Summary
Xenobiotic effluxpumpar är mycket aktiva i hematopoietiska Stem och stamceller (HSPCs) och orsaka extrudering av TMRM, ett mitokondriellt membran potentiella fluorescerande färgämne. Här presenterar vi ett protokoll för att exakt mäta mitokondriell membran potential i HSPCs av TMRM i närvaro av verapamil, en effluxpumphämmare.
Abstract
Som cellulär metabolism är en viktig regulator av hematopoietisk stamcells (HSC) självförnyelse, de olika roller som spelas av mitokonbenerna i hematopoietisk homeostas har studerats utförligt av HSC forskare. Mitokondriella aktivitetsnivåer återspeglas i deras membran potentialer (ΔΨm), som kan mätas genom cell-permenade katjoniska färgämnen såsom TMRM (tetramethylrhodamine, metylester). Förmågan hos efflux pumpar att pressa dessa färgämnen från celler kan begränsa deras användbarhet, dock. Den resulterande mätningen bias är särskilt kritisk vid bedömningen av HSCs, eftersom xenobiotiska transportörer uppvisar högre uttrycks-och aktivitetsnivåer i HSCs än i differentierade celler. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar verapamil, en effluxpumphämmare, för att exakt mäta ΔΨm över flera benmärgs populationer. Den resulterande hämning av pump aktivitet visas för att öka TMRM intensitet i hematopoietiska stamceller och stamceller (HSPCs), samtidigt som den är relativt oförändrad i mogna fraktioner. Detta belyser den nära uppmärksamhet på Dye-efflux aktivitet som krävs när ΔΨm-beroende färgämnen används, och som skriftliga och visualiseras, detta protokoll kan användas för att exakt jämföra antingen olika populationer i benmärgen, eller samma population olika experimentella modeller.
Introduction
Hematopoietiska stamceller (hscs) är självförnyande, multi-potent, och kan ge upphov till alla celler i blodet1,2. Cellulär metabolism är en viktig regulator av HSC underhåll, tillsammans med transkriptionella faktorer, inneboende signaler och mikromiljö3,4,5. En korrekt kontroll av mitokondriell funktion och kvalitet är därför kritisk till HSC-underhåll6,7.
Mitokondriell membran potential (ΔΨm) är en viktig parameter vid bedömningen av mitokondrien eftersom den direkt återspeglar deras funktion, som härrör från balansen i protonpumpningsaktiviteten i elektrontransportkedjan och protonflödet genom F 1/FO ATP-syntas. Dessa krävs båda (beroende på genuttryck och substrat tillgänglighet) för syre beroende fosforylering av ADP till ATP8,9. Med utnyttjande av elektronegativitet av mitokondriella facket, olika potentiometriska färgämnen har utvecklats för att mäta ΔΨm. En av dem är tetrametylrodamin metylester perklorat (tmrm), som har använts i stor utsträckning för att mäta ΔΨm av flödescytometri i en mängd celler10, inklusive hematopoietiska Stem och stamceller11.
Mitokondriella färgämnen måste användas med viss försiktighet i hscs, dock, eftersom den höga aktiviteten av xenobiotiska effluxpumpar av dessa celler kan resultera i färg extrudering12. Faktum är att extrudering av mitokondriella färgämnen som Rhodamine 123 har tillåtit forskare att isolera HSCs13 eller identifiera HSC "sida populationer" genom att utnyttja differential extrudering av färgämnen Hoechst blå och Hoechst röd14, 15. det har också visats att Fumitremorgin C, en specifik blockerare av den ATP-bindande kassett underfamiljen G member 2 (ABCG2) transportör, påverkar inte infärgning mönstret av MitoTracker i HSPCs16. Efter offentliggörandet av dessa resultat, flera studier utfördes med hjälp av mitokondriella färgämnen i avsaknad av xenobiotiska effluxpumpshämmare, vilket leder till det utbredda intrycket att hscs har endast ett litet antal av mitokondrier med låg ΔΨm16 , 17 , 18.
Nyligen, det visades dock att verapamil, en bredspektrum hämmare av effluxpumpar, signifikant ändrar infärgning mönstret av mitokondriella Dye MitoTracker grön19. Denna avvikelse är sannolikt på grund av det faktum att Fumitremorgin C är mycket selektiv för Abcg2, medan HSCs också uttrycka andra transportörer som Abcb1a (som endast svagt känslig för Fumitremorgin C)19. Vi har också rapporterat att andra mitokondriella färgämnen, såsom tmrm, nonyl akridin orange, och mitotracker orange (MTO) uppvisar samma mönster som mitotracker Green. Ännu viktigare, vi har observerat att flödet korsmönster av hspcs återspeglar deras ΔΨm utöver mitokondriell massa11.
Intaget av TMRM färg beror strikt på den negativa laddningen av mitokonbruen, men den resulterande ansamling av färgämne är i konstant balans mellan dess intag och clearance av efflux pumpar20. Skillnaden i xenobiotiska effluxpumpens uttryck mellan hscs och mogna cellpopulationer påverkar denna balans och kan leda till partiska resultat. Användning av särskilda hämmare såsom verapamil bör övervägas i analysen av ΔΨm av potentiometriska färgämnen. Här beskriver vi ett modifierat protokoll för noggrann ΔΨm mätning av TMRM-baserad flödescytometri som korrigerar för xenobiotisk transport verksamhet genom användning av dedikerade hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Albert Einstein College of Medicine.
1. beredning av lösningar
- Färgbuffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2% fetalt bovint serum (FBS)): tillsätt 10 mL FBS i 500 mL av en steril PBS-lösning.
Anmärkning: Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c i minst en månad i sterilt skick. Innan du påbörjar följande procedurer, sätt en alikvot av denna lösning (50 mL) på is. - ACK (ammonium-klorid-kalium) lyseringslösning buffert: placera en alikvot av ACK lyseringslösning buffert (1 mL) på is innan proceduren påbörjas.
Anmärkning: För att förbereda samma icke-kommersiell buffert, lös upp 8,02 g NH4cl, 1 g KHCO3 och 37,2 mg na2EDTA i 1 L av H2O. Justera pH till 7.2-7.4. Förvaras i rumstemperatur i upp till 6 månader. - Odlingssubstrat: Tillsätt 50 ng/mL stamcells faktor (SCF) och 50 ng/mL trombopoietin (TPO) till serumfritt medium för kultur och expansion av hematopoietiska celler (se tabell över material för kommersiellt medium rekommenderas).
- TMRM stamlösning: Bered TMRM (1 μM) lösning genom att lösa upp 5 μg TMRM pulver i 10 mL etanol. Förvara denna lösning vid-20 ° c skyddad mot ljuset.
- Verapamil stamlösning: Bered verapamil (50 mM) lösning genom att späda 24 mg verapamil i 1 mL etanol. Förvara denna lösning vid-20 ° c.
- FCCP stamlösning: Bered carbonilcyanid p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) lösning genom att lösa upp 254 mg i 1 mL etanol. Förvara denna lösning vid-20 ° c skyddad mot ljuset.
2. benmärgs isolering
- Euthanize musen genom CO2 inandning efter institutionella riktlinjer och spraya möss med 70% etanol.
Anmärkning: Detta steg förhindrar kontaminering av cellerna av intresse utan att kompromissa med experimentella resultat. - Med hjälp av ett par tång och vassa saxar, gör en liten knipa i ventrala huden på musen och sträck ut huden.
- Extrahera lårbenet och Tibia samtidigt noga med att inte ta bort huvuden av lårbenet eftersom de innehåller en stor mängd benmärgsceller. Placera de borttagna benen i en 6-brunn tallrik fylld med 1,5 mL färgbuffert.
Anmärkning: Denna procedur kräver inte sterilt område. - Ta bort musklerna från benen och skär ändarna av benen så att utloppet av benmärgen (figur 1a). Placera de rengjorda benen i nya brunnar med 1,5 mL färgbuffert.
Anmärkning: Muskler och andra vävnader måste avlägsnas noggrant för att undvika att sprutan täpper till nästa steg. - Spola ut benmärgen med en 3 mL spruta med en 25 G nål.
Anmärkning: Fortsätt att spola benmärgen tills benet blir vitt (figur 1b). - Samla alla celler i en 1,5 mL tub, Centrifugera i 5 min vid 180 x g och kassera sedan supernatanten (figur 1c).
- Omsuspendera pelleten i 300 μL av Ice Cold ACK lyseringslösning buffert mycket noggrant, sätta på is i 1 min och omedelbart inaktiva lysis genom att tillsätta 1 mL färgbuffert. Centrifugera i 5 min vid 180 x g.
Anmärkning: Cellerna pelleten visas vit (figur 1d). Det totala antalet isolerade celler är ca 2-4 x 107. - Omsuspendera pellets i 1 mL färgbuffert och filtrera med hjälp av en cell-SIL mössa (12 x 75 mm2,5ml kapacitet) med en 35 μm nylon mesh införlivas för att få mononukleära celler. Efter blockering, hålla provet på is.
3. immunofärgning för detektion av HSC
- Förbered Lineage (LIN) cocktail. I 400 μL färgbuffert, tillsätt 4 μL av följande biotinilerade antikroppar mot CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM och Il7Ra för att erhålla en slutlig utspädning 1:100.
- Bered fluoroforer konjugerade-antikroppar (ABS). I 400 μL färgbuffert, tillsätt 4 μL av följande ABS för att få en slutlig utspädning 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/CY 5.5 och CD34-FITC. Förvaras i is, skyddat från ljus.
- Centrifugera provet i 5 min vid 180 x goch kassera sedan supernatanten.
- Tillsätt 400 μL av lin cocktail lösning till cellerna pellets. Tillsätt 4 μL CD135-biotinilated AB. Vortex snabbt att blanda och inkubera i 30 min i is.
- Tvätta provet genom att tillsätta 3 mL färgbuffert, snurra i 5 minuter vid 180 x g och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 400 μL ABS-lösning. Vortex snabbt att blanda och inkubera i 30 min på is.
- Tvätta proverna med 3 mL färgbuffert, snurra i 5 minuter vid 180 x g och Kassera supernatanten.
4. TMRM-färgning
- Förbered TMRM-färgningslösning. Tillsätt 2,2 μL TMRM-lagerlösning och 1,1 μL verapamil (2 nM och 50 μM som slutlig koncentration) i 1,1 mL serumfritt medium för kultur och utvidgning av hematopoietiska celler (se tabell över material för kommersiellt medium rekommenderas) med TPO och SCF.
Anmärkning: Detta är det viktigaste steget i protokollet. Verapamil är också nödvändigt för att blockera de effluxpumpar som är starkt uttryckta i HSCs och kan extrudera TMRM. - Omsuspendera benmärgen i 1 mL TMRM-färgningslösning, Vortex snabbt och inkubera i 1 h vid 37 ° c.
Anmärkning: TMRM-färgning får inte tvättas ur. PE-dedikerad kompensations kontroll är också återsuspenderad i 100 μL av TMRM färgning lösning, och utsätts för inkubering för 1 h vid 37 ° c efter Quick Vortex. - Filtrera provet med hjälp av en cell-SIL mössa (12 x 75 mm2,5ml kapacitet) med en 35 μm nylon mesh införlivas för att undvika igensättning av flödescytometern.
Anmärkning: TMRM färgning ökar risken för täppa formation i provet. Filtrering av provet precis före flödesanalyser rekommenderas. - Tillsätt 1 μL av 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) för att utesluta döda celler med flödescytometri.
5. förvärv med flödescytometer
- Kör benmärgs provet och förvärva minst 1 x 106 händelser.
-
Skapa en strategi för att identifiera de olika hematopoietiska populationerna (figur 2).
- Visa levande benmärg mono-nukleära celler (BM-MNCs), DAPI− fraktion, i observationsområdet för Pacific Blue för att identifiera CD135−lin− (lin−) och lin+ fraktioner.
- Plot lin− FRAKTION för APC/Cy7 (c-kit) kontra PE/Cy7 (SCA-1) för att identifiera multipotenta progenitorer (MPP) fraktion, som c-kit+ och SCA-1+.
- Plot MPP fraktion för APC (CD48) kontra PerCP/CY 5.5 (CD150) för att identifiera HSC fraktion, som CD150+ och CD48−.
- Visa HSC-fraktionen för FITC (CD34) för att dela CD34−-HSC och CD34+-HSC.
- Uppnå TMRM-intensitet (PE-kanal) i varje population.
- Efter förvärvet lägger du till provet 1 μL av FCCP för att få den slutliga koncentrationen av 1 mM och inkubera vid 37 ° c i 5 min, och sedan förvärva 1 x 106 händelser.
Anmärkning: FCCP är en mitokondriell uncoupler som används för att skingra ΔΨm. Det används som experimentell kontroll för att bekräfta att TMRM-färgning fungerar korrekt. Efter administrering av FCCP bör TMRM-intensiteten minskas drastiskt (figur 3a). - Analysera data normalisera den genomsnittliga intensiteten av PE för varje population av intensiteten av PE av alla BM-MNCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs ovan möjliggör enkel isolering av BM-MNCs från en musmodell. Figur 1 sammanfattar de viktigaste stegen i protokollet: Ben isolering, spolning ut ur benmärgen, röda blodkroppar lysis, och antikropps färgning följt av TMRM färgning för att mäta mitokondriell membran potential i en specifik hematopoietisk population .
BM-MNCs innehåller flera cellpopulationer, inklusive HSCs. De antikropps cocktails som används i detta protokoll är väl etablerade i rening av HSCs (CD34− och CD34+), multipotenta progenitorceller (MPPS), lin− samt lin+ celler, respektive 21. Den gating strategin för att isolera dessa fraktioner visas i figur 2.
Efter identifiering av populationer av intresse bedömdes TMRM-intensitet, som bör visas som en ljussignal. TMRM-färgning i serumfritt expansions medium (SFEM) rekommenderas starkt, eftersom TMRM-profiler i HSPCs kan genomgå förändring när färgning utförs i PBS + 2% FBS (figur 3a).
Diagram 3c visar den genomsnittliga intensiteten för varje population, som normaliseras av INTENSITETEN hos BM-mncs. hscs uttrycker höga aktivitetsnivåer av xenobiotiska effluxpumpar som kan EXTRUDERA tmrm Dye20, och vi hittade tmrm profiler i hspcs har ändrats i närvaro av verapamil (figur 3b, C). Liknande resultat erhölls genom andra hämmare såsom cyklosporin H (figur 3c). Således kan den exakta mängden TMRM som lastas i mitokonbruen av ΔΨm mätas efter hämning av effluxpumparna av verapamil eller cyklosporin H (figur 3c).
Slutligen kan FCCP användas för att kontrollera noggrannheten hos TMRM-färgning. FCCP depolariserar mitokonsamen, vilket resulterar i en minskning av TMRM-intensitet (figur 3D). Denna metod kan också användas för att bestämma bakgrundsintensitet av färgning och/eller som en negativ kontroll.
Bild 1: protokoll flödesschema. Grafisk Sammanfattning av förfarandet för att isolera och fläcka BM-MNCs att bestämma ΔΨm. Kritiska steg markeras med bild inlägg (a-D). Femurer och förbenade från vuxna C57BL/6 möss isolerades och deras ändar avlägsnas (a). Långa ben som i A efter spola ut (B). Isolerade BM-MNCs före (C) och efter (D) ack Lys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: inställning av gating. Schematisk representation av gating strategi för att identifiera de olika hematopoietiska populationer, inklusive CD34−-HSC och CD34+-HSC, MPP, lin− och lin+ celler. Panelerna ändrades från Bonora, M. et al.11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flödescytometri analys av mitokondriell membran potential. (A) representativ fördelning av ΔΨm i hscs som färgas med TMRM i PBS + 2% FBS (grön) eller i serumfritt expansions medium (sfem) (röd). (B, C) Representativ fördelning av ΔΨm i CD34−-HSC och lin− celler (B) och kvantifiering av ΔΨm i CD34−-HSC, CD34+-HSC, MPP, lin− och lin+ celler (C) färgade med tmrm i närvaro eller avsaknad av effluxpumphämmare. TMRM-intensiteten hos varje population normaliserades av TMRM-intensiteten hos egna BM-MNCs (modifierad från Bonora, M. et al.11). D) representativt histogram över TMRM-intensitetsfördelningen i hscs före (rosa) och efter (ljusblå) fccp-tillägg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriell membran potentiell mätning är en hörnsten i analys och bedömning av mitokona, som är kritiska till det metabola tillståndet i cellen. Här beskriver vi ett protokoll för analys av ΔΨm av TMRM färgning. Tmrm är en cell-permenade fluorescerande färgämne som ackumuleras i aktiva mitokondrier på grund av ΔΨm, och dess respektive nivåer kvar i jämvikt mellan den extracellulära, cytoplasmiska och mitokondriell fack10. Detta protokoll kan anpassas för olika färgämnen, inklusive tetramethylrhodamine, etylester (TMRE) och JC-1. Lämpliga infärgnings förhållanden är avgörande för att uppnå korrekta resultat. Dessa inkluderar: skydd mot ljus exponering, korrekt inkubationstid, underhåll av konstant temperatur (37 ° c) och extracellulär koncentration. När TMRM-färgnivåerna ännu inte nått perfekt jämvikt kan oväntade förändringar i färgintensiteten upptäckas vid datainhämtning i flödescytometriprocessen. Därför är den rekommenderade färg perioden för TMRM 1 h i stället för 30 min (som nämns i ett TMRM-tillverkarprotokoll). Det föreslås också att provet skall förvärvas minst två gånger inom 5-min för att jämföra stabiliteten i färgämnet.
Ett annat kritiskt steg i protokollet är inrättandet av en effektiv färgmatchning mellan antikroppar och färgämne. Hematopoietiska populationer kan upptäckas genom flödescytometri med hjälp av väletablerade ytmarkörer21. Den gating strategi som beskrivs här (figur 2) är kompatibel med TMRM färgning, och möjliggör mätning av dess intensitet vid olika differentiering stadier samtidigt. TMRM matchar PE-kanalen, men intensiteten är oftast mycket svagare än för antikroppar som konjugeras med PE (data visas inte). Eftersom detta kan påverka färg kompensationen och orsaka oväntade förskjutningar i vissa populationers spektra, bör provet med TMRM-färgning användas som kompensations kontroll för PE-kanalen.
Den stora fördelen med det nuvarande protokollet är att det möjliggör avlägsnande av effekten av xenobiotiska effluxpumpar, vars effektiva extrudering av TMRM färgämnen ändrar både dess jämvikt över plasmamembranet och dess mitokondriell ackumulering. Detta är ett kritiskt steg i den noggranna utvärderingen av HSC-mitokondriell funktion genom att färga absorption. Som hscs Express mer aktiva effluxpumpar än engagerade celler19, verapamil eller liknande läkemedel, såsom cyklosporin H, en ca2 +-oberoende Multidrug resistens hämmare22 (figur 3b-C), bör användas i infärgnings proceduren för HSCs för att noggrannare bedöma nivåer av mitokondriell aktivitet. Eftersom denna kritiska fråga påpekades endast nyligen11,19 och fortfarande diskuteras23, är huvudsyftet med detta betänkande att tillhandahålla ett enkelt och detaljerat protokoll som kommer att bidra till att standardisera förfarandet för erhålla reproducerbara data och reducera de uppenbara avvikelserna mellan resultaten från olika forskargrupper. Protokollet här beskrivs visar i detalj varje steg, inklusive doser, timing och specifika medier. TMRM-profiler i HSPCs kan till exempel variera beroende på deras medium (figur 3a). En detaljerad analys av de inblandade mekanismerna kommer att kräva ytterligare prospektering, men eftersom serumfritt expansions medium (SFEM) är en väletablerad metod för HSC-kulturen rekommenderas SFEM i stället för PBS starkt när man utför TMRM-färgning för HSCs. Vidare belyser den noggranna bedömningen av potentialen för mitokondriell membran här genom hämning av effluxpumparna möjliga framtida tillämpningar av verapamil, liksom andra färgämnen (t. ex. MitoTracker, MitoSOX), vid undersökning av HSCs.
Viktigt är att TMRM-intensitet som visas av flödescytometri inte exakt återspeglar mitokondriell volym. Flödescytometri mäter den totala fluorescensintensiteten per cell, men distributionen av mitokondriella färgämnen till mitokondrier beror på ΔΨm. Det är därför svårt att urskilja om det kritiska bidraget till en TMRM-avläsning härstammar från ΔΨm eller mitokondriell volym11. Vi har bekräftat att MTO, en av de färgämnen som oftast används för att mäta mitokondriell massa, påverkas av både ΔΨm och efflux pump aktivitet. Vi har också observerat att verapamil ändrar intensitetsprofilen för MTO i HSPC-populationer, men har inte funnit något samband mellan MTO-intensitet och mitokondriell volym11. Kombinerad mätning av mitokondriell volym och ΔΨm bör användas för att normalisera data och eliminera effekterna av membranpotential, och ytterligare utforskning av mitokondriellt innehåll bör utföras med hjälp av ΔΨm oberoende tekniker.
Sådana tekniker skulle omfatta 3D-volymanalys baserad på fluorescerande markörer (t. ex. immunofärgning av mitokondriella proteiner), elektronmikroskopi11och kvantifiering av mitokondriella/nukleära DNA-nyckeltal. Användning av mitokondriella färgämnen (dvs TMRM) i kombination med effluxsystem-hämmare kommer utan tvekan att visa sig vara till stor nytta för att klarlägga mitokondriell biologi genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar alla medlemmar i Ito laboratorium, särskilt K Ito och H Sato, och Einstein Stem cell Institute for kommentarer och Einstein Flow Cytometry och analytiska Imaging Core faciliteter (finansierat av National Cancer Institute Grant P30 CA013330) för hjälp med att genomföra experimenten. K.I. stöds av bidrag från National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 och R01DK100689) och New York State Department of Health som Core Director för Einstein Single-cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito är en forsknings forskare i leukemi och lymfom samhället.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al.
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
