Summary
As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.
Abstract
Como o metabolismo celular é um regulador chave da autorenovação de células-tronco hematopoiéticas (HSC), os vários papéis desempenharam as mitocôndria na homeostase hematopoiética têm sido extensivamente estudados por pesquisadores do HSC. Os níveis de atividade mitocondrial são refletidos em seus potenciais de membrana (Δm), que podem ser medidos por corantes catiônicos celulares, como TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). A capacidade de bombas de efluxo para expulsar esses corantes de células pode limitar a sua utilidade, no entanto. O viés de mensuração resultante é particularmente crítico na avaliação de HSCs, uma vez que os transportadores xenobióticos exibem níveis mais elevados de expressão e atividade em HSCs do que em células diferenciadas. Aqui, nós descrevemos um protocolo que utiliza o verapamil, um inibidor da bomba de efluxo, para medir exatamente o Δ, em várias populações de medula óssea. A inibição resultante da atividade da bomba é mostrada para aumentar a intensidade de TMRM em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs), ao deixá-la relativamente inalterada em frações maduras. Isto destaca a atenção estreita à atividade do tingimento-efflux que é exigida quando os corantes Δm-dependentes são usados, e como escrito e visualizado, este protocolo pode ser usado para comparar com precisão as populações diferentes dentro da medula óssea, ou a mesma população em diferentes modelos experimentais.
Introduction
As células-tronco hematopoiéticas (hscs) são autorenováveis, multipotentes e capazes de dar origem a todas as células do sangue1,2. O metabolismo celular é um regulador chave da manutenção do HSC, juntamente com fatores transcricionais, sinais intrínsecos e o microambiente3,4,5. O controle adequado da função e qualidade mitocondrial é, portanto,crítico para a manutenção do HSC6,7.
O potencial de membrana mitocondrial (Δ, m) é um parâmetro chave na avaliação das mitocôndrias, pois reflete diretamente sua funcionalidade, que deriva do equilíbrio da atividade de bombeamento de prótons na cadeia de transporte de elétrons e o fluxo de prótons através de F 1/FO ATP Synthase. Ambos são necessários (dependendo da expressão gênica e da disponibilidade de substrato) para a fosforilação dependente do oxigênio da ADP para o ATP8,9. Aproveitando-se da eletronegatividade do compartimento mitocondrial, vários corantes potenciométricos foram desenvolvidos para medir Δm. Um deles é o perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que tem sido amplamente utilizado para medir Δ, por citometria de fluxo em uma variedade de células10, incluindo tronco hematopoiético e células progenitoras11.
Corantes mitocondriais devem ser usados com algum cuidado em HSCs, no entanto, porque a alta atividade das bombas de efluxo xenobiótica dessas células pode resultar em extrusão de corante12. Na verdade, a extrusão de corantes mitocondriais, como a Rhodamina 123 permitiu que os pesquisadores isolem HSCs13 ou identifiquem HSC "populações laterais" explorando a extrusão diferencial dos corantes Hoechst Blue e Hoechst Red14, 15. também foi demonstrado que o Fumitremorgin C, um bloqueador específico do transportador da subfamília G do membro 2 (ABCG2) do cassette de ligação ATP, não afeta o padrão de coloração de MitoTracker em HSPCs16. Após a publicação destes resultados, vários estudos foram realizados utilizando corantes mitocondriais na ausência de inibidores da bomba de efluxo xenobióticos, levando à impressão generalizada de que os HSCs têm apenas um pequeno número de mitocôndrias com baixo Δm16 , 17 anos de , de 18 anos.
Recentemente, demonstrou-se, entretanto, que Verapamil, um inibidor largo do espectro de bombas do efluxo, modifica significativamente o teste padrão de mancha do corante mitochondrial MitoTracker verde19. Esta discrepância é provavelmente devido ao fato de que Fumitremorgin C é altamente seletivo para Abcg2, enquanto os HSCs também expressam outros transportadores, como Abcb1a (que é apenas fraca sensível a Fumitremorgin C)19. Nós igualmente relatado que outras tinturas mitochondrial, tais como tmrm, laranja do acridina do Nonyl, e laranja de MitoTracker (mto) exibem os mesmos testes padrões que o verde de MitoTracker. Mais importante, observou-se que os padrões citométricos de fluxo de HSPCs refletem seu Δm em adição à massa mitocondrial11.
A ingestão de corante TMRM depende estritamente da carga negativa das mitocôndrias, mas o acúmulo resultante de corante está em constante equilíbrio entre sua ingestão e folga por bombas de efluxo20. A diferença na expressão da bomba de efluxo xenobiótico entre HSCs e populações de células maduras afeta esse equilíbrio e pode levar a resultados tendenciosos. O uso de inibidores dedicados como o verapamil deve ser considerado na análise de Δm por corantes potenciométricos. Aqui nós descrevemos um protocolo modificado para a medida exata do δ, m pela citometria de fluxo tmrm-baseada que corrige para a atividade do transportador do xenobióticos com o uso de nervos inibidores dedicados.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina Albert Einstein.
1. preparação de soluções
- Tampão de coloração (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 2% de soro bovino fetal (FBS)): adicionar 10 mL de FBS em 500 mL de uma solução de PBS estéril.
Nota: Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c durante pelo menos um mês em condições estéreis. Antes de iniciar os seguintes procedimentos, coloque uma alíquota desta solução (50 mL) no gelo. - Tampão lisando do ACK (cloreto de amônio-potássio): coloc uma alíquota do amortecedor de lise do ACK (1 ml) no gelo antes de começar o procedimento.
Nota: Para preparar o mesmo tampão não comercial, dissolva 8, 2 g de NH4CL, 1 g de KHCO3 e 37,2 mg de na2EDTA em 1 L de H2o. Ajuste o pH para 7.2-7.4. Armazene por até 6 meses na temperatura ambiente. - Meio de cultura: Adicionar 50 ng/mL fator de células-tronco (SCF) e 50 ng/mL de Trombopoietina (TPO) para o meio livre de soro para a cultura e expansão de células hematopoiéticas (ver tabela de material para meio comercial recomendado).
- Solução de stock TMRM: Prepare a solução de TMRM (1 μM) dissolvendo 5 μg de pó de TMRM em 10 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c protegida da luz.
- Solução de Verapamil: Prepare a solução de Verapamil (50 mM) diluindo 24 mg de Verapamil em 1 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c.
- Solução de ações da FCCP: Prepare a solução de Carbonilcianeto p-triflourometoxifenilhidrazina (FCCP) (1 M) dissolvendo 254 mg em 1 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c protegida da luz.
2. isolamento da medula óssea
- Eutanizar o rato por CO2 inalação seguindo as diretrizes institucionais e pulverizar os camundongos com 70% etanol.
Nota: Este passo impede a contaminação das células de interesse sem comprometer os resultados experimentais. - Usando um par de fórceps e tesouras afiadas, faça um Snip pequeno na pele ventral do rato e estique a pele.
- Extraia o fêmur e a tíbia, tomando cuidado para não desalojar as cabeças do fêmur, pois elas contêm uma grande quantidade de células da medula óssea. Coloque os ossos removidos em uma placa de 6 poços preenchida com 1,5 mL de tampão de coloração.
Nota: Este procedimento não exige a área estéril. - Retire os músculos dos ossos e corte as extremidades dos ossos permitindo a saída da medula óssea (Figura 1a). Coloque os ossos limpos em novos poços com 1,5 mL de tampão de coloração.
Nota: Os músculos e outros tecidos devem ser cuidadosamente removidos para evitar entupimento da seringa na próxima etapa. - Lave a medula óssea utilizando uma seringa de 3 mL com uma agulha de 25 G.
Nota: Continuar a esvaziar a medula óssea até que o osso se torne branco (Figura 1b). - Colete todas as células em um tubo de 1,5 mL, centrifugue por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante (Figura 1C).
- Ressuscite o pellet em 300 μL de gelo frio ACK lise tampão com muito cuidado, coloque no gelo por 1 min e lise imediatamente inativa, adicionando 1 ml de mancha tampão. Centrifugador por 5 min a 180 x g.
Nota: O pellet células aparece branco (Figura 1D). O número total de células isoladas é de cerca de 2-4 x 107. - Ressuscitação das pelotas em 1 mL de tampão de coloração e filtro usando uma tampa de peneira celular (12 x 75 mm2,5ml de capacidade) com uma malha de nylon de 35 μm incorporada para obter células mononucleares. Após o bloqueio, mantenha a amostra no gelo.
3. imunocoloração para detecção de HSC
- Prepare o cocktail Lineage (Lin). Em 400 μL de tampão de coloração, adicionar 4 μL dos seguintes anticorpos biotinilados contra CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM e Il7Ra para obter uma diluição final 1:100.
- Prepare os fluoróforos conjugados-anticorpos (ABS). Em 400 μL de tampão de coloração, adicionar 4 μL do seguinte ABS para obter uma diluição final 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 e CD34-FITC. Mantenha no gelo, protegido da luz.
- Centrifugue a amostra durante 5 min a 180 x ge, em seguida, elimine o sobrenadante.
- Adicionar 400 μL de solução de cocktail Lin ao pellet de células. Adicionar 4 μL de CD135-biotinilado AB. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 30 min no gelo.
- Lave a amostra adicionando 3 mL de tampão de coloração, gire para baixo por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante.
- Adicionar 400 μL de solução de ABS. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 30 min no gelo.
- Lave as amostras com 3 mL de tampão de coloração, gire para baixo por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante.
4. coloração TMRM
- Prepare a solução de coloração TMRM. Adicionar 2,2 μL de solução de stock de TMRM e 1,1 μL de Verapamil (2 nM e 50 μM como concentração final, respetivamente) em 1,1 mL de meio livre de soro para cultura e expansão de células hematopoiéticas (ver tabela de material para meio comercial recomendado) com TPO e SCF.
Nota: Este é o passo mais importante do protocolo. A adição de Verapamil é necessária para bloquear as bombas de efluxo que são altamente expressas nos HSCs e podem expulsar TMRM. - Ressuscitar a medula óssea em 1 mL de solução de coloração de TMRM, vórtice rapidamente e incubar por 1 h a 37 ° c.
Nota: A coloração de TMRM não deve ser lavada. O controle de compensação PE-dedicado também é redobrado em 100 μL de solução de coloração de TMRM e submetido à incubação por 1 h a 37 ° c após o vórtice rápido. - Filtre a amostra usando uma tampa de filtro de células (12 x 75 mm2,5ml de capacidade) com uma malha de nylon de 35 μm incorporada para evitar entupimento do citometro de fluxo.
Nota: A coloração por TMRM aumenta a possibilidade de formação de entupimento na amostra. A filtração da amostra pouco antes dos ensaios de fluxo é recomendada. - Adicionar 1 μL de 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para excluir células mortas por citometria de fluxo.
5. aquisição por Citometro de fluxo
- Executar amostra de medula óssea e adquirir pelo menos 1 x 106 eventos.
-
Configurar a estratégia de gating para identificar as diferentes populações hematopoiéticas (Figura 2).
- Mostre pilhas mono-nucleares da medula óssea viva (BM-MNCs), DAPI-fração, no lote para o azul Pacífico para identificar CD135−Lin− (Lin−) e Lin+ frações.
- Plotar Lin− fração para APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) para identificar a fração de progenitores MULTIPOTENTES (MPP), como c-kit+ e SCA-1+.
- Plotar a fração MPP para APC (CD48) versus PerCP/Cy 5.5 (CD150) para identificar a fração HSC, como CD150+ e CD48−.
- Mostre a fração HSC para FITC (CD34) para dividir CD34−-HSC e CD34+-HSC.
- Adquira a intensidade de TMRM (canal de PE) em cada população.
- Após a aquisição, acrescente à amostra 1 μL de FCCP para obter a concentração final de 1 mM e incubar a 37 ° c por 5 min, depois adquira 1 x 106 eventos.
Nota: FCCP é um desengate mitocondrial que é usado para dissipar o Δm. Ele é usado como controle experimental para confirmar que a coloração TMRM funciona corretamente. Após a administração da FCCP, a intensidade do TMRM deve ser drasticamente diminuída (Figura 3a). - Analisar dados normalizando a intensidade média de PE de cada população pela intensidade de PE de todas as BM-MNCs.
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Representative Results
O protocolo descrito acima permite o isolamento fácil de BM-MNCs a partir de um modelo de mouse. A Figura 1 resume as principais etapas do protocolo: isolamento ósseo, rubor da medula óssea, lise de glóbulos vermelhos e coloração de anticorpos seguida de coloração por TMRM para medir o potencial da membrana mitocondrial em uma população hematopoiética específica .
As BM-MNCs contêm várias populações de células, incluindo HSCs. Os coquetéis de anticorpos utilizados neste protocolo são bem estabelecidos na purificação de HSCs (CD34− e CD34+), células progenitoras multipotentes (mpps), Lin− bem como células Lin+ , respectivamente 21. A estratégia de gating para isolar estas frações é mostrada na Figura 2.
Após a identificação de populações de interesse, avaliou-se a intensidade do TMRM, que deve aparecer como sinal luminoso. A coloração de TMRM em meio de expansão livre de soro (SFEM) é altamente recomendada, pois os perfis de TMRM em HSPCs podem sofrer alterações quando a coloração é realizada em PBS + 2% FBS (Figura 3a).
A Figura 3C mostra a intensidade média de cada população, que é normalizada pela intensidade das BM-MNCs. hscs expressam altos níveis de atividade de bombas de efluxo xenobióticas capazes de expulsar tmrm Dye20, e, de fato, encontramos perfis de Tmrm em hspcs foram alterados na presença de Verapamil (Figura 3B, C). Resultados semelhantes foram obtidos por outros inibidores, como a ciclosporina H (Figura 3C). Assim, a quantidade exata de TMRM carregada nas mitocôndrias por Δm pode ser mensurada após a inibição das bombas de efluxo por Verapamil ou ciclosporina H (Figura 3C).
Finalmente, o FCCP pode ser usado para verificar a exatidão da coloração de TMRM. A FCCP despolariza as mitocôndrias, resultando em redução da intensidade do TMRM (Figura 3D). Essa abordagem também pode ser usada para determinar a intensidade do plano de fundo da coloração e/ou como um controle negativo.
Figura 1: fluxograma do protocolo. Resumo gráfico do procedimento para isolar e manchar BM-MNCs para determinar Δm. As etapas críticas são destacadas por inserçõesde imagem (A-D). Femurs e tíbias de camundongos adultos C57Bl/6 foram isolados e suas extremidades são removidas (A). Ossos longos como em A após o flush out (B). BM-MNCs isolados antes (C) e após (D) lise do ACK. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: configuração de gating. Respresentação esquemática da estratégia de gating para identificar as populações hematopoietic diferentes, incluindo CD34−-HSC e CD34+-HSC, MPP, Lin− e Lin+ Cells. Os painéis foram modificados de Bonora, M. et al.11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise da citometria de fluxo do potencial da membrana mitocondrial. (A) distribuição representativa de Δ, em hscs corados com TMRM em PBS + 2% FBS (verde) ou em meio de expansão livre de soro (sfem) (vermelho). (B, C) Distribuição representativa de Δ, em CD34−-HSC e Lin− Cells (B) e quantificação de δm em CD34−-HSC, Cd34+-HSC, MPP, Lin− e Lin+ células (C) coradas com tmrm em presença ou ausência de inibidores da bomba de efluxo. A intensidade de TMRM de cada população foi normalizada pela intensidade de TMRM das próprias BM-MNCs (modificadas de Bonora, M. et al.11). (D) histograma representativo da distribuição da intensidade de TMRM em hscs antes (rosa) e depois (azul claro) FCCP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A medida do potencial de membrana mitocondrial é uma pedra angular da análise e avaliação das mitocôndrias, que são críticas ao estado metabólico da célula. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a análise de Δm pela mancha de TMRM. O TMRM é um corante fluorescente que se acumula nas mitocôndrias ativas devido a Δm, e seus respectivos níveis permanecem em equilíbrio entre os compartimentos extracelular, citoplasmático e mitocondrial10. Este protocolo pode ser adaptado para vários corantes, incluindo tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) e JC-1. As condições de coloração apropriadas são críticas para alcançar resultados precisos. Estes incluem: proteção contra exposição à luz, tempo de incubação adequado, manutenção da temperatura constante (37 ° c) e concentração extracelular. Quando os níveis de corante TMRM ainda não atingiram o equilíbrio perfeito, alterações inesperadas na intensidade de coloração podem ser detectadas durante a aquisição de dados no processo de citometria de fluxo. Conseqüentemente o período de coloração recomendado para TMRM é 1 h um pouco do que 30 minutos (como mencionado em um protocolo do fabricante de TMRM). Sugere-se igualmente que a amostra deva ser adquirida pelo menos duas vezes dentro de 5-min a fim comparar a estabilidade do corante.
Outra etapa crítica do protocolo é a criação de uma combinação de cores eficiente entre anticorpos e corante. Populações hematopoiéticas podem ser detectadas por citometria de fluxo utilizando marcadores de superfície bem estabelecidos21. A estratégia de gating descrita aqui (Figura 2) é compatível com a mancha de TMRM, e permite a medida de sua intensidade em estágios diferentes da diferenciação simultaneamente. TMRM coincide com o canal de PE, mas sua intensidade é geralmente muito mais fraca do que a de anticorpos conjugados com PE (dados não mostrados). Como isso pode afetar a compensação de cor, causando deslocamentos inesperados nos espectros de algumas populações, a amostra com coloração de TMRM deve ser usada como um controle de compensação para o canal de PE.
A principal vantagem do protocolo atual é que ele permite a remoção do efeito de bombas de efluxo xenobiótica, cuja extrusão eficiente do corante TMRM modifica o seu equilíbrio em toda a membrana plasmática e sua acumulação mitocondrial. Esta é uma etapa crítica na avaliação exata da função mitochondrial de HSC pela absorção da tintura. Como os hscs expressam bombas de efluxo mais ativas do que as células comprometidas19, Verapamil ou drogas similares, como ciclosporina H, um inibidor de resistência multidrogas independente de CA2 +22 (Figura 3B-C), devem ser usados na procedimento de coloração para HSCs para avaliar com mais precisão os níveis de atividade mitocondrial. Porque esta questão crítica foi apontada apenas recentemente11,19 e ainda está em discussão23, o principal objetivo deste relatório é fornecer um protocolo fácil e detalhado que irá ajudar a padronizar o procedimento para obtenção de dados reprodutíveis e reduzir as discrepâncias aparentes entre os resultados de diferentes grupos de pesquisa. O protocolo aqui descrito mostra em detalhe cada etapa, incluindo doses, cronometragem e meios específicos. Por exemplo, os perfis de TMRM em HSPCs podem diferir dependendo de seu meio (Figura 3a). Uma análise detalhada dos mecanismos envolvidos exigirá uma exploração mais adicional, mas desde que o meio de expansão soro-livre (SFEM) é um método bem estabelecido para a cultura de HSC, SFEM um pouco do que PBS é recomendado fortemente ao executar a mancha de TMRM para HSCs. Além disso, a avaliação exata do potencial de membrana mitocondrial demonstrada aqui através da inibição de bombas de efluxo destaca possíveis aplicações futuras de Verapamil, bem como outros corantes (por exemplo, MitoTracker, MitoSOX), na investigação de HSCs.
Importante, a intensidade de tmrm como mostrado pelo fluxo citometria não pode precisamente refletir o volume mitochondrial. A citometria de fluxo mede a intensidade de fluorescência total por célula, mas a distribuição de corantes mitocondriais às mitocôndrias depende do Δm. Portanto, é difícil discernir se a contribuição crítica para uma leitura de TMRM deriva de Δm ou volume mitocondrial11. Confirmou-se que o MTO, um dos corantes mais freqüentemente utilizados para medir a massa mitocondrial, é afetado pela atividade da bomba de Δm e efluxo. Também observamos que o verapamil modifica o perfil de intensidade do MTO nas populações de HSPC, mas não encontrou correlação entre a intensidade do MTO e o volume mitocondrial11. A medição combinada do volume mitocondrial e do Δo-m deve ser usada para normalizar os dados e eliminar os efeitos do potencial de membrana, e a exploração adicional do conteúdo mitocondrial deve ser realizada usando técnicas de Δm independentes.
Tais técnicas incluiriam a análise de volume 3D baseada em marcadores fluorescentes (por exemplo, imunocoloração de proteínas mitocondriais), microscopia eletrônica11e quantificação de rácios de DNA mitocondrial/nuclear. O uso de corantes mitocondriais (i.e., TMRM) em combinação com os inibidores do sistema de efluxo provará sem dúvida de grande benefício na elucidação da biologia mitocondrial através da citometria de fluxo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a todos os membros do laboratório Ito, especialmente K Ito e H Sato, e o Einstein Stem Cell Institute para comentários e as instalações do núcleo de citometria de fluxo de Einstein e Imaging analítico (financiado pelo National Cancer Institute Grant p30 CA013330) para ajudar a realizar os experimentos. O K.I. é apoiado por doações dos institutos nacionais de saúde (R01DK98263, R01DK115577 e R01DK100689) e do departamento de saúde de Nova York como diretor principal da genômica/Epigenômica de célula única de Einstein (C029154). K.I. Ito é um estudioso de pesquisa da sociedade de leucemia e linfoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
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