivo facilitar la implementación de este modelo por parte de otros investigadores en sus laboratorios. Con las modificaciones antes mencionadas, este modelo de ratón de trasplante aórtico se puede lograr con habilidades microquirúrgicas básicas, mientras se logra una alta tasa de éxito.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb-c Mice (H2-d) | Charles River | Strain# 028 | Donor animal |
| Bipolar cautery system | ERBE | ICC 50 / 20195-023 | Bipolar cautery |
| C57BL/6J (H-2b) | Charles River | Strain# 027 | Recipient animal |
| Halsey Needle Holders | FST | 12501-12 | Needle Holder |
| Halsted-Mosquito Forceps | AESCULAP | BH111R | Curved Clamp |
| Medical Polyimide Tubing | Nordson MEDICAL | 141-0031 | Cuff-Material |
| Micro Serrefines | FST | 18055-04 | Micro Vessel Clip |
| Micro-Adson Forceps (serrated) | FST | 11018-12 | Standard Forceps |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | FST | 18057-14 | Clipapplicator |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°) | S&T | 00649-11 | Fine Forceps |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm) | S&T | 00125-11 | Vesseldilatator |
| Schott VisiLED Set | Schott | MC 1500 / S80-55 | Light |
| Stereoscopic microscope | ZEISS | SteREO Discovery.V8 | Microscope |
| Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | 91460-11 / 14001-12 | Standard Sissors |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm) | FST | 15004-08 | Microsissors (curved) |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm) | FST | 15003-08 | Microsissors (straight) |
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