Summary
משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.
Abstract
כמו חילוף החומרים הסלולר הוא וסת המפתח של תא גזע המטבית (HSC) התחדשות עצמית, התפקידים השונים שיחק על ידי המיטואיטין הומאוסטזיס ההטיות כבר נחקרו בהרחבה על ידי חוקרים HSC. רמות פעילות מיטוכונדריאלי משתקפות בפוטנציאל הממברנה שלהם (ΔΨm), שניתן למדוד אותם על-ידי שלבים העלולים להיות מיועדים לצבעים כגון TMRM (טטרמתיל, מתיל אסתר). היכולת של משאבות אפלוקס להבלטת צבעים אלה מתאים יכולים להגביל את התועלת שלהם, עם זאת. הטיית המדידה המתקבלת היא קריטית במיוחד בעת הערכת HSCs, כשטרנספורטי מובילים מציגים רמות גבוהות יותר של ביטוי ופעילות ב-HSCs מאשר בתאים המובחנים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניצול Verapamil, מעכב משאבת משאבה, כדי למדוד במדויק ΔΨm על פני אוכלוסיות מרובות מח עצם. העיכוב כתוצאה של פעילות המשאבה מוצג כדי להגביר את עוצמת TMRM בתוך המטפאות גזע ומחולל קדמון (HSPCs), תוך השארת אותו ללא שינוי יחסית בשברים בוגרים. פעולה זו מדגישה את תשומת הלב הקרובה לפעילות צבען-אפלוקס הדרושה כאשר משתמשים בצבעים תלויי-ΔΨm, וכמו שכתוב ודמיינו, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות בין אוכלוסיות שונות בתוך מח העצם, או באותה אוכלוסייה על-פני דגמים ניסיוניים שונים.
Introduction
תאי גזע המטפאות (HSCs) מחדשים את עצמם, רב-עוצמה, ומסוגלים להצמיח את כל תאי הדם1,2. מטבוליזם הסלולר הוא וסת מפתח של תחזוקה hsc, יחד עם גורמים transcript, אותות פנימיים ומיקרואקולוגיה3,4,5. השליטה הנכונה של תפקוד מיטוכונדריאלי ואיכות הוא אפוא קריטי לתחזוקת hsc6,7.
פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) הוא פרמטר מפתח להערכת המיטו, כפי שהוא משקף ישירות את הפונקציונליות שלהם, אשר נובעת משיווי משקל של פעילות שאיבה פרוטון בשרשרת התחבורה אלקטרון וזרימת פרוטון דרך F 1/FO ATP סטנדרטים. אלה הן נדרשות (בהתאם לביטוי הגנים וזמינות המצע) עבור זירחון תלוי-החמצן של ADP ל-ATP8,9. לנצל את אלקטרושליליות של תא מיטוכונדריאלי, צבעים שונים בפוטנציאל פותחו כדי למדוד ΔΨm. אחד מהם הוא טטרמתיל מתיל (TMRM), אשר שימש בהרחבה כדי למדוד ΔΨm על ידי זרימה cy, לנסות במגוון של תאים10, כולל גזע המטפאות ובתאי מחולל11.
צבעים מיטוכונדריאלי חייב להיות בשימוש עם כמה זהירות ב HSCs, עם זאת, מכיוון הפעילות הגבוהה של משאבות xenobiotic יוטי של תאים אלה יכול לגרום לצבוע שחול12. אכן, שחול של צבעים מיטוכונדריאלי כגון Rhodamine 123 התיר לחוקרים לבודד HSCs13 או לזהות hsc "אוכלוסיות צד" על ידי ניצול ההבלטה הדיפרנציאלי של הצבעים כחול הכחול האדום14, 15. כמו כן הוכח כי הג ג'ין, חוסם מסוים של ה-ATP-משפחה של הקלטת משנה G-חבר 2 (ABCG2) טרנספורטר, אינו משפיע על דפוס הצביעת של MitoTracker ב HSPCs16. לאחר פרסום של תוצאות אלה, מחקרים מרובים בוצעו באמצעות צבעים מיטוכונדריאלי בהעדר מעכבי משאבת xenobiotic יוטי, המוביל הרושם הנרחב כי HSCs יש רק מספר קטן של המיטולוגיה עם נמוך ΔΨm16 , מיכל בן 17 , . שמונה עשרה
לאחרונה, זה הוכח, עם זאת, כי Verapamil, מעכב ספקטרום רחב של משאבות אפלוקס, משנה באופן משמעותי את דפוס הצביעת של מיטוכונדריאל מימעקב ירוק19. פער זה סביר בגלל העובדה כי FumitAbcg2 ג ' ין הוא סלקטיבי מאוד עבור, בעוד HSCs גם לבטא מובילים אחרים כגון Abcb1a (אשר רק רגיש חלש כדי Fumit, ג'ין ג)19. אנו דיווחו גם כי צבעים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון TMRM, Nonyl כתומה כתום, ו Mitotracker אורנג ' (MTO) התערוכה דפוסים כמו מיטומו גרין. חשוב מכך, הבחנו בכך שדפוסי הזרימה של HSPCs משקפים את ΔΨm בנוסף למסה מיטוכונדריאלי11.
צריכת הצבע TMRM תלוי בקפדנות על המטען השלילי של המיטומטר, אבל הצטברות של צבע כתוצאה מכך הוא באיזון תמידי בין צריכת והסיווג שלה על ידי משאבות אפלוקס20. ההבדל בביטוי xenobiotic יוטי משאבת בין HSCs ואוכלוסיות תאים בוגרים משפיע על איזון זה יכול להוביל לתוצאות מוטה. השימוש של מעכבי ייעודי כגון Verapamil צריך להיחשב ניתוח של ΔΨm על ידי צבעים בעלי פוטנציאל ממטרי. כאן אנו מתארים פרוטוקול שונה עבור מדידה ΔΨm מדויקת על ידי מבוססי TMRM הזרימה cy try אשר מתקן עבור פעילות השיגור xenobiotic יוטי באמצעות מעכבי ייעודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה.
1. הכנת פתרונות
- צביעת מאגר (מלוחים באגירה פוספט (PBS) + 2% סרום של שור עוברי (FBS)): להוסיף 10 מ ל של FBS 500 mL של פתרון PBS סטרילי.
הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c למשך חודש אחד לפחות במצב סטרילי. לפני תחילת ההליכים הבאים, לשים סדרת מחלקים של הפתרון הזה (50 mL) על קרח. - ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) לישיר מאגר: מניחים מאגר של ACK ליסינג (1 מ ל) על הקרח לפני תחילת ההליך.
הערה: כדי להכין את אותו מאגר לא מסחרי, לפזר 8.02 g של NH4Cl, 1 גרם של khco3 ו 37.2 mg של Na2Edta ב 1 L של H2O. כוונן את ה-pH ל 7.2-7.4. חנות עד 6 חודשים בטמפרטורת החדר. - תרבות בינונית: להוסיף 50 ng/mL מארז הגזע (SCF) ו 50 ng/mL הטרובפיאה (TPO) למדיום ללא סרום לתרבות והתרחבות של התאים המטבטיים (ראה טבלת חומר עבור מסחרי בינוני מומלץ).
- פתרון מניות TMRM: להכין את TMRM (1 μM) פתרון על ידי המסת 5 μg של אבקת TMRM ב 10 מ ל של אתנול. אחסן פתרון זה ב-20 ° c מוגן מפני האור.
- פתרון מלאי verapamil: להכין Verapamil (50 מ"מ) פתרון על ידי דילול 24 מ ג של Verapamil ב 1 מ ל אתנול. אחסן פתרון זה ב-20 ° c.
- הפתרון של מניות FCCP: להכין קרבונאנציאניד p-triflouromeהידרצילההידרטזון (FCCP) (1 M) פתרון על ידי המסת 254 mg ב 1 מ ל אתנול. אחסן פתרון זה ב-20 ° c מוגן מפני האור.
2. מח עצם בידוד
- המתת חסד העכבר על ידי CO2 אינהלציה בעקבות ההנחיות המוסדיים ולרסס את העכברים עם 70% אתנול.
הערה: שלב זה מונע זיהום של תאי העניין מבלי להתפשר על תוצאות נסיוניות. - באמצעות זוג מלקחיים ומספריים חדים, לבצע חיתוך קטן בעור הגחוני של העכבר ולמתוח את העור.
- לחלץ את עצם הירך ואת השוקה בזמן שאתה מטפל לא לעקור את ראשי הירך כפי שהם מכילים כמות גדולה של תאים מח עצם. מניחים את העצמות שהוסרו בצלחת 6-היטב מלא 1.5 mL של מאגר הצביעת.
הערה: הליך זה אינו דורש אזור סטרילי. - להסיר את השרירים מן העצמות לחתוך את קצות העצמות המאפשר את היציאה של מח העצם (איור 1A). מניחים את העצמות הנקיות בבארות חדשות עם 1.5 mL של מאגר הצביעת.
הערה: השרירים ורקמות אחרות יש להסיר בזהירות כדי למנוע סתימת מזרק בשלב הבא. - לרוקן את מח העצם באמצעות מזרק 3 מ ל עם מחט של 25 גרם.
הערה: המשך לשטוף את מח העצם עד העצם הופך לבן (איור 1B). - לאסוף את כל התאים בצינור 1.5 mL, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 180 x g ואז לבטל את supernatant (איור 1c).
- להשעות מחדש את הגלולה ב 300 μL של קרח קר ACK ליטל מאגר מאוד בזהירות, לשים על קרח 1 דקות ומיד הליזה לא פעילה על ידי הוספת 1 מ ל של מאגר הצביעת. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 180 x g.
הערה: גלולה התאים מופיע לבן (איור 1D). המספר הכולל של תאים מבודדים הוא כ 2-4 x 107. - השהה מחדש את כדורי ב 1 מ ל של מאגר הצביעת והמסנן באמצעות כובע תא מסננת (12 x 75 מ"מ2, 5 מ ל קיבולת) עם רשת הניילון 35 יקרומטר משולב כדי להשיג תאים mon, ברורים. לאחר חסימת, לשמור את הדגימה על קרח.
3. חיסוני זיהוי של HSC
- הכנת קוקטייל שושלת יוחסין (Lin). ב 400 μL של מאגר כתמים, להוסיף 4 μL של נוגדנים biotinilated הבאים נגד CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk 1.1, IgM ו-Il7Ra כדי להשיג דילול סופי 1:100.
- להכין fluorophores מצופף-נוגדנים (Abs). ב 400 μL של מאגר כתמים, להוסיף 4 μL של Abs הבא כדי לקבל דילול סופי 1:100. Streptavidin-פסיפיק כחול, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 ו-CD34-FITC. . לשמור על קרח, מוגן מפני אור
- צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 180 x g, ואז למחוק את supernatant.
- הוסף 400 μL של תמיסת הקוקטייל לין לגלולה התאים. הוסף 4 μL של CD135-biotinilated Ab. מערבולת במהירות כדי לערבב ו דגירה עבור 30 דקות בקרח.
- לשטוף את המדגם הוספת 3 מ ל של מאגר כתמים, ספין למטה עבור 5 דקות ב 180 x g ולהיפטר supernatant.
- הוסף 400 μL של פתרון Abs. וורטקס במהירות כדי לערבב ו להדגירה עבור 30 דקות על הקרח.
- לשטוף את הדגימות עם 3 מ ל של מאגר הצביעת, ספין למטה עבור 5 דקות ב 180 x g ולהיפטר supernatant.
4. מכתים TMRM
- הכן פתרון לצביעת TMRM. הוסף 2.2 μL של פתרון מניות TMRM ו 1.1 μL של Verapamil (2 ננומטר ו 50 μM כריכוז סופי, בהתאמה) ב 1.1 mL של בינונית ללא סרום עבור תרבות והתרחבות של תאים המטדותיים (ראה טבלת חומר עבור בינוני מסחרי מומלץ) עם tmrm ו-SCF.
הערה: . זה הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול בנוסף verapamil הכרחי כדי לחסום את משאבות אפלוקס אשר מבוטא במידה רבה ב-HSCs והוא יכול הבלטת TMRM. - להשעות מחדש את מח העצם ב 1 מ ל של פתרון TMRM צביעת, מערבולת במהירות ו-דגירה של 1 h ב 37 ° c.
הערה: אין לשטוף כתמים של TMRM. בקרת פיצוי מסור PE מושעית גם ב-100 μL של פתרון TMRM הצביעת, והוא נתון לדגירה של 1 h ב 37 ° צ' לאחר מערבולת מהירה. - לסנן את המדגם באמצעות כובע תא מסננת (12 x 75 מ"מ2, 5 מ ל קיבולת) עם רשת משולבת 35 יקרומטר ניילון משולבים כדי למנוע סתימת של cytometer הזרימה.
הערה: צביעת TMRM מגדילה את האפשרות להדביק את המבנה במדגם. סינון המדגם ממש לפני הזרמת מאמר מומלץ. - להוסיף 1 μL של 4, 6-diamidino-2-פנייילינדול (DAPI) כדי לא לכלול תאים מתים על ידי הזרמת cy, לנסות.
5. רכישה באמצעות ממיר זרימה
- להריץ דגימת מח עצם ולרכוש לפחות 1 x 10 שישה אירועים.
-
הגדר את אסטרטגיית האיסוף כדי לזהות את האוכלוסיות המטפאות השונות (איור 2).
- להציג מח עצם חי מונו-תאים גרעיניים (BM-MNCs), dapi-שבר, בעלילה עבור האוקיינוס השקט הפסיפי כדי לזהות CD135-lin-(לין-י) ו-lin+ שברים.
- מגרש לין-שבר עבור APC/Cy7 (c-kit) לעומת PE/Cy7 (סקה -1) כדי לזהות השבר ושלתי רב עוצמה (MPP), כמו c-kit+ ו-סקה -1+.
- מגרש MPP שבר עבור APC (CD48) לעומת PerCP/Cy 5.5 (CD150) כדי לזהות שבר HSC, כמו CD150+ ו CD48-.
- הצגת שבר HSC עבור FITC (CD34) לחלקCD34-hsc ו CD34+-hsc.
- השג את עוצמת TMRM (ערוץ PE) בכל אוכלוסיה.
- לאחר הרכישה, להוסיף למדגם 1 μL של FCCP כדי לקבל את הריכוז הסופי של 1 מ"מ ו-דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות, לאחר מכן לרכוש 1 x 106 אירועים.
הערה: FCCP הוא מצמד מיטוכונדריאלי אשר משמש להפיג את ΔΨm. הוא משמש כפקד ניסיוני כדי לוודא שצביעת TMRM פועלת כהלכה. לאחר הממשל של FCCP ס, עוצמת TMRM צריכה להיות מצומצמת באופן דרסטי (איור 3A). - ניתוח נתונים מנרמל את העוצמה הממוצעת של PE של כל אוכלוסייה בעוצמת PE של כל מוניטור-MNCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר בידוד קל של BM-MNCs ממודל העכבר. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול: בידוד עצם, הריקון מתוך מח העצם, לפירוק תא דם אדום, וכתמים נוגדן ואחריו tmrm כתמים כדי למדוד פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי באוכלוסיה מסוימת המטתית .
BM-MNCs מכילים מספר אוכלוסיות תאים, כולל HSCs. קוקטבי הנוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה מבוססים היטב בטיהור של HSCs ( CD34-CD34+), תאים רב-עוצמה (Mpps), לין -כמו גם לין+ תאים, בהתאמה 21. אסטרטגיית העליה לבידוד שברים אלה מוצגת באיור 2.
לאחר זיהוי אוכלוסיות מעניינות, עוצמת TMRM, שאמורה להופיע כאות בהיר, היתה מוערך. מומלץ מאוד להכתים את TMRM באמצעי הרחבה ללא סרום (SFEM), כמו פרופילי TMRM ב-HSPCs יכולים לעבור שינוי כאשר הצביעת מבוצעת ב-PBS + 2% FBS (איור 3A).
איור 3C מציג את העוצמה הממוצעת של כל אוכלוסייה, אשר מנורמל על-ידי העוצמה של BM-MNCs. HSCs express רמות פעילות גבוהות של משאבות xenobiotic יוטי מסוגל הבלטת ממד tmrm צבע20, ואכן, מצאנו פרופילי Tmrm ב hspcs שונו בנוכחות Verapamil (איור 3B, C). תוצאות דומות הושגו על ידי מעכבי אחרים כגון ציקלוספורין H (איור 3C). כך, את הכמות המדויקת של TMRM נטען המיטו, ידי ΔΨm ניתן למדוד לאחר עיכוב של משאבות האפלוקס על ידי Verapamil או ציקלוספורין H (איור 3C).
לבסוף, ניתן להשתמש ב-FCCP כדי לאמת את הדיוק של צביעת TMRM. FCCP המק ס מפרה את המיטוגרמה, והתוצאה היא ירידה בעוצמת TMRM (איור 3D). גישה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את עוצמת הרקע של ההכתמים ו/או כפקד שלילי.
איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול. סיכום גרפי של ההליך כדי לבודד ולהכתים BM-MNCs כדי לקבוע ΔΨm. שלבים קריטיים מסומנים באמצעות מוסיף תמונה (A-D). Femurs והטייה ממבוגר C57BL/6 עכברים היו מבודדים והקצוות שלהם יוסרו (א). עצמות ארוכות כמו לאחר ריקון (ב). בודד מוניטור-MNCs לפני (ג) ואחרי (ד) ACK הליזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת התקנה. ייצוג סכמטי של אסטרטגיית האתר לזיהוי אוכלוסיות המטפאות השונות, כולל CD34-hsc ו-CD34+-HSC, MPP , לין-ו-לין+ תאים. הלוחות שונו מבונה, M. ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרמת cy, ניתוח של פוטנציאל הממברנה היטוכונדריאלי. (א) התפלגות נציג של ΔΨm ב HSCs מוכתם עם tmrm ב-PBS + 2% fbs (ירוק) או בינונית הרחבה ללא סרום (sfem) (אדום). (ב, ג) התפלגות מייצגת של ΔΨmב-CD34-hsc ו-Lin-תאים (ב) וכימות שלΔΨm בCD34-HSC, CD34+-hsc, MPP , לין-ו-לין+ תאים (C) ויטראז בנוכחות או העדר מעכבי משאבה של משאבות. עוצמת TMRM של כל אוכלוסייה הייתה מנורמלת על-ידי עוצמת ה-TMRM של מוניטור-MNCs משלו (השתנה מבונה, M. et al.11). (ד) היסטוגרמה של התפלגות העוצמה Tmrm בHSCs לפני (ורוד) ולאחר (כחול בהיר) בתוספת fccp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המדידה הפוטנציאלית של קרום מיטוכונדריאלי היא אבן פינה של ניתוח והערכה של המיטו, אשר הם קריטיים למצב המטבולית של התא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח של ΔΨm על ידי כתמים TMRM. TMRM הוא צבע הניאון האמור לצבוע אשר מצטבר פעיל המיטומטר בשל ΔΨm, ואת הרמות המתאימות שלה להישאר בשיווי משקל בין מסחטות, cytoplasmic ומיטוכונדריאלי10. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור צבעים שונים, כולל טטרמתיל, אתיל אסתר (TMRE) ו JC-1. תנאי הצביעת המתאימים הם קריטיים להשגת תוצאות מדויקות. אלה כוללים: הגנה מפני חשיפה לאור, זמן דגירה נכונה, תחזוקה של טמפרטורה קבועה (37 ° c) וריכוז מסחטות. כאשר רמות ה-TMRM עדיין לא הגיעו לשיווי משקל מושלם, ניתן לזהות שינויים לא צפויים בעוצמת הצביעה במהלך רכישת נתונים בתהליך הזרימה של cy, try. לכן תקופת הצביעה המומלצת עבור TMRM היא 1 h במקום 30 דקות (כפי שהוזכר בפרוטוקול של יצרן TMRM אחד). הוא גם הציע כי המדגם יש לרכוש לפחות פעמיים בתוך 5 דקות על מנת להשוות את יציבות הצבע.
שלב קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא ההגדרה של התאמת צבע יעילה בין נוגדנים וצבען. אוכלוסיות המטפאות ניתן להבחין על ידי הזרימה cy, לנסות באמצעות סמני שטח מבוססים היטב21. אסטרטגיית הסיכום המתוארת כאן (איור 2) תואמת לצביעת tmrm, ומאפשרת למדידת עוצמתה בשלבי בידול שונים בו. TMRM מתאים לערוץ PE, אבל האינטנסיביות שלה הוא בדרך כלל הרבה יותר חלש מזה של נוגדנים מצועם PE (נתונים לא מוצגים). מאחר שפעולה זו עשויה להשפיע על פיצוי צבע, גרימת שינויים בלתי צפויים בספקטרום של אוכלוסיות מסוימות, יש להשתמש במדגם באמצעות צביעת TMRM כפקד פיצוי עבור ערוץ PE.
היתרון העיקרי של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא מאפשר הסרה של ההשפעה של משאבות ביוביוטיקה, אשר שחול יעיל של הצבע TMRM משנה הן את שיווי השיווי משקל על הקרום פלזמה הצטברות מיטוכונדריאלי. זהו צעד קריטי בהערכה מדויקת של תפקוד מיטוכונדריאלי HSC על ידי הספיגה צבע. כמו HSCs express יותר משאבות הפעיל יותר מאשר תאים מחויבים19, verapamil או תרופות דומות, כגון cyclosporine H, Ca2 +-עצמאי מעכב התנגדות multidrug22 (איור 3b-C), יש להשתמש ב צביעת הליך HSCs כדי להעריך במדויק יותר רמות של פעילות מיטוכונדריאלי. בגלל שהנושא הקריטי הזה הצביע רק לאחרונה11,19 והוא עדיין תחת דיון23, המטרה העיקרית של דו ח זה היא לספק פרוטוקול קל ומפורט אשר יסייע לתקנן את ההליך עבור קבלת נתונים מתוכונים והפחתת הסתירות הניכרות בין התוצאות של קבוצות מחקר שונות. הפרוטוקול המתואר כאן מציג בפרוטרוט כל שלב, כולל מנות, תזמון ומדיה ספציפית. לדוגמה, פרופילי TMRM ב-HSPCs יכולים להשתנות בהתאם למדיום שלהם (איור 3A). ניתוח מפורט של המנגנונים המעורבים ידרוש חקירה נוספת, אך מאז הרחבת הסרום ללא הרחבה (SFEM) היא שיטה מבוססת היטב עבור תרבות HSC, SFEM ולא PBS מומלץ מאוד בעת ביצוע כתמים TMRM עבור HSCs. עוד, הערכה מדויקת של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי הפגינו כאן באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס מדגיש יישומים עתידיים אפשרית של Verapamil, כמו גם צבעים אחרים (למשל, MitoTracker, Mitotracker), בחקירת HSCs.
וחשוב מכך, עוצמת TMRM כפי שניתן לראות באמצעות הזרימה cy, לא עשויה לשקף במדויק נפח מיטוכונדריאלי. הזרימה cy, לנסות מדדים כולל עוצמה פלואורסצנטית לכל תא, אבל התפלגות של צבעים מיטוכונדריאלי למיטומטר תלוי ΔΨm. לכן קשה להבחין אם התרומה הקריטית לקריאת TMRM נובעת מ-ΔΨm או כאמצעי אחסון מיטוכונדריאלי11. יש לנו אישר כי MTO, אחד הצבעים המשמשים לעתים קרובות למדוד מסה מיטוכונדריאלי, מושפע הן ΔΨm ו משאבה משאבת פעילות. יש לנו גם ציין כי Verapamil משנה את פרופיל האינטנסיביות של MTO באוכלוסיות HSPC, אבל לא מצאו מתאם בין עוצמת MTO ואמצעי אחסון מיטוכונדריאלי11. מדידה משולבת של אמצעי אחסון מיטוכונדריאלי ו ΔΨm צריך לשמש כדי לנרמל את הנתונים ולסלק את ההשפעות של פוטנציאל הממברנה, וחקר נוסף של תוכן מיטוכונדריאלי צריך להתבצע באמצעות שיטות ΔΨm עצמאיות.
טכניקות כאלה יכלול ניתוח בנפח תלת-ממד מבוסס על סמני פלורסנט (למשל, חיסוני של חלבונים מיטוכונדריאלי), מיקרוסקופ אלקטרונים11, ו כימות של יחסי DNA מיטוכונדריאלי/גרעיני. השימוש בצבעים מיטוכונדריאלי (כלומר TMRM) בשילוב עם מעכבי מערכת של המערכת יהיה ללא ספק להוכיח תועלת רבה בהתבהרות של ביולוגיה מיטוכונדריאלי דרך הזרימה cy, try.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לכל חברי המעבדה איטו, במיוחד K Ito ו-H סאטו, ו איינשטיין תא גזע המכון להערות הארגון איינשטיין Cy, הדמיה אנליטית מתקנים ליבה (ממומן על ידי המכון הלאומי לסרטן גרנט P30 CA013330) עבור סייע בביצוע הניסויים. K.I. נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK98263, R01DK115577, ו R01DK100689) ואת משרד ניו יורק המדינה לבריאות כמו מנהל ליבה של איינשטיין תא בודד גנומיקה/אפיגנומיקה (C029154). K.I. Ito הוא מלומד מחקר של החברה לוקמיה ולימפומה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al.
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
