Summary
Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Hücresel metabolizma hematopoetik kök hücre (HSC) Self-yenileme, hematopoetik homeostaz mitokondri tarafından oynanan çeşitli roller önemli bir düzenleyici olduğu gibi kapsamlı HSC araştırmacılar tarafından incelendi. Mitokondriyal aktivite seviyeleri, TMRM (tetrametilrhodamin, metil ester) gibi hücre-perdemek kyonik boyalar ile ölçülecek olan membran potansiyelleri (Δkr m) ile yansıtılır. Bu boyalar hücrelerden ekstrüze etmek için "effluks" pompaları yeteneği, ancak kullanışlılığı sınırlandırabilirsiniz. Ksenobotik taşıyıcılar, HSCs 'de farklılaşmış hücrelerden daha yüksek ifade ve etkinlik sergileyen, HSCs 'yi değerlendirirken elde edilen ölçüm önyargı özellikle önemlidir. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü olan verapamil 'i kullanarak, birden fazla kemik iliği nüfusu arasında δkr m 'i doğru şekilde ölçmek için bir protokol açıklanmaktadır. Pompa aktivitesinin ortaya çıkan inhibisyonu, hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde TMRM yoğunluğunu artırmak için gösterilir (hspcs), Olgun fraksiyonları nispeten değişmeden bırakarak iken. Bu, Δkr m 'ye bağımlı boyalar kullanıldığında ve yazılmış ve görselleştirildiğinde gerekli olan boya-efflux aktivitesine yakın ilgi vurgulamaktadır, bu protokol kemik iliği içindeki farklı nüfus ya da aynı nüfus içinde doğru karşılaştırmak için kullanılabilir farklı deneysel modeller arasında.
Introduction
Hematopoetik kök hücreler (HSCs) kendi kendini yenileyen, çok güçlü ve kan1,2tüm hücrelere artış veren yeteneğine sahiptir. Hücresel metabolizma HSC bakım, transkripsiyon faktörleri, içsel sinyaller ve mikroçevre3,4,5ile birlikte önemli bir düzenleyici olduğunu. Mitokondriyal fonksiyon ve kalitenin uygun kontrolü bu nedenle HSC bakım6,7için önemlidir.
Mitokondriyal membran potansiyeli (Δkr m), doğrudan işlevselliğini yansıtan mitokondri değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da elektron taşıma zincirindeki proton pompalama aktivitesinin dengesinden ve F üzerinden proton akışına göre türemiştir. 1/FO ATP synthase. Bu her ikisi de (gen ifadesi ve substrat kullanılabilirliği bağlı olarak) ADP, ATP için oksijen bağımlı fosforilasyon için8,9gereklidir. Mitokondriyal bölmesinin elektronik aletinden faydalanabilmek için Δkr m 'i ölçmek üzere çeşitli Potansiyometrik boyalar geliştirilmiştir. Bunlardan biri tetrametylrhodamine metil ester perklorat (TMRM), hangi yaygın hücreler çeşitli akış sitometri tarafından δkr m ölçmek için kullanılan10, hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil11.
Ancak, bu hücrelerin ksenobiyotik "effluks" pompaları yüksek aktivite boya ekstrüzyon12neden olabilir çünkü mitokondriyal boyalar, HSCs bazı dikkatli kullanılması gerekir. Nitekim, Rhodamine 123 gibi mitokondriyal boyaların ekstrüzyon araştırmacılar HSCs izole etmek için izin verdi13 veya HSC tanımlamak "yan nüfus" boya Hoechst mavi ve Hoechst kırmızı14diferansiyel ekstrüzyon sömürüyor tarafından, 15. aynı zamanda bu Fumitremorgin C, ATP-bağlayıcı kaset alt aile G üyesi 2 (ABCG2) taşıyıcı, belirli bir engelleyici, HSPCs16mitotracker boyama deseni etkilemez gösterildi. Bu sonuçların yayınlanması sonrasında, ksenobiyotik "effluks" pompa inhibitörlerinin yokluğunda mitokondrial boyalar kullanılarak birden fazla çalışma gerçekleştirildi, HSCs 'nin düşük δkr m16 ile sadece az sayıda mitokondri sahip olduğu yaygın izlenimi taşımaktadır. , 17 , 18 yaşınakadar.
Son zamanlarda, ancak, bu verapamil, "effluks" pompaları geniş bir spektrum inhibitörü, önemli ölçüde mitokondriyal boya mitotracker yeşil19boyama deseni değiştirir gösterildi. Bu tutarsızlık muhtemelen Fumitremorgin C 'nin Abcg2 için son derece seçici olması nedeniyle, HSCs Ayrıca Abcb1a gibi diğer taşıyıcıları da ifade ederken (sadece Fumitremorgin C 'ye zayıf hassastır)19. Ayrıca, TMRM, nonyl akridin Orange ve mitotracker Orange (MTO) gibi diğer mitokondrial boyaların mitotracker Green ile aynı desenleri sergilediğine dair rapor verdik. Daha da önemlisi, HSPCs 'in akış cytometrik desenlerinin, mitokondriyal kütle11' e ek olarak Δkr m 'lerini yansıttığını gözlemledik.
TMRM boya alımı kesinlikle mitokondri negatif şarj bağlıdır, ancak boya elde edilen birikim, alımı ve boşluğu arasında sürekli bir denge ile "effluks" pompalar20. HSCs ve olgun hücre nüfusu arasındaki ksenobiyotik "effluks" pompa ifadesinde fark bu dengeyi etkiler ve önyargılı sonuçlara yol açabilir. Verapamil gibi özel inhibitörlerinin kullanımı, Potansiyometrik boyalar ile Δkr m analizinde düşünülebilir. Burada, özel inhibitörler kullanılarak ksenobiyotik ışınlama aktivitesini düzeltir olan TMRM tabanlı Akış sitometrisi ile doğru δkr m ölçümü için değiştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Albert Einstein Tıp Koleji 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1. çözümlerin hazırlanması
- Boyama tampon (fosfat-tamponlu tuz (PBS) + 2% fetal sığır serumu (FBS)): steril PBS çözeltisi 500 mL 'de 10 mL FBS ekleyin.
Not: Bu çözüm, steril durumda en az bir ay boyunca 4 °C ' de depolanabilir. Aşağıdaki yordamları başlatmadan önce, bu çözümün (50 ml) bir kısım buz üzerine koyun. - ACK (amonyum-klorür-potasyum) parçalanması tampon: prosedürü başlatmadan önce buz üzerinde ACK parçalanması tampon (1 ml) bir kısım yerleştirin.
Not: Aynı ticari olmayan tampon hazırlamak için, 8,02 g NH4CL, 1 g KHCO3 ve 37,2 mg na2EDTA 1 L, H2O. pH değerini 7.2-7.4 olarak ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 aya kadar saklayın. - Kültür ortamı: ekleme 50 ng/mL kök hücre faktörü (SCF) ve 50 ng/mL thrombopoetin (TPO) kültür ve hematopoetik hücrelerin genişlemesi için serum-ücretsiz Orta (bkz: ticari orta için malzeme tablosu önerilir).
- TMRM Stock çözümü: 10 mL etanol içinde 5 μg TMRM tozu çözünerek TMRM (1 μM) solüsyonu hazırlayın. Bu çözümü-20 °C ' de Işıkdan korunmuş olarak saklayın.
- Verapamil stok çözümü: 1 mL etanol içinde 24 mg verapamil seyreltilerek verapamil (50 mM) solüsyonu hazırlayın. Bu çözümü-20 °C ' de saklayın.
- FCCP stok çözümü: 1 mL etanol içinde 254 mg çözünerek carbonilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) solüsyonu hazırlayın. Bu çözümü-20 °C ' de Işıkdan korunmuş olarak saklayın.
2. kemik Iliği yalıtımı
- CO2 inhalasyon kurumsal kuralları takip ve 70% etanol ile fareler sprey tarafından fare euthanize.
Not: Bu adım, deneysel sonuçlardan ödün vermeden ilgi hücrelerinin kontaminasyonunu önler. - Bir çift forseps ve keskin makas kullanarak, fare ventral cilt küçük bir SNIP yapmak ve cilt streç.
- Femur ve Tibia özü onlar kemik iliği hücrelerinin büyük miktarda içeren olarak femur başkanları çıkarmak için değil bakım alırken. Kaldırılan kemikleri 1,5 mL 'Lik boyama tamponunu dolduran 6-kuyu plakasına yerleştirin.
Not: Bu prosedür steril alan gerektirmez. - Kemiklerin kasları çıkarın ve kemik iliği çıkış sağlayan Kemiklerin uçları kesilmiş (Şekil 1a). 1,5 mL 'Lik boyama tamponu ile temizlenmiş kemikleri yeni kuyulara yerleştirin.
Not: Kaslar ve diğer dokularda bir sonraki adımda şırınga tıkanmasını önlemek için dikkatle kaldırılması gerekir. - 25 G iğne ile 3 mL şırıngayı kullanarak kemik iliğini çıkarın.
Not: Kemik iliğinin kemiği beyazlaşıncaya kadar temizlenmeye devam edin (Şekil 1B). - 1,5 ml 'lik bir tüpteki tüm hücreleri toplayın, 180 x g 'de 5 dakika santrifüjten sonra süpernatant 'ı atın (Şekil 1C).
- 300 μL buz soğuk ACK parçalanması tampon çok dikkatli bir şekilde Pelet resuspend, 1 dk ve hemen aktif lizis için buz koymak 1 ml boyama tampon ekleyerek. 180 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
Not: Hücreler Pelet beyaz görünür (Şekil 1D). Yalıtılmış hücrelerin toplam sayısı yaklaşık 2-4 x 107' dir. - Mononükleer hücreler elde etmek için bir 35 μm naylon mesh ile bir hücre süzgeci kapağı (12 x 75 mm2,5ml kapasiteli) kullanarak 1 ml boyama tamponu ve filtresinde pelletleri resuspend. Engellemeden sonra, numuneyi buzda tutun.
3. HSC 'nin tespiti için immünostam
- Lineage (Lin) kokteyli hazırlayın. 400 yılında μL boyama tampon, CD3e, CD4, CD8, b220, CD11b, GR1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM ve Il7Ra karşı aşağıdaki biotinilated antikorların 4 μL ekleyin son seyreltme 1:100 elde etmek için.
- Conjuated fluorophores hazırlayın-antikorlar (ABS). 400 yılında μL boyama tamponu, son seyreltme 1:100 elde etmek için aşağıdaki ABS 4 μL ekleyin. Streptavidin-Pasifik mavisi, Sca1-PE/Cy7, c-Kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 ve CD34-FITC. Buz içinde tutun, ışıkta korunur.
- Numune Santrifüjü 5 dk 180 x g, sonra supernatant atın.
- 400 Ekle μL Lin kokteyl solüsyonu hücrelerine Pellet. 4 μL CD135-biotinilated AB. Vortex hızlı mix ve buz 30 dakika için inküye ekleyin.
- 3 mL boyama tamponu ekleyerek numuneyi yıkayın, 180 x g 'de 5 dakika aşağı döndürün ve supernatant 'ı atın.
- 400 μL ABS solüsyonu ekleyin. Girdap hızlı mix ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inküsmek.
- Numuneleri 3 mL Boya tampon ile yıkayın, 180 x g 'de 5 dakika aşağı doğru döndürün ve süpernatant 'ı atın.
4. TMRM boyama
- TMRM boyama çözümünü hazırlayın. 2,2 μL TMRM hisse senedi çözeltisi ve 1,1 μL verapamil (sırasıyla 2 nM ve 50 μM son konsantrasyon olarak) ekleyin, 1,1 mL serum-serbest orta kültür ve hematopoetik hücrelerin genişlemesi için (bkz: ticari orta için malzeme tablosu önerilir) TPO ile ve SCF.
Not: Bu, protokolün en önemli adımıdır. Verapamil ilavesi, HSCs 'de yüksek oranda ifade edilen ve TMRM ekstrüze edilebilir olan "effluks" pompaları engellemek için gereklidir. - Kemik iliğini 1 mL TMRM boyama çözeltisi içinde resuspend, hızlı Vortex ve 37 °C ' de 1 h için inküser.
Not: TMRM boyama yıkanır olmamalıdır. PE-adanmış tazminat kontrolü de 100 μL TMRM boyama çözeltisi resuspended ve hızlı Vortex sonra 37 °C ' de 1 h için inkübasyon tabi tutulur. - Akış cytometer tıkanmasını önlemek için bir 35 μm naylon mesh ile bir hücre süzgeci kapağı (12 x 75 mm2,5ml kapasite) kullanarak örnek filtre.
Not: TMRM boyama numunenin CLOG oluşumu olasılığını artırır. Numune filtrasyon sadece akış sayısı önce önerilir. - Akış sitometrisi ile ölü hücreleri dışlamak için 1 μL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ekleyin.
5. Flow Cytometer tarafından edinme
- Kemik iliği örneğini çalıştırın ve en az 1 x 106 etkinlik kazanın.
-
Farklı hematopoetik nüfusu belirlemek için gating stratejisini ayarlayın (Şekil 2).
- Canlı kemik iliği mono-nükleer hücreleri (BM-MNCs), DAPI− FRAKSIYONU, CD135−Lin− (Lin−) ve Lin+ kesirleri tanımlamak için Pacific Blue için arsa içinde görüntüleyin.
- APC/Cy7 (c-Kit) ile PE/Cy7 (SCA-1) için Lin− fraksiyonu, c-Kit+ ve SCA-1+olarak MULTIPOTENT progenatörler (MPP) fraksiyonu tanımlamak için Plot.
- APC (CD48) ile PerCP/Cy 5.5 (CD150) için MPP kesirli kısmını CD150+ ve CD48−olarak HSC kesir tanımlamak için çizin.
- CD34−-HSC ve CD34+-HSC 'YI bölmek IÇIN FIC (CD34) için HSC kesir görüntüleyin.
- Her popülasyonda TMRM yoğunluğunu (PE kanalı) edinin.
- Satın aldıktan sonra, 1 mM 'Lik son konsantrasyonu elde etmek ve 5 dakika boyunca 37 °C ' de inküye etmek için FCCP örnek 1 μL 'ye ekleyin, ardından 1 x 106 etkinlik kazanın.
Not: FCCP, Δkr m 'yi dağıtmak için kullanılan bir mitokondriyal uncoupler. TMRM boyama düzgün çalıştığını onaylamak için deneysel kontrol olarak kullanılır. FCCP yönetiminin ardından TMRM yoğunluğu büyük ölçüde azalmalıdır (Şekil 3A). - Her nüfusun PE 'nin ortalama yoğunluğunu, tüm BM-MNCs ' i p yoğunluğu ile normalleştiren verileri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol, BM-MNCs ' i fare modelinden kolay yalıtımını sağlar. Şekil 1 protokolün ana adımlarını özetler: kemik yalıtımı, kemik iliği dışında yıkama, kırmızı kan hücresi Lizi, ve antikor boyama, belirli bir hematopoetik nüfus mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için TMRM boyama izledi .
BM-MNCs, HSCs dahil olmak üzere birkaç hücre nüfus içerir. Bu protokolde kullanılan antikor kokteylleri, HSCs 'nin (CD34− ve CD34+), multipotent progenitör hücrelerinin (mpps), Lin− yanı sıra Lin+ hücrelerinin arıtılmasına sırasıyla 21' de iyi kurulmuştur. Bu fraksiyonları izole etmek için gating stratejisi Şekil 2' de gösterilir.
İlgi nüfusunun tanımlandıktan sonra, parlak bir sinyal olarak görünmesi gereken TMRM yoğunluğu değerlendirildi. HSPCs 'deki TMRM profilleri PBS + 2% FBS (Şekil 3A) ' da boya yapıldığında değişiklik yapılırken, serum içermeyen genişleme ortamında (sfem) TMRM boyama oldukça tavsiye edilir.
Şekil 3c her nüfusun ortalama yoğunluğu gösterir, hangi BM-MNCs. HSCs yoğunluğu tarafından normalleştirilir ksenobiyotik "effluks" pompaları yüksek aktivite seviyeleri TMRM boya ekstrüzyon yeteneğine sahip20, ve gerçekten de, biz hspcs içinde TMRM profilleri bulundu Verapamil varlığında değiştirildi (Şekil 3B, C). Benzer sonuçlar Cyclosporin H (Şekil 3c) gibi diğer inhibitörler tarafından elde edildi. Böylece, δkr m tarafından mitokondri içinde yüklenen TMRM doğru miktarda verapamil veya Cyclosporin H (Şekil 3c) tarafından "effluks" pompaları inhibisyonu sonra ölçülebilir.
Son olarak, FCCP TMRM boyama doğruluğunu doğrulamak için kullanılabilir. FCCP mitokondri depolarizes, TMRM şiddetinde bir azalma sonucu (şekil 3D). Bu yaklaşım, boyama ve/veya negatif kontrol olarak arka plan yoğunluğunu belirlemek için de kullanılabilir.
Şekil 1: protokol akış şeması. Δkr m belirlemek için BM-MNCs izole ve leke prosedürün grafiksel Özeti. Kritik adımlar resim ekler (A-D) ile vurgulanır. Erişkin C57BL/6 farelerden femurs ve kaval izole edildi ve uçları kaldırılır (A). Uzun kemikler gibi A sonra Flush dışarı (B). İzole BM-MNCs önce (C) ve sonra (D) ACK lizis. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Kurulum ayarı. CD34−-HSC ve CD34+-HSC, MPP, Lin− ve Lin+ hücreler dahil olmak üzere farklı hematopoetik popülasyonları tanımlamak için gating stratejisinin şematik temsili. Paneller Bonora, M. ve al.11' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: mitokondriyal membran potansiyelinin akış sitometri analizi. (A) HSCs 'de Δkr m 'nın PBS + 2% FBS (yeşil) veya serum içermeyen genişleme ortamında (kırmızı) TMRM ile lekelenmiş temsili dağılımı. (B, C) CD34−-HSC, CD34+-HSC, MPP, Lin− ve Lin+ HÜCRELERDE (C) δkr m 'nin CD34−-HSC ve Lin− hücrelerde (B), δm veya "effluks" pompa inhibitörleri yokluğunda. Her nüfusun TMRM yoğunluğu kendi BM-MNCs (Bonora, M. ve al.11' den değiştirilmiş) TMRM yoğunluğu ile normale döndü. (D) HSCs 'den önce (pembe) ve sonra (açık mavı) fccp ilavesi ile TMRM yoğunluk dağılımı temsilcisi histogram. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriyal membran potansiyel ölçümü, hücrenin metabolik durumu için kritik olan mitokondri analizinin ve değerlendirmesinin temel taşıdır. Burada, TMRM staining tarafından Δkr m analizi için bir protokol açıklanmaktadır. TMRM, Δkr m nedeniyle aktif mitokondri içinde biriken ve ilgili seviyeleri, ekstrüler, sitoplazmik ve mitokondriyal bölmeleri10arasında denge içinde kalır bir hücre-perdemek floresan boya. Bu protokol tetrametilrhodamin, etil ester (TMRE) ve JC-1 gibi çeşitli boyalar için uyarlanabilir. Doğru sonuçlar elde etmek için uygun boyama koşulları önemlidir. Bunlar şunlardır: ışık maruz kalma koruma, uygun inkübasyon süresi, sabit sıcaklık Bakımı (37 °C) ve ekstrsellüler konsantrasyon. TMRM boya seviyeleri henüz mükemmel denge ulaşmadı zaman, akış sitometri sürecinde veri edinme sırasında boyama yoğunluğu beklenmeyen değişiklikler tespit edilebilir. Bu nedenle TMRM için önerilen boyama süresi 30 dakika yerine 1 saat (bir TMRM üreticisinin protokolünde belirtildiği gibi) olur. Ayrıca, örnek boya istikrarı karşılaştırmak için 5 dakika içinde en az iki kez elde edilmelidir önerilir.
Protokolün başka bir kritik adım antikor ve boya arasında etkili bir renk eşleşme ayarı. Hematopoetik nüfus, iyi kurulan yüzey işaretleri21kullanarak akış sitometri tarafından tespit edilebilir. Burada açıklanan gating stratejisi (Şekil 2) TMRM boyama ile uyumludur ve aynı anda farklı farklılaşma aşamalarında yoğunluğu ölçümü için izin verir. TMRM PE kanalıyla eşleşir, ancak yoğunluğu genellikle PE ile konjuere edilen antikorların daha zayıftır (veri gösterilmez). Bu renk telafisini etkileyebilir, bazı nüfusun spektrumunda beklenmeyen vardiyalara neden, TMRM boyama ile örnek PE kanalı için bir tazminat kontrolü olarak kullanılmalıdır.
Mevcut protokolün en önemli avantajı, TMRM boyasının verimli ekstrüzyonu hem plazma membranı hem de mitokondriyal birikiminin hem dengesini değiştiren ksenobiyotik "effluks" pompalarının etkisinin kaldırılmasına olanak sağlar. Bu, boya emilimi ile HSC mitokondriyal fonksiyonunun doğru değerlendirmesinde kritik bir adımdır. HSCs ile daha aktif "effluks" pompa olarak işlenen hücrelerden fazla19, verapamil veya benzer ilaçlar, gibi Cyclosporine H, bir CA2 +bağımsız çoklu ilaç direnç inhibitörü22 (Şekil 3B-C), kullanılmalıdır daha doğru mitokondriyal aktivite düzeylerini değerlendirmek için HSCs için boyama prosedürü. Bu kritik sorun sadece son11,19 işaret edildi ve hala tartışma23altında olduğu için, bu raporun ana amacı prosedürü standartlaştırmaya yardımcı olacak kolay ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır tekrarlanabilir verileri elde etmek ve farklı araştırma gruplarının sonuçları arasındaki belirgin uyuşmazlıkları azaltmak. Burada açıklanan protokol, dozlarda, zamanlama ve spesifik medya gibi her adımda ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Örneğin, HSPCs 'deki TMRM profilleri, ortamlarına (Şekil 3A) bağlı olarak farklılık gösterebilir. İlgili mekanizmaların ayrıntılı bir analizi daha fazla keşif gerektirecektir, ancak serum içermeyen genişleme ortamı (SFEM) HSC kültürü için iyi kurulmuş bir yöntemdir, çünkü HSCs için TMRM boyama yaparken PBS yerine SFEM şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, "effluks" pompaları inhibisyonu ile burada gösterilen mitokondrial membran potansiyelinin doğru değerlendirilmesi verapamil olası gelecekteki uygulamaları vurgular, yanı sıra diğer boyalar (örneğin mitotracker, mitosox), soruşturma HKH.
Daha da önemlisi, Akış sitometrisi tarafından gösterilen TMRM yoğunluğu mitokondriyal hacmi tam olarak yansıtmayabilir. Akış sitometri hücre başına toplam floresan yoğunluğunu ölçer, ancak mitokondriyal boyaların mitokondri olarak dağılımı Δkr m 'ye bağlıdır. Bu nedenle, bir TMRM okuması için kritik katkının Δkr m veya mitokondriyal hacim11' den türetildiği ayırt etmek zordur. Mitokondriyal kütlesi ölçmek için en sık kullanılan boyardan biri olan MTO 'nun hem δkr m hem de "effluks" pompa aktivitesinden etkilendiğini teyit ettik. Ayrıca, verapamil 'in HSPC nüfusunun MTO 'nun yoğunluk profilini değiştirdiği, ancak MTO yoğunluğu ile mitokondriyal hacim11arasında hiçbir korelasyon bulunduğunu gözlemledik. Mitokondriyal hacminin kombine ölçümü ve Δkr m, verileri normalleştirmek ve membran potansiyelinin etkilerini ortadan kaldırmak için kullanılmalıdır, ve mitokondriyal içeriğin daha fazla araştırılması Δkr m-bağımsız teknikler kullanılarak yapılmalıdır.
Bu tür teknikler floresan işaretçileri (örneğin, mitokondriyal proteinlerin immünostasyonu), elektron mikroskobu11ve mitokondriyal/nükleer DNA oranlarının kantitasyon dayalı 3D hacim analizi içerir. Mitokondriyal boyaların (örn., TMRM) "effluks" sistem inhibitörleri ile birlikte kullanımı, mitokondriyal biyolojinin akışlı sitometri yoluyla büyük yararını ispat edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Ito laboratuar, özellikle K Ito ve H sato ve Einstein kök hücre Enstitüsü yorum ve Einstein Flow cytometry ve analitik görüntüleme çekirdek tesisleri (Ulusal Kanser Enstitüsü Grant P30 CA013330 tarafından finanse edilen) tüm üyelerine teşekkür deneyler yürütmek yardımcı olur. K.I. Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK98263, R01DK115577 ve R01DK100689) ve Einstein tek hücreli Genomics/Epigenomics (C029154) çekirdek Direktörü olarak sağlık New York Dışişleri Bakanlığı hibe tarafından desteklenir. K.I. Ito lösemi ve lenfoma toplumu araştırma bilimci olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al.
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
