Summary
Xenobiotic efflux पंप हेमेटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (HSPCs) में अत्यधिक सक्रिय हैं और TMRM के बाहर निकालना कारण, एक mitochondrial झिल्ली संभावित फ्लोरोसेंट डाई. यहाँ, हम Verapamil, एक efflux पंप अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में TMRM द्वारा HSPCs में mitochondrial झिल्ली क्षमता को सही ढंग से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं.
Abstract
सेलुलर चयापचय के रूप में hematopoietic स्टेम सेल (HSC) आत्म नवीकरण के एक प्रमुख नियामक है, hematopoietic homeostasis में mitochondria द्वारा निभाई विभिन्न भूमिकाओं बड़े पैमाने पर एचएससी शोधकर्ताओं द्वारा अध्ययन किया गया है. Mitochondrial गतिविधि के स्तर उनकी झिल्ली क्षमता में परिलक्षित होते हैं (जेडएम), जो इस तरह के TMRM (tetramethylrhodamine, मिथाइल एस्टर) के रूप में सेल-परमेन्टिक धनानिक रंगों द्वारा मापा जा सकता है। efflux पंप की क्षमता कोशिकाओं से इन रंगों को बाहर निकालने के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित कर सकते हैं, तथापि. परिणामस्वरूप माप पूर्वाग्रह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एचएससी का आकलन, के रूप में विदेशी ट्रांसपोर्टरों अलग कोशिकाओं की तुलना में एचएससी में अभिव्यक्ति और गतिविधि के उच्च स्तर का प्रदर्शन. यहाँ, हम Verapamil, एक efflux पंप अवरोध करनेवाला का उपयोग एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सही उपाय करने के लिए - कई अस्थि मज्जा आबादी भर में $m. पंप गतिविधि के परिणामस्वरूप निषेध hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) में TMRM तीव्रता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि यह परिपक्व भिन्नों में अपेक्षाकृत अपरिवर्तित छोड़ने. यह डाई-efflux गतिविधि है कि जब $m-निर्भर रंगों का उपयोग किया जाता है की आवश्यकता है के करीब ध्यान पर प्रकाश डाला गया है, और के रूप में लिखा है और visualized, इस प्रोटोकॉल सही अस्थि मज्जा के भीतर या तो अलग आबादी की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक ही आबादी विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल भर में।
Introduction
Hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) स्वयं नवीनीकरण कर रहे हैं, बहु शक्तिशाली, और रक्त के सभी कोशिकाओं को जन्म देने में सक्षम1,2. सेलुलर चयापचय एचएससी रखरखाव का एक प्रमुख नियामक है, साथ ही ट्रांसक्रिप्शनल कारक, आंतरिक संकेतों और सूक्ष्म पर्यावरण3,4,5. माइटोकोंड्रियाल कार्य और गुणवत्ता का उचित नियंत्रण इसलिए एचएससी रखरखाव6,7के लिए महत्वपूर्ण है .
माइटोकोंड्रिया झिल्ली विभव (जेडएम) माइटोकोंड्रिया के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है क्योंकि यह सीधे उनकी कार्यक्षमता को दर्शाता है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में प्रोटॉन पंपिंग गतिविधि के संतुलन से प्राप्त होता है और एफ के माध्यम से प्रोटॉन प्रवाह 1/एफओ एटीपी synthase. ये दोनों आवश्यक हैं (जीन अभिव्यक्ति और सब्सट्रेट उपलब्धता के आधार पर) एडीपी के एटीपी8,9के लिए ऑक्सीजन पर निर्भर फॉस्फोरिलेशन के लिए। माइटोकोंड्रियाल कम्पार्टमेंट की इलेक्ट्रोनेगेटिविटी का लाभ उठाते हुए, विभिन्न potentiometric रंगों को मापने के लिए विकसित किया गया है। उनमें से एक टेट्रामेथिलहोडामाइन मिथाइल एस्टर परक्लोरेट (टीएमआरएम) है, जिसका उपयोग विभिन्न कोशिकाओंमेंप्रवाह साइटोमेट्री द्वारा 10, हेमेटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं11सहित , प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है।
Mitochondrial रंगों HSCs में कुछ सावधानी के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए, तथापि, क्योंकि इन कोशिकाओं के विदेशी बायोटिक efflux पंप की उच्च गतिविधि डाई बाहर निकालना में परिणाम कर सकते हैं12. वास्तव में, ऐसे Rhodamine 123 के रूप में mitochondrial रंगों के बाहर निकालना शोधकर्ताओं HSCs को अलग करने की अनुमति दी है13 या HSC की पहचान "साइड आबादी" रंगों के अंतर बाहर निकालना शोषण द्वारा Hoechst ब्लू और Hoechst लाल14, 15यह भी दिखाया गया है कि FUmitremorgin सी, एटीपी बाध्यकारी कैसेट उप परिवार जी सदस्य 2 (ABCG2) ट्रांसपोर्टर के एक विशिष्ट अवरोधक, HSPCs16में MitoTracker के धुंधला पैटर्न को प्रभावित नहीं करता है . इन परिणामों के प्रकाशन के बाद, कई अध्ययन ों exobiotic efflux पंप inhibitors के अभाव में mitochondrial रंगों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया, व्यापक धारणा है कि HSCs कम के साथ mitochondria की केवल एक छोटी संख्या है के लिए अग्रणी $ m16 , 17 , 18.
हाल ही में, यह प्रदर्शन किया गया था, तथापि, कि Verapamil, efflux पंपों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोध करनेवाला, काफी mitochondrial डाई MitoTracker ग्रीन19के दाग पैटर्न को संशोधित करता है. इस विसंगति तथ्य यह है कि Fumitremorgin सी Abcg2 के लिए अत्यधिक चयनात्मक है की वजह से होने की संभावना है, जबकि HSCs भी ऐसे Abcb1a के रूप में अन्य ट्रांसपोर्टरों व्यक्त (जो केवल कमजोर Fumitremorgin सी के प्रति संवेदनशील है)19. हमने यह भी सूचित किया है कि अन्य mitochondrial रंगों, जैसे TMRM, Nonyl acridine नारंगी, और Mitotracker ऑरेंज (MTO) Mitotracker ग्रीन के रूप में एक ही पैटर्न प्रदर्शन. इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने देखा है कि एच एसपीसी के प्रवाह साइटोमेट्रिक पैटर्न माइटोकोंड्रियाल द्रव्यमान11के अतिरिक्त उनके $m को प्रतिबिंबित करते हैं।
टीएमआरएम डाई का सेवन सख्ती से माइटोकोंड्रिया के ऋणात्मक आवेश पर निर्भर करता है, लेकिन डाई का परिणामी संचय इसके सेवन और प्रवाह के बीच लगातार संतुलन में है जो कि एफलक्स पंप20द्वारा होता है। एचएससी और परिपक्व कोशिका आबादी के बीच विदेशी बायोटिक efflux पंप अभिव्यक्ति में अंतर इस संतुलन को प्रभावित करता है और पक्षपाती परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Verapamil जैसे समर्पित inhibitors के उपयोग potentiometric रंगों द्वारा $ m के विश्लेषण में विचार किया जाना चाहिए. यहाँ हम टीएमआरएम-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सटीक माप के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो समर्पित अवरोधकों के उपयोग के माध्यम से विदेशी जीवीय ट्रांसपोर्टर गतिविधि को सही करता है।
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Protocol
यहाँ वर्णित सभी तरीकों को अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. समाधान की तैयारी
- दाग बफर (फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) + 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)): एक बाँझ पीबीएस समाधान के 500 एमएल में FBS के 10 एमएल जोड़ें।
नोट: इस समाधान बाँझ हालत में कम से कम एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रक्रियाओं को शुरू करने से पहले, बर्फ पर इस समाधान (50 एमएल) का एक aliquot डाल दिया। - ACK (अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम) lysing बफर: प्रक्रिया शुरू करने से पहले बर्फ पर एक ेलीकोट (1 एमएल) बर्फ पर रखें।
नोट: इसी गैर-वाणिज्यिक बफर को तैयार करने के लिए, एनएच4सीएल के 8.02 ग्राम, KHCO3 के 1 ग्राम और 37.2 मिलीग्राम ना2EDTA को 1 L के 1 L में भंग करें2O. पीएच को 7.2-7.4 में समायोजित करें। कमरे के तापमान पर 6 महीने तक के लिए स्टोर करें। - संस्कृति माध्यम: संस्कृति और हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के विस्तार के लिए सीरम मुक्त माध्यम के लिए 50 एनजी/एमएल स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) और 50 एनजी/एमएल थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) जोड़ें (वाणिज्यिक माध्यम की सिफारिश के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
- TMRM स्टॉक समाधान: TMRM (1 डिग्री एम) समाधान इथेनॉल के 10 एमएल में TMRM पाउडर के 5 डिग्री ग्राम भंग करके तैयार करें। इस समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें जो प्रकाश से सुरक्षित है।
- वेरापामिल स्टॉक समाधान: 1 एमएल इथेनॉल में 24 मिलीग्राम वेरापामिल को कम करके वेरापामिल (50 एमएम) घोल तैयार करें। इस समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
- FCCP स्टॉक समाधान: कार्बोनिलसियाइड p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) समाधान को 1 एमएल इथेनॉल में 254 मिलीग्राम घोलित करें। इस समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें जो प्रकाश से सुरक्षित है।
2. अस्थि मज्जा अलगाव
- संस्थागत दिशा निर्देशों के बाद सीओ2 इनहेलेशन द्वारा माउस को यूथेनाइज करें और चूहों को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
नोट: यह कदम प्रयोगात्मक परिणामों से समझौता किए बिना ब्याज की कोशिकाओं के संदूषण को रोकता है। - संदंश और तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, माउस के अधर त्वचा में एक छोटा सा कटाक्ष करते हैं और त्वचा खिंचाव.
- फीमर और टिबिया निकालें, जबकि देखभाल करने के लिए फीमर के सिर उखाड़ना नहीं के रूप में वे अस्थि मज्जा कोशिकाओं की एक बड़ी राशि होते हैं. निकाले गए हड्डियों को 1.5 एमएल धुंधला करने वाले बफर से भरी 6-वेल प्लेट में रखें।
नोट: इस प्रक्रिया बाँझ क्षेत्र की आवश्यकता नहीं है. - हड्डियों से मांसपेशियों को निकालें और अस्थि मज्जा के बाहर निकलने की अनुमति हड्डियों के सिरों में कटौती (चित्र 1A) . साफ हड्डियों को 1.5 एमएल धुंधला बफर के साथ नए कुओं में रखें।
नोट: मांसपेशियों और अन्य ऊतकों को ध्यान से अगले चरण में सिरिंज clogging से बचने के लिए हटाया जाना चाहिए. - एक 25 जी सुई के साथ एक 3 एमएल सिरिंज का उपयोग कर अस्थि मज्जा बाहर फ्लश.
नोट: अस्थि मज्जा को तब तक फ्लश करना जारी रखें जब तक कि अस्थि सफेद न हो जाए (चित्र 1ख) - 1.5 एमएल ट्यूब में सभी कोशिकाओं को एकत्र करें, 180 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र , फिर सुपरनेंट (चित्र 1C) को त्याग दें।
- बर्फ ठंड एके lysing बफर बहुत ध्यान से 300 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित, 1 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया और तुरंत निष्क्रिय lysis धुंधला बफर के 1 एमएल जोड़कर. 180 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
नोट: कोशिकाओं गोली सफेद दिखाई देता है (चित्र 1D) . अलग-थलग कोशिकाओं की कुल संख्या लगभग 2-4 x 107है। - मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए शामिल 35 मीटर नायलॉन जाल के साथ एक सेल-स्ट्रेनर टोपी (12 x 75 मिमी2, 5 एमएल क्षमता) का उपयोग करके दाग बफर और फिल्टर के 1 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें। अवरुद्ध करने के बाद, बर्फ पर नमूना रखें।
3. एचएससी की जांच के लिए इम्यूनोस्टेनिंग
- वंश (लिन) कॉकटेल तैयार करें। 400 डिग्री में धुंधला बफर के एल, CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM और Il7Ra के खिलाफ निम्नलिखित biotinilated एंटीबॉडी के 4 $L जोड़ें एक अंतिम कमजोर पड़ने 1:100 प्राप्त करने के लिए.
- फ्लोरोफोर्स संयुग्मी-एंटीबॉडी (एब्स) तैयार करें। 400 डिग्री धुंधला बफर में, एक अंतिम कमजोर पड़ने 1:100 प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित Abs के 4 डिग्री एल जोड़ें। Streptavidin-प्रशांत ब्लू, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 और CD34-FITC. बर्फ में रखें, प्रकाश से सुरक्षित.
- 180 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए नमूना सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सुपरनेंट को त्याग दें।
- कोशिकाओं गोली के लिए लिन कॉकटेल समाधान के 400 $L जोड़ें. सीडी 135-बायोटिनिनलेडेड एबी भंवर के 4 $L जोड़ें जल्दी से मिश्रण और बर्फ में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए।
- दाग बफर के 3 एमएल जोड़ने के नमूने को धो लें, 180 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन और supernatant त्यागें।
- Abs समाधान के 400 $L जोड़ें. भंवर जल्दी मिश्रण और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए।
- दाग बफर के 3 एमएल के साथ नमूने धो लें, 180 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन और supernatant त्यागें.
4. TMRM दाग
- TMRM धुंधला समाधान तैयार करें. टीएमआरएम स्टॉक समाधान का 2.2 $L और वेरापामिल का 1.1 डिग्री सेल्सियस (2 एन एम और 50 डिग्री सेल्सियस अंतिम एकाग्रता के रूप में, क्रमशः) संस्कृति और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के विस्तार के लिए सीरम-मुक्त माध्यम के 1.1 एमएल में जोड़ें (वाणिज्यिक माध्यम के लिए सामग्री की तालिका देखें) टीपीओ के साथ और एससीएफ.
नोट: यह प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है। Verapamil इसके अलावा efflux पंप है जो अत्यधिक HSCs में व्यक्त कर रहे हैं और TMRM extrude कर सकते हैं ब्लॉक करने के लिए आवश्यक है. - TMRM धुंधला समाधान के 1 एमएल में अस्थि मज्जा को फिर से निलंबित करें, भंवर जल्दी और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
नोट: TMRM धुंधला बाहर धोया नहीं जाना चाहिए. पीई समर्पित मुआवजा नियंत्रण भी TMRM धुंधला समाधान के 100 डिग्री एल में resuspended है, और जल्दी भंवर के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए ऊष्मायन के अधीन है। - प्रवाह साइटोमीटर के clogging से बचने के लिए शामिल एक 35 m नायलॉन जाल के साथ एक सेल-स्ट्रेनर टोपी (12 x 75 मिमी2, 5 एमएल क्षमता) का उपयोग कर नमूना फ़िल्टर।
नोट: TMRM धुंधला नमूना में रोकना गठन की संभावना बढ़ जाती है. प्रवाह परख से पहले नमूना के निस्पंदन की सिफारिश की है. - प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए 4', 6-diamidino-2-फेनिलिनो (डीएपीआई) के 1 $L जोड़ें।
5. फ्लो साइटोमीटर द्वारा अधिग्रहण
- अस्थि मज्जा नमूना चलाने के लिए और कम से कम 1 x 106 घटनाओं के अधिग्रहण।
-
विभिन्न हेमेटोपोइटिक जनसंख्या की पहचान करने के लिए गैटिंग कार्यनीति तैयार करें (चित्र 2) ।
- प्रदर्शन लाइव अस्थि मज्जा मोनो-एमएनसी (बीएम-MNCs), DAPI- अंश, प्रशांत ब्लू के लिएसाजिश में CD135 की पहचान करने के लिए-लिन] (लिन ] ( लिन ] और लिन+ भिन्न.
- प्लॉट लिन- APC/Cy7 (c-kit) बनाम PE/Cy7 (Sca-1) के लिए अंश multipotent progenitors (MPP) अंश की पहचान करने के लिए, सी-किट के रूप में+ और Sca-1+.
- Plot MPP अंश APC के लिए (CD48) बनाम PerCP/Cy5.5 (CD150) HSC अंशकी पहचान करने के लिए, CD150+ और CD48 के रूप में |
- डिस्प्ले HSC अंश के लिए FITC (CD34) को विभाजित करने के लिए CD34--HSC और CD34+-HSC.
- प्रत्येक जनसंख्या में TMRM तीव्रता (पीई चैनल) प्राप्त करें।
- अधिग्रहण के बाद, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम एम और इनक्यूबेट की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए FCCP के 1 डिग्री एल के नमूने में जोड़ें, फिर 1 x 106 इवेंट प्राप्त करें।
नोट: FCCP एक माइटोकोंड्रिल अनकप्लकर है, जिसका उपयोग $m को नष्ट करने के लिए किया जाता है। यह TMRM धुंधला सही ढंग से काम करता है कि पुष्टि करने के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। FCCP के प्रशासन के बाद, TMRM तीव्रता काफी कम किया जाना चाहिए (चित्र 3A). - सभी बीएम-MNCs के पीई की तीव्रता से प्रत्येक जनसंख्या के पीई की औसत तीव्रता को सामान्य करने वाले डेटा का विश्लेषण करें।
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Representative Results
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल से बीएम-MNCs के आसान अलगाव सक्षम बनाता है. चित्रा 1 प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है: हड्डी अलगाव, अस्थि मज्जा से बाहर फ्लशिंग, लाल रक्त कोशिका lysis, और एंटीबॉडी धुंधला एक विशिष्ट hematopoietic आबादी में mitochondrial झिल्ली क्षमता को मापने के लिए TMRM धुंधला द्वारा पीछा किया .
बीएम-एमएनसी में एचएससी सहित कई सेल आबादी होती है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एंटीबॉडी कॉकटेल एचएससी (सीडी34 और सीडी34+) के शुद्धिकरण में अच्छी तरह से स्थापित हैं , बहुशक्तिशाली जनक कोशिकाओं (एमपीपी), लिन- के रूप में अच्छी तरह से लिन+ कोशिकाओं, क्रमशः 21. इन भिन्नों को अलग-थलग करने की रणनीति चित्र 2में दर्शायी गई है।
ब्याज की आबादी की पहचान के बाद, TMRM तीव्रता, जो एक उज्ज्वल संकेत के रूप में दिखाई देना चाहिए, मूल्यांकन किया गया था. सीरम मुक्त विस्तार माध्यम (SFEM) में TMRM धुंधला अत्यधिक की सिफारिश की है, के रूप में HSPCs में TMRM प्रोफाइल परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं जब धुंधला पीबीएस में किया जाता है +2% FBS (चित्र 3A).
चित्रा 3C प्रत्येक जनसंख्या की औसत तीव्रता को दर्शाता है, जो बीएम-एमएनसी की तीव्रता से सामान्यीकृत होता है। एचएससी टीएमआरएम डाई20को बाहर निकालने में सक्षम विदेशी जीवीय एमेफ्लक्स पंपों के उच्च गतिविधि स्तर को व्यक्त करता है, और वास्तव में, हमने एचएसपीसी में टीएमआरएम प्रोफाइल पाया। वेरापामिल की उपस्थिति में परिवर्तित किया गया (चित्र 3 बी,सी) इसी प्रकार के परिणाम अन्य अवरोधकों जैसे Cyclosporin H (चित्र 3C) द्वारा प्राप्त किए गए थे . इस प्रकार, माइटोकोंड्रिया में लोड टीएमआरएम की सही मात्रा को वेरापैमिल या साइक्लोस्पोरिन एच (चित्र 3ब्) द्वारा एफलक्स पंपों के निषेध के बाद मापामिलियन के बाद मापामिलियन में मापान के बाद मापान किया जा सकता है।
अंत में, FCCP TMRM धुंधला की सटीकता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. FCCP माइटोकोंड्रिया का विध्रुवण करता है, जिसके परिणामस्वरूप टीएमआरएम तीव्रता में कमी आई है (चित्र 3डी)। इस दृष्टिकोण भी धुंधला और / या एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पृष्ठभूमि तीव्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्र 1: प्रोटोकॉल फ़्लोचार्ट. को अलग करने और BM-MNCs दाग करने के लिए प्रक्रिया का ग्राफिकल सारांश $ m निर्धारित करने के लिए. महत्वपूर्ण कदम चित्र सम्मिलित करता है(ए-डी)द्वारा हाइलाइट किए जाते हैं। वयस्क C57BL/6 चूहों से फीमर और tibias अलग थे और उनके सिरों को हटा रहे हैं (एक). लंबी हड्डियों के रूप में एक में बाहर फ्लश के बाद (बी) . (सी) से पहले और बाद में (डी) ACK lysis अलग बी.एम.एम.सी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: गैटिंग सेटअप. विभिन्न हेमेटोपोएटिक आबादी की पहचान करने के लिए गैटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, जिसमें CD34-HSC और CD34+-HSC, एमपीपी, लिन और लिन+ सेल शामिल हैं। पैनल Bonora, एम एट अल11से संशोधित किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: माइटोकोंड्रियाल झिल्ली क्षमता का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। (क) एचएससी में $एम का प्रतिनिधि वितरण पीबीएस +2%एफबीएस (हरा) में या सीरम-मुक्त विस्तार माध्यम (एसएफईएम) (लाल) में टीएमआरएम के साथ दाग ित है। (बी, सी) CD34 में $m का प्रतिनिधि वितरण--HSC और Lin] कोशिकाओं (B) और CD34 में $m की मात्रा निर्धारण--HSC, CD34+-HSC, MPP, Lin] और Lin+ कोशिकाओं (C) की उपस्थिति में TMRM के साथ दाग या efflux पंप inhibitors की अनुपस्थिति. प्रत्येक जनसंख्या की TMRM तीव्रता अपने बीएम-MNCs की TMRM तीव्रता द्वारा सामान्यीकृत किया गया था (Bonora से संशोधित, एम एट अल11). (घ) एचएससी में टीएमआरएम तीव्रता वितरण के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम (गुलाबी) पहले और बाद में (हल्के नीले) एफसीसीपी अतिरिक्त। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
Mitochondrial झिल्ली संभावित माप विश्लेषण और mitochondria के आकलन की एक आधारशिला है, जो कोशिका की चयापचय राज्य के लिए महत्वपूर्ण हैं. यहाँ, हम TMRM धुंधला द्वारा $ m के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. टीएमआरएम एक सेल-परमेन्ट फ्लोरोसेंट डाई है जो जेडएम के कारण सक्रिय माइटोकोंड्रिया में जमा हो जाता है, और इसके संबंधित स्तर बाह्यकोशिकीय, कोशिकाद्रव्यी और माइटोकोंड्रिल डिब्बों10के बीच संतुलन में रहते हैं। इस प्रोटोकॉल विभिन्न रंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, tetramethylrhodamine सहित, एथिल एस्टर (TMRE) और जेसी -1. उचित धुंधला स्थिति सही परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इनमें शामिल हैं: प्रकाश जोखिम, उचित ऊष्मायन समय, निरंतर तापमान के रखरखाव (37 डिग्री सेल्सियस) और extracellular एकाग्रता से सुरक्षा। जब TMRM डाई का स्तर अभी तक सही संतुलन तक पहुँच नहीं है, धुंधला तीव्रता में अप्रत्याशित परिवर्तन प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया में डेटा अधिग्रहण के दौरान पता लगाया जा सकता है. इसलिए TMRM के लिए सिफारिश की धुंधला अवधि है 1 एच के बजाय 30 मिनट (जैसा कि एक TMRM निर्माता के प्रोटोकॉल में उल्लेख किया). यह भी सुझाव दिया है कि नमूना 5-मिनट के भीतर कम से कम दो बार प्राप्त किया जाना चाहिए ताकि डाई की स्थिरता की तुलना करने के लिए.
प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी और डाई के बीच एक कुशल रंग मैच की स्थापना है. Hematopoietic आबादी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अच्छी तरह से स्थापित सतह मार्करों21का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। यहाँ वर्णित गैटिंग कार्यनीति (चित्र 2) टीएमआरएम अभिरंजन के साथ संगत है, और इसकी तीव्रता की माप के लिए विभिन्न विभेदन अवस्थाओं में एक साथ अनुमति देती है। TMRM पीई चैनल से मेल खाता है, लेकिन इसकी तीव्रता आमतौर पर पीई (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ संयुग्मी एंटीबॉडी की तुलना में बहुत कमजोर है। इस रंग मुआवजा को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में, कुछ आबादी के स्पेक्ट्रम में अप्रत्याशित बदलाव के कारण, TMRM धुंधला के साथ नमूना पीई चैनल के लिए एक मुआवजा नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
वर्तमान प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि यह विदेशी जीवीय efflux पंप, जिसका TMRM डाई के कुशल बाहर निकालना प्लाज्मा झिल्ली और उसके mitochondrial संचय भर में दोनों अपने संतुलन को संशोधित करने के प्रभाव को हटाने में सक्षम बनाता है. यह डाई अवशोषण द्वारा एचएससी माइटोकोंड्रियाल समारोह के सटीक मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण कदम है। के रूप में एचएससी प्रतिबद्ध कोशिकाओं की तुलना में अधिक सक्रिय efflux पंप व्यक्त19, Verapamil या इसी तरह की दवाओं, जैसे Cyclosporine एच, एक Ca2 +- स्वतंत्र बहुऔषध प्रतिरोध अवरोधक22 (चित्र 3 B-सी), में इस्तेमाल किया जाना चाहिए HSCs के लिए धुंधला प्रक्रिया अधिक सही mitochondrial गतिविधि के स्तर का आकलन करने के लिए. क्योंकि इस महत्वपूर्ण मुद्दे को अभी हाल ही में बताया गया था11,19 और अभी भी चर्चा के तहत23, इस रिपोर्ट का मुख्य उद्देश्य एक आसान और विस्तृत प्रोटोकॉल जो के लिए प्रक्रिया के मानकीकरण में मदद मिलेगी प्रदान करना है पुन: उत्पादनीय डेटा प्राप्त करना और विभिन्न अनुसंधान समूहों के परिणामों के बीच स्पष्ट विसंगतियों को कम करना. प्रोटोकॉल यहाँ विस्तार से प्रत्येक कदम से पता चलता है, खुराक सहित, समय और विशिष्ट मीडिया. उदाहरण के लिए, HSPCs में TMRM प्रोफाइल उनके माध्यम के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (चित्र 3A)। शामिल तंत्र का एक विस्तृत विश्लेषण आगे की खोज की आवश्यकता होगी, लेकिन जब से सीरम मुक्त विस्तार माध्यम (SFEM) HSC संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, SFEM बजाय PBS दृढ़ता से सिफारिश की है जब HSCs के लिए TMRM धुंधला प्रदर्शन. इसके अलावा, mitochondrial झिल्ली क्षमता का सटीक आकलन efflux पंप के निषेध के माध्यम से यहाँ प्रदर्शन Verapamil के संभावित भविष्य अनुप्रयोगों पर प्रकाश डाला गया, साथ ही अन्य रंगों (जैसे MitoTracker, MitoSOX), की जांच में एचएससी.
महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा दर्शाए अनुसार टीएमआरएम तीव्रता माइटोकोंड्रियाल आयतन को ठीक से प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है। प्रवाह साइटोमेट्री प्रति सेल कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापता है, लेकिन माइटोकोंड्रियाल रंगों का माइटोकोंड्रिया में वितरण $m पर निर्भर करता है। अतः यह समझना कठिन है कि क्या टीएमआरएम पठन में महत्वपूर्ण योगदान र्म् या माइटोकोंड्रियाल खंड11से प्राप्त होता है . हमने पुष्टि की है कि MTO, सबसे अधिक बार mitochondrial द्रव्यमान को मापने के लिए इस्तेमाल रंगों में से एक, दोनों से प्रभावित है $m और efflux पंप गतिविधि. हमने यह भी देखा है कि वेरापामिल एचएसपीसी की आबादी में MTO की तीव्रता प्रोफ़ाइल में परिवर्तन करता है, लेकिन MTO तीव्रता और mitochondrial मात्रा11के बीच कोई संबंध नहीं पाया है. माइटोकोंड्रियाल मात्रा और जेडएम का संयुक्त माप डेटा को सामान्य करने और झिल्ली की क्षमता के प्रभाव को खत्म करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए, और माइटोकोंड्रियाल सामग्री का आगे अन्वेषण किया जाना चाहिए , जो कि $m-स्वतंत्र तकनीकों का उपयोग करके किया जाना चाहिए।
ऐसी तकनीकों में फ्लोरोसेंट मार्कर (उदाहरण के लिए, माइटोकोंड्रिल प्रोटीन का इम्यूनोस्टेनिंग), इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी11,और माइटोकोंड्रियाल/न्यूक्लियर डीएनए अनुपात की मात्रा का परिमाण शामिल होगा। efflux प्रणाली inhibitors के साथ संयोजन में mitochondrial रंगों का उपयोग (यानी, TMRM) प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से mitochondrial जीव विज्ञान के स्पष्टीकरण में महान लाभ का साबित होगा.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों Ito प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद, विशेष रूप से कश्मीर Ito और एच Sato, और आइंस्टीन स्टेम सेल संस्थान टिप्पणियों के लिए और आइंस्टीन फ्लो साइटोमेट्री और विश्लेषणात्मक इमेजिंग कोर सुविधाओं (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान P30 CA013330 द्वारा वित्त पोषित) के लिए प्रयोगों को पूरा करने में मदद. के.आई. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01DK98263, R01DK115577, और R01DK100689) और आइंस्टीन एकल सेल जीनोमिक्स के कोर निदेशक के रूप में स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग से अनुदान द्वारा समर्थित है / के.आई. इतो ल्यूकेमिया और लिंफोमा सोसायटी के एक रिसर्च स्कॉलर हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
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