Summary
Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
세포 대사가 조혈 줄기 세포 (HSC) 자기 갱신의 중요한 레귤레이터이기 때문에, 조혈 항상성에서 미토콘드리아가 하는 다양한 역할은 HSC 연구원에 의해 광범위하게 연구되었습니다. 미토콘드리아 활성 수준은 TMRM(테트라메틸라호다민, 메틸 에스테르)과 같은 세포-식양이온염료로 측정할 수 있는 막 전위(ΔΘm)에 반영됩니다. 그러나 세포에서 이러한 염료를 돌출하는 유출 펌프의 능력은 그 유용성을 제한할 수 있습니다. xenobiotic 수송기는 분화한 세포에서 보다는 HSC에 있는 발현 그리고 활동의 상부를 전시하기 때문에 결과 측정 편향은 HSC를 평가할 때 특히 중요합니다. 여기에서는 여러 골수 집단에서 ΔΘm을 정확하게 측정하기 위해 유출 펌프 억제제인 Verapamil을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 펌프 활동의 결과 억제는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에서 TMRM 강도를 증가시키는 것으로 나타났으며 성숙한 분획에서 상대적으로 변하지 않은 채로 남습니다. 이것은 ΔΘm 의존염료가 사용될 때 요구되는 염료-유출 활동에 주의를 강조하고, 서면 및 시각화될 때, 이 프로토콜은 골수 내의 다른 인구, 또는 동일 인구를 정확하게 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다 다양한 실험 모델에 걸쳐.
Introduction
조혈 줄기 세포 (HSC)는 자가 갱신, 다중 강력하며 혈액의 모든 세포를 발생시킬 수있습니다 1,2. 세포 대사는 전사 인자, 본질적인 신호 및 미세 환경3,4,5와함께 HSC 유지 보수의 주요 조절제입니다. 따라서 미토콘드리아 기능 및 품질의 적절한 제어는HSC 유지 보수 6,7에매우 중요합니다.
미토콘드리아 멤브레인 전위(ΔΘm)는 미토콘드리아의 기능을 직접 반영하기 때문에 미토콘드리아의 평가에서 핵심 적인 매개 변수이며, 이는 전자 수송 사슬에서 양성자 펌핑 활성의 평형과 F를 통한 양성자 흐름에서 파생됩니다. 1/FO ATP 신디사이저. 이들은 모두 ATP8,9에대한 ADP의 산소 의존성 인산화에 대해 (유전자 발현 및 기질 가용성에 따라 다름)이 요구된다. 미토콘드리아 구획의 전기적 성전성을 활용하여, ΔΘm을 측정하기 위해 다양한 전위성 염료가 개발되었습니다. 그 중 하나는 테트라메틸호다민 메틸에스테르 과염소산염(TMRM)으로, 이는 조혈줄기 및 전구세포(11)를포함하는 다양한 세포에서 유세포분석에 의해 ΔΔm을 측정하는데 광범위하게 사용되고 있다.
미토콘드리아 염료는 이러한 세포의 엑세바이오틱 액피펌프의 높은 활성이 염료 압출(12)을 초래할 수 있기때문에, HSC에서 몇 가지 주의를 기울여 사용해야 한다. 실제로, 로다민 123과 같은 미토콘드리아 염료의 압출은 연구원이 HSCs13을 격리하거나 염료 Hoechst Blue 및 Hoechst Red14의 차동 압출을 이루에 의해 HSC "측군수"를 식별할 수 있게 해 주었습니다. 도 15. 또한 FUmitremorgin C, ATP 결합 카세트 하위 패밀리 G 부재 2 (ABCG2) 수송의 특정 차단제, HSPC16에서미토 트래커의 염색 패턴에 영향을미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과의 출판 후, 여러 연구는 xenobiotic 유출 펌프 억제제의 부재에 미토콘드리아 염료를 사용하여 수행되었다, HSC는 낮은 Δm 16미토콘드리아의 소수만 가지고 있다는 광범위한 인상으로 이어지는 , 17세 , 18.
그러나 최근에는, 프럭스 펌프의 광범위한 스펙트럼 억제제인 베라파밀이 미토콘드리아 염료 미토트래커 그린(MitoTracker Green)의 염색 패턴을 현저하게 수정한다는 것이 입증되었다. 이러한 불일치는 Fumitremorgin C가 Abcg2에 대해 매우 선택적이라는 사실 로 인한 것일 수 있으며, HSC는 또한 Abcb1a (Fumitremorgin C에 약하게 민감함)와 같은 다른 운송업체를 표현합니다19. 우리는 또한 다른 미토 콘 드리 아 염 염 염, TMRM 등, Nonyl 아크리딘 오렌지, 그리고 미토 트래커 오렌지 (MTO) 미토 트래커 그린과 동일한 패턴을 전시. 더 중요한 것은, 우리는 HSPC의 유동 세포 측정 패턴이 미토콘드리아 질량11이외에 그들의 ΔΘm을 반영한다는 것을 관찰했습니다.
TMRM 염료의 섭취는 엄격하게 미토콘드리아의 음전하에 따라 달라지지만, 그 결과 로 인한 염료 축적은 efflux 펌프20에의한 섭취와 클리어런스 사이의 일정한 균형입니다. HSC와 성숙한 세포 집단 사이의 xenobiotic 유출 펌프 발현의 차이는 이 균형에 영향을 미치고 편향된 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. Verapamil과 같은 전용 억제제의 사용은 전위성 염료에 의한 ΔΘm의 분석에서 고려되어야 합니다. 여기에서 우리는 전용 억제제의 사용을 통해 xenobiotic 수송기 활동을 정정하는 TMRM 기지를 둔 유량 세포측정에 의하여 정확한 ΔΘm 측정을 위한 수정된 프로토콜을 기술합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 염색 완충제 (인산 완충 식염수 (PBS) + 2 % 태아 소 혈청 (FBS)): 멸균 PBS 용액의 500 mL에 FBS 10 mL을 추가하십시오.
참고: 이 용액은 멸균 상태에서 적어도 1 개월 동안 4 °C에서 보관될 수 있다. 다음 절차를 시작하기 전에 이 용액(50 mL)의 별칭을 얼음 위에 놓습니다. - ACK (암모늄 염화물 칼륨) 라이징 버퍼 : 절차를 시작하기 전에 ACK 라이징 버퍼 (1 mL)의 aliquot를 얼음위에 놓습니다.
참고: 동일한 비상업적 완충액을 준비하려면, NH4Cl 8.02 g, KHCO3 g 1 g 및 Na2EDTA 의 37.2 mg을 H2O의 1 L에 용해하여 pH를 7.2-7.4로 조정한다. 실온에서 최대 6개월간 보관하십시오. - 배양 배지: 조혈 세포의 배양 및 확장을 위한 혈청이 없는 배지에 50 ng/mL 줄기 세포 인자(SCF)와 50 ng/mL 혈전포이에틴(TPO)을 추가합니다(상업용 배지용 재료 표 참조).
- TMRM 스톡 용액: 에탄올 10 mL에 5 μg의 TMRM 분말을 용해시킴으로써 TMRM(1 μM) 용액을 준비한다. 이 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오.
- Verapamil 스톡 솔루션: 에탄올 1 mL에 24 mg의 베라파밀을 희석하여 베라파밀(50 mM) 용액을 준비합니다. 이 용액을 -20 °C에 보관하십시오.
- FCCP 스톡 솔루션: 에탄올 1 mL에 254 mg을 용해시켜 카보닐시아니드 p-트리플루오메톡시페닐히드라존(FCCP) (1M) 용액을 준비합니다. 이 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오.
2. 골수 격리
- 기관 지침에 따라CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사시키고 마우스를 70% 에탄올로 분무하였다.
참고: 이 단계는 실험 결과를 손상시키지 않으면서 관심 있는 세포의 오염을 방지합니다. - 집게와 날카로운 가위를 사용하여 마우스의 복부 피부에 작은 스니핑을하고 피부를 스트레칭하십시오.
- 대퇴골과 경골은 대퇴골의 머리를 빼내지 않도록 주의하면서 다량의 골수 세포를 함유하고 있습니다. 제거된 뼈를 1.5 mL의 염색 버퍼로 채워진 6웰 플레이트에 놓습니다.
참고: 이 절차는 멸균 영역을 필요로하지 않습니다. - 뼈에서 근육을 제거하고 골수의 출구를 허용 뼈의 끝을 잘라 (그림1A). 1.5 mL의 염색 버퍼로 깨끗한 뼈를 새 우물에 놓습니다.
참고: 근육과 다른 조직은 다음 단계에서 주사기 막힘을 피하기 위해 신중하게 제거해야합니다. - 25G 바늘로 3 mL 주사기를 사용하여 골수를 씻어 내보하십시오.
참고: 뼈가 하얗게 될 때까지 골수를계속 씻어 내보릅니다(그림 1B). - 1.5 mL 튜브에 있는 모든 세포를 수집하고, 원심분리기를 180 x g에서 5분 간 제거한 다음 상월체를 버린다(도1C).
- 300 μL의 얼음 차가운 ACK 용해 완충액에서 펠릿을 매우 신중하게 중단하고 1 분 동안 얼음에 넣고 즉시 비활성 용해1 mL의 염색 버퍼를 추가하십시오. 원심분리기 180 x g에서5 분.
참고: 세포 펠릿이 흰색으로 나타납니다(그림1D). 분리된 세포의 총 수는 약 2-4x 10 7이다. - 단핵 세포를 얻기 위해 통합 된 35 μm 나일론 메쉬로 셀 스트레이너캡 (12 x 75 mm 2, 5 mL 용량)을 사용하여 1 mL의 염색 버퍼 및 필터에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 차단 한 후, 얼음에 샘플을 유지합니다.
3. HSC 검출을 위한 면역 염색
- 리니지(린) 칵테일을 준비합니다. 염색 완충액의 400 μL에서, CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM 및 Il7Ra에 대하여 다음의 생체질화 항체의 4 μL을 첨가하여 최종 희석 1:100을 얻었다.
- 형광공 컨쥬게이터 항체 (Abs)를 준비하십시오. 400 μL의 염색 완충제에서, 다음 복근의 4 μL을 첨가하여 최종 희석 1:100을 얻었다. 스트렙타비딘-퍼시픽 블루, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 및 CD34-FITC. 빛으로부터 보호, 얼음에 보관합니다.
- 샘플을 180 x g에서 5 분 동안 원심 분리한 다음 상한체를 버립니다.
- 세포 펠릿에 린 칵테일 용액 400 μL을 추가합니다. 4 μL의 CD135-바이오틴틸화된 Ab. Vortex를 빠르게 넣고 얼음에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다.
- 3 mL의 염색 버퍼를 추가 한 샘플을 씻고 180 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한제를 버립니다.
- 400 μL의 복근 용액을 추가하십시오. 소용돌이는 빠르게 혼합하고 얼음에 30 분 동안 배양.
- 3 mL의 염색 버퍼로 샘플을 씻고 180 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한을 버립니다.
4. TMRM 염색
- TMRM 염색 용액을 준비합니다. TPO를 사용하여 배양 및 조혈 세포의 배양 및 확장을 위한 혈청이 없는 배지의 1.1 mL에 TMRM 스톡 용액 2.2 μL과 Verapamil 1.1 μL(각각 최종 농도로 50 μM)을 추가합니다(상업용 배지권장 재료 표 참조). 및 SCF.
참고: 이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. Verapamil 추가는 HSC에서 고도로 표현되고 TMRM을 돌출할 수 있는 유출 펌프를 막기 위해 필요합니다. - TMRM 염색 용액의 1 mL에서 골수를 재중단하고, 와류를 빠르게 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
참고: TMRM 염색은 씻어낼 수 없습니다. PE 전용 보상 제어는 또한 TMRM 염색 용액의 100 μL에서 재중단되고, 빠른 와류 후 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션을 행하였다. - 유세포계의 막힘을 방지하기 위해 35 μm나일론 메쉬로 셀 스트레이너 캡(12 x 75 mm 2, 5 mL 용량)을 사용하여 샘플을 필터링합니다.
참고: TMRM 염색은 시료에서 막힘 형성의 가능성을 증가시킨다. 유동 검문바로 전에 시료의 여과가 권장됩니다. - 유세포 측정에 의한 죽은 세포를 배제하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)의 1 μL을 추가합니다.
5. 유세포계에 의한 취득
- 골수 샘플을 실행하고 적어도 1 x 106 이벤트를 획득합니다.
-
게이팅 전략을 설정하여 상이한 조혈 인구를 식별합니다(그림 2).
- 디스플레이 라이브 골수 모노 핵 세포 (BM-MNCs), DAPI- 분율, CD135를 식별하기 위해 태평양 블루 플롯-린- (린-) 및 린+ 분수.
- 플롯 린- C 키트+ Sca-1+로, 다능한 선조 (MPP) 분율을 식별하기 위해 PE / Cy7 (Sca-1) 대 APC / Cy7 (c 키트)에 대한 분율 .
- CD150+ 및 CD48로, HSC 분수를 식별하기 위해 PerCP / Cy5.5 (CD150)에 대한 APC (CD48) 대 MPP 분획을 플롯-.
- -HSC 및 CD34+-HSC-- - - - - - FITC (CD34)에 대한 HSC 분획을 표시합니다.
- 각 집단에서 TMRM 강도(PE 채널)를 획득한다.
- 획득 후, FCCP의 샘플 1 μL을 첨가하여 1 mM의 최종 농도를 얻고 37°C에서 5분 동안 배양한 다음 1 x 10 6개의 이벤트를 획득한다.
참고: FCCP는 ΔΘm을 발산하는 데 사용되는 미토콘드리아 비커플러입니다. TMRM 염색이 올바르게 작동하는지 확인하기 위해 실험 제어로 사용됩니다. FCCP의 투여 후, TMRM 강도는 크게감소되어야한다 (그림 3A). - 모든 BM-MNIC의 PE 강도에 따라 각 모집단의 PE의 평균 강도를 정상화하는 데이터를 분석합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 마우스 모델에서 BM-MNIC를 쉽게 격리할 수 있습니다. 그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약합니다: 골수 분리, 골수에서 플러시, 적혈구 포리해, 및 항체 염색 다음에 TMRM 염색은 특정 조혈 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해 .
BM-MNIC는 HSC를 포함하여 몇몇 세포 인구를 포함합니다. 이 프로토콜에 사용되는 항체 칵테일은 HSCs (CD34- 및 CD34+), 다능성 전구 세포 (MPPs), 린- 린+ 세포의 정제에 각각 21. 이러한 분수를 격리하기 위한 게이팅 전략은 그림2에 나와 있습니다.
관심 있는 인구의 확인 후, 밝은 신호로 나타나야 하는 TMRM 강도가 평가되었습니다. HSPC의 TMRM 프로파일은 PBS +2% FBS(그림 3A)에서 염색이 수행될 때 변경을 겪을 수 있기 때문에 혈청이 없는팽창 배지(SFEM)에서 TMRM 염색을 하는 것이 좋습니다.
그림 3C는 BM-MBC의 강도에 의해 정규화되는 각 집단의 평균 강도를 보여줍니다. Verapamil의 존재에 변경되었습니다 (그림3B,C). 유사한 결과는 사이클로스포린 H와 같은 다른 억제제에의해 수득되었다(도 3C). 따라서, ΔΔm에 의해 미토콘드리아에 적재된 TMRM의 정확한 양은 베라파밀 또는 사이클로스포린 H에 의한유출 펌프의 억제 후 측정될 수 있다(도 3C).
마지막으로, FCCP는 TMRM 염색의 정확성을 검증하는 데 사용될 수 있다. FCCP는 미토콘드리아를 탈분극화하여 TMRM 강도의 감소를 초래한다(그림3D). 이 접근법은 염색의 배경 강도를 결정하거나 음의 대조군으로 사용할 수도 있습니다.
그림 1: 프로토콜 순서도. BM-MNIC를 분리하고 얼룩지게 하는 절차의 그래픽 요약은 ΔΘm을 결정한다. 임계 단계는 그림 삽입(A-D)으로 강조 표시됩니다. 대퇴골 및 성인 C57BL/6 마우스로부터의 경혈을 분리하고 그들의 끝이 제거된다(A). 긴 뼈는 A에서와같이 밖으로 플러시 후 (B). 격리된 BM-MNIC전 (C) 및 후 (D) ACK 용해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 게이팅 설정. -HSC 및 CD34+-HSC, MPP, 린- 및 린+ 세포를 포함하는 상이한 조혈 인구를 식별하기 위한 게이팅 전략의 개략적 표현. 패널은 보보로, M. 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미토콘드리아 막 전위액의 유세포 분석. (A) PBS+2%FBS(녹색) 또는 혈청이 없는 팽창 배지(SFEM)(빨간색)에서 TMRM으로 염색된 HSC에서 ΔΔm의 대표적인 분포. (B,C) CD34에서 ΔΘm의 대표적인 분포--HSC 및 린- 세포 (B) 및 CD34에서 ΔΘm의 정량화--HSC, CD34+-HSC, MPP, 린- 및 린+ 세포 (C) 존재TMRM으로 염색 또는 유출 펌프 억제제의 부재. 각 집단의 TMRM 강도는 자신의 BM-MNCs의 TMRM 강도에 의해 정규화되었다(보노라, M. 외11). (D) HCS에서 TMRM 강도 분포의 대표적인 히스토그램(분홍색) 및 후(연한 파란색) FCCP 추가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미토콘드리아 막 전위 측정은 세포의 대사 상태에 중요한 미토콘드리아의 분석 그리고 평가의 초석입니다. 여기서, TMRM 염색에 의한 ΔΘm의 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. TMRM은 ΔΘm으로 인해 활성 미토콘드리아에 축적되는 세포-천형형 염료이며, 각각의 수준은 세포외, 세포질 및 미토콘드리아구획(10)사이의 평형 상태로 유지된다. 이 프로토콜은 테트라메틸호다민, 에틸 에스테르(TMRE) 및 JC-1을 포함하는 다양한 염료에 적응될 수 있다. 정확한 결과를 얻으려면 적절한 염색 조건이 중요합니다. 여기에는 빛 노출로부터의 보호, 적절한 배양 시간, 일정한 온도 유지 (37 °C) 및 세포 외 농도가 포함됩니다. TMRM 염료 수준이 아직 완벽한 평형에 도달하지 않은 경우 유세포 분석 공정에서 데이터를 수집하는 동안 예기치 않은 염색 강도 의 변화를 감지할 수 있습니다. 따라서 TMRM의 권장 염색 기간은 30분이 아닌 1시간입니다(한 TMRM 제조업체의 프로토콜에서 언급한 대로). 또한 염료의 안정성을 비교하기 위해 5 분 이내에 적어도 두 번 획득해야하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 항체와 염료 사이의 효율적인 색상 일치를 설정하는 것입니다. 조혈 인구는 잘 확립된 표면마커(21)를사용하여 유세포측정에 의해 검출될 수 있다. 여기서 설명된 게이팅전략(도 2)은 TMRM 염색과 호환되며, 상이한 분화 단계에서 그 강도를 동시에 측정할 수 있다. TMRM은 PE 채널과 일치하지만, 그 강도는 일반적으로 PE와 공액된 항체의 강도보다 훨씬 약하다(데이터는 도시되지 않음). 이는 일부 모집단의 스펙트럼에서 예기치 않은 변화를 야기하는 색상 보정에 영향을 줄 수 있기 때문에 TMRM 염색이 있는 샘플을 PE 채널에 대한 보정 제어로 사용해야 합니다.
현재 프로토콜의 주요 장점은 TMRM 염료의 효율적인 압출이 플라즈마 멤브레인과 미토콘드리아 축적을 통해 평형을 모두 수정하는 xenobiotic 유출 펌프의 효과를 제거할 수 있다는 것입니다. 이것은 염료 흡수에 의한 HSC 미토콘드리아 기능의 정확한 평가에 있는 중요한 단계입니다. HSC가 커밋된 세포19보다더 활성 유출 펌프를 발현함에 따라, Verapamil 또는 유사한 약물, 예컨대 사이클로스포린 H,Ca2+-독립적 다제 내성 억제제22(그림 3B- C)에 사용되어야 한다. 미토콘드리아 활성 수준을 보다 정확하게 평가하기 위한 HSC의 염색 절차. 이중요한 문제는 최근11,19에서 지적되었고 아직 논의 중이기 때문에이 보고서의 주요 목적은 절차를 표준화하는 데 도움이되는 쉽고 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 재현 가능한 데이터를 얻고 다른 연구 그룹의 결과 사이의 명백한 불일치를 줄일 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 투여량, 타이밍 및 특정 미디어를 포함하는 각 단계를 상세히 나타낸다. 예를 들어 HSPC의 TMRM 프로파일은 매체에 따라다를 수 있습니다(그림 3A). 관련된 메커니즘에 대한 상세한 분석은 추가 적인 탐구가 필요하지만 혈청이없는 팽창 배지 (SFEM)는 HSC 배양을위한 잘 확립 된 방법이기 때문에, SFEM은 HSC에 대한 TMRM 염색을 수행 할 때 강하게 권장됩니다. 또한, 유출 펌프의 억제를 통해 여기에서 입증 된 미토콘드리아 막 전위에 대한 정확한 평가는 Verapamil의 가능한 미래 응용 프로그램뿐만 아니라 다른 염료 (예 : MitoTracker, MitoSOX)의 조사에서 강조합니다. HSC.
중요한 것은, 유세포분석으로 나타난 TMRM 강도는 미토콘드리아 부피를 정확하게 반영하지 않을 수 있다. 유세포측정은 세포당 총 형광 강도를 측정하지만, 미토콘드리아에 미토콘드리아 염료의 분포는 Δ에 따라 달라집니다. 따라서 TMRM 판독값에 대한 중요한 기여가 Δ리엠 또는 미토콘드리아 볼륨11에서유래하는지 여부를 분별하기가 어렵습니다. 미토콘드리아 질량을 측정하는 데 가장 자주 사용되는 염료 중 하나인 MTO가 ΔΘm 및 유출 펌프 활동의 영향을 받는다는 것을 확인했습니다. 우리는 또한 VerapamilHSPC 인구에 있는 MTO의 강렬 단면도를 변경한다는 것을 관찰했습니다, 그러나 MTO 강렬 과 미토콘드리아 부피11사이 아무 상관관계도 찾아하지 않았습니다. 미토콘드리아 부피와 ΔΘm의 결합 측정은 데이터를 정상화하고 막 전위 효과를 제거하는 데 사용되어야 하며, 미토콘드리아 함량의 추가 탐색은 ΔΘm 독립적 인 기술을 사용하여 수행되어야합니다.
이러한 기술은 형광 마커 (예를 들어, 미토콘드리아 단백질의 면역 염색), 전자 현미경 검사법11및 미토콘드리아 / 핵 DNA 비율의 정량화를 기반으로 3D 부피 분석을 포함합니다. 유출 시스템 억제제와 함께 미토콘드리아 염료 (즉, TMRM)를 사용하는 것은 유세포 측정을 통한 미토콘드리아 생물학의 해명에 큰 이점을 증명할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 이토 실험실의 모든 구성원을 감사, 특히 K 이토와 H 사토, 의견과 아인슈타인 흐름 세포 분석 및 분석 이미징 핵심 시설에 대한 아인슈타인 줄기 세포 연구소 (국립 암 연구소 보조금 P30 CA013330)에 대한 실험을 수행하는 데 도움이됩니다. K.I.는 아인슈타인 단세포 유전체학/후성유전체학(C029154)의 핵심 이사로서 국립보건원(R01DK98263, R01DK115577 및 R01DK100689)과 뉴욕 주 보건부의 보조금으로 지원됩니다. K.I. 이토는 백혈병과 림프종 학회의 연구 학자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
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