Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة لتسهيل توليد تغييرات النيوكليوتيدات المتجانسة أو المتجانسة المحددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى.
Abstract
توفر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى نظامًا قويًا لدراسة وظيفة الجينات ونمذجة الطفرات المحددة ذات الصلة بالمرض. إن توليد تعديلات جينية دقيقة غير متجانسة يشكل تحدياً بسبب تشكيل الإندل بوساطة كريسبر-كاس9 في الأليل الثاني. هنا، نقوم بإظهار بروتوكول للمساعدة في التغلب على هذه الصعوبة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط يعبر عن تغيير التسلسل المطلوب، في حين أن كلا النموذجين تحتوي على طفرات صامتة لمنع إعادة قطع وتشكيل indel. هذه المنهجية هي الأكثر فائدة لتحرير الجينات مناطق الترميز من الحمض النووي لتوليد السيطرة المسببة للسرطان ومتحولة خطوط الخلايا الجذعية البشرية لدراسة الأمراض البشرية والبيولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين منهجيات التغوط والفحص إلى أقصى حد للحد من العمالة وتكلفة تجربة تحرير الجينات. وبشكل عام، ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على العديد من مشاريع تحرير الجينوم التي تستخدم نموذج الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي أدوات قيمة لنمذجة الأمراض البشرية بسبب قدرتها على التجديد، مع الحفاظ على القدرة على توليد أنواع الخلايا من سلالات مختلفة1،2 ،3،4. هذه النماذج تفتح إمكانية استجواب وظيفة الجينات، وفهم كيف ترتبط الطفرات المحددة والأنماط الظاهرية بأمراض مختلفة5،6. ومع ذلك، لفهم كيفية ربط تغيير معين إلى النمط الظاهري معين، واستخدام التحكم isogenic المقترنة وخطوط الخلايا متحولة من المهم للسيطرة على خط لتقلب خط7،8. وقد استخدمت النوكلورات الشبيهة بالمنشطات والزنك لتوليد طفرات الإدراج أو الحذف (indels) في نماذج وراثية متنوعة، بما في ذلك الخلايا الأولية؛ ولكن هذه nucleases يمكن أن تكون مرهقة للاستخدام ومكلفة9،10،11،12،13،14. وقد أحدث اكتشاف تكرار قصير متباعد (CRISPR)-CAS9 nuclease متفاوتة في الميدان بسبب الكفاءة في تكوين الإندل في أي منطقة من الجينوم تقريبا، وبساطة الاستخدام، وخفض التكلفة15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19.
وكان التحدي في استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم القائم على CRISPR-CAS9 توليد أو تصحيح طفرات محددة في أليل واحد دون خلق طفرة indel في الأليل الثاني20. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو التغلب على هذا التحدي باستخدام اثنين من قوالب إصلاح oligonucleotide واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssODN) للحد من تشكيل الإندل في الأليل الثاني. تم تصميم كل من ssODNs لاحتواء الطفرات الصامتة لمنع إعادة قطع من قبل NUcLEASE CAS9، ولكن واحد فقط يحتوي على تغيير الفائدة. هذا الأسلوب يزيد من كفاءة توليد تعديل وراثي غير متجانسة دون تحفيز تشكيل indel في الأليل الثاني. باستخدام هذا البروتوكول، تظهر تجارب تحرير الجينات في ستة مواقع جينية مستقلة الإدخال الدقيق للتغيير الجيني المطلوب في الأليل واحد دون تشكيل الإندل في الأليل الثاني ويحدث مع كفاءة عامة من ~ 10٪. وقد تم تكييف البروتوكول الموصوف من ماغواير وآخرون21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم وبناء دليل RNA (gRNA)
ملاحظة: يتكون كل gRNA من اثنين من 60 زوج قاعدة (BP) oligonucleotides التي يتم صلب لتوليد 100 نقطة أساس مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DS) oligonucleotide(الشكل 1A-C). الجدول الزمني لتصميم gRNA، وتوليد، واختبار كفاءة القطع هو ما يقرب من 2 أسابيع(الشكل 2).
- حدد منطقة الحمض النووي ذات الأهمية ليتم تحريرها الجينوم وتحديد 3-4 23 تسلسلbp التي تناسب الشكل، 5'-G(N 19)NGG-3'. وينبغي أن تكون هذه التسلسلات في حدود 20 نقطة أساس من المنطقة موضع الاهتمام.
ملاحظة: يمكن تنفيذ الاستهداف على المعنى أو حبلا المضادة للإحساس. - تقييم تسلسلات gRNA للتكرار الجيني والاحتمال خارج الهدف باستخدام مورد مثل CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- دمج التسلسل المستهدف 20 نقطة أساس (باستثناء عزر protospacer المجاورة أو PAM) في اثنين من 60-mer oligonucleotides كما هو مبين (تسلسل هي 5 ' إلى 3 ' والأحمر والأخضر هي تكمل ة عكسية كما هو مبين في الشكل 1C).
- طلب اثنين 60 نقطة أساس oligonucleotides من البائع من الاختيار. بمجرد تلقي oligonucleotides، إعادة تعليق كل إلى تركيز نهائي من 100 درجة مئوية في ddH2O. جعل مخزون العمل من 10 ميكرومتر.
- الأنيال اثنين oligonucleotides وتوليد 100 نقطة في الثانية dsDNA جزء باستخدام بوليميراز الحمض النووي(جدول المواد). الجمع بين 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام oligonucleotide و 5 ميكرولتر من 10 μM عكس oligonucleotide في بوليميراز سلسلة رد فعل (PCR) شريط أنبوب وحضانة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إعداد PCR كما هو موضح في الجدول 1. إجراء تضخيم PCR في دورة حرارية باستخدام المعلمات المبينة في الجدول 2.
- تصور منتجات PCR على 1.5٪ (ث / الخامس) بروميد الإيثيديوم (EtBr) هلام أغاروز الكهربائي في 80-100 V لمدة 40 دقيقة المكوس الفرقة 100 bp(الشكل 3A)،تصور على مربع ضوء LED، من هلام باستخدام شفرة الحلاقة وتنقية باستخدام هلام استخراج عدة(جدول المواد).
2- تصميم المواد التمهيدية الخاصة بـ PCR للفحص
- إجراء فحص الحمض النووي المحرر باستخدام التمهيديات الأمامية والعكسية لـ PCR المصممة خصيصًا لتضخيم منطقة 400-500 bp من الجين موضع الاهتمام(الجدول 2). استخدم الحمض النووي المعزول عن أي خط تحكم iPSC لتأكيد وجود أمبليكون نظيف عند إجراء فحص PCR.
- تصور منتجات PCR على هلام 1.5٪ (ث / الخامس) بعد الكهربائي في 80-100 V لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: يتم تنفيذ تسلسل النسخ المحرر باستخدام التمهيدي المتداخلة التي تم تصميمها بعد تأكيد مجموعة التمهيدي الفرز. يتم إرسال العينات إلى مصدر تجاري للتسلسل.
3. إعداد gRNA_استنساخ ناقلات بلازميد
- لخطي متجه الاستنساخ، واتخاذ أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وإضافة 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي للمتجه gRNA_cloning جنبا إلى جنب مع 4 ميكرولتر من العازلة إنزيم تقييد AflII و 1.5 ميكرولتر من إنزيم تقييد AflII. إحضار رد الفعل إلى 24 درجة مئوية من ddH2O. مزيج رد الفعل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. حضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O / N).
- الكهربائي على هلام أغاروز 1٪ في 80-100 V لمدة ساعة 1 والعصابات المكوس (حجم الفرقة المتوقع هو ~ 3519 نقطة في اليوم).
- استخراج وتنقية كما هو الحال في الخطوة 1.6.
4. الجمعية من ناقلات gRNA
- إعداد ردود الفعل وتجميع شظايا الحمض النووي باستخدام مجموعة التجميع(جدول المواد)في 1:5 نسب AflII هضم gRNA استنساخ ناقلات إلى 100 نقطة أساس هلام تنقية إدراج، كما هو موضح في الجدول 3.
- احتضان رد الفعل عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. خلايا لوحة على لوحات كانامايسين LB / أجار.
- اختيار 3-5 مستعمرات لكل gRNA. تلقيح كل مستعمرة في 4 مل من رطل وتنمو O / N في 37 درجة مئوية في حاضنة الهز المداري.
- تنقية الحمض النووي بلازميد باستخدام مجموعة عزل بلازميد miniprep، وتسلسل كل gRNA باستخدام التمهيديات التالية لضمان الاستنساخ الناجح: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG. عكس: TGCCAACTTTGTACAAAGAGCT.
5. اختبار gRNA كفاءة القطع
- لوحة hESCs على الخلايا الليفية الجنينية المُشَعَدّة (MEFs) في لوحة ذات 6 آبار، كما سبق وصفهابـ 21. عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ من الوفرة، قم بإعداد المزيج الرئيسي للتغوط في التغوطالموضح في الجدول 4 .
- مزيج عن طريق الأنابيب والحضانة في RT لمدة 15 دقيقة.
- خلايا الحصاد للفرز بعد 48 ساعة.
- إزالة MEFs الأنزيمية(جدول المواد)مع حضانة RT 3 دقائق.
- شطف الخلايا 1X مع hESC المتوسطة(الجدول 5)وكشط في hESC المتوسطة + 10 درجة مئوية Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد(جدول المواد).
- خلايا بيليه في 300 × ز لمدة 3 دقائق وإعادة تعليق في 0.5 مل من hESC المتوسطة + 10 درجة مئوية Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
- قم بالتصفية في أنبوب بـ 5 مل من خلال غطاء مصفاة الخلايا بـ 35 ميكرومتر.
- باستخدام الفلورة تنشيط فرز الخلايا (FACS)، بوابة على الخلايا الحية وفرز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الخلايا الإيجابية.
- نقل ما لا يزيد عن 1.5 × 104 خلايا مرتبة مباشرة إلى طبق 10 سم2 المغلفة مع 1:3 مصفوفة غشاء الطابق السفلي(جدول المواد)وMEFs المشعة في hESC المتوسطة(الجدول 5)التي تحتوي على Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
- تغيير المتوسطة يوميا باستخدام المتوسطة hESC(الجدول 5)دون Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد واختيار يدويا استنساخ بعد 10-15 يوما، عندما تكون المستعمرات ~ 1 ملم في القطر.
- باستخدام ماصة P200 والمجهر، كشط بعناية استنساخ واحد ورسم الخلايا في ماصة.
- تفريق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف 3-4X في لوحة بئر 96 في المتوسط وضعت مع المستعمرة.
- الاستغناء عن أنابيب قطاع PCR لفحص وبيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق.
6. استنساخ الفرز
- عزل الحمض النووي عن طريق احتضان الكريات الخلية في 20 ميكرولتر من بروتيناس K العازلة(الجدول 5)(1 ساعة في 55 درجة مئوية و 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية) ودوامة بقوة. الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق وجمع supernatant.
- إجراء فحص PCR (القسم 2) في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر باستخدام مزيج رئيسي بما في ذلك التمهيديات المصممة لتضخيم المنطقة ذات الاهتمام و 5 ميكرولتر من خلاصة proteinase K. استخدام الحمض النووي الجينومي المعزول من خط الخلية الذي تم تحرير الجينات كعنصر تحكم.
- تقييم التغيرات في حجم منتجات PCR بعد 1 ساعة الكهربائي في 70-90 V على هلام أغاروز 2.5٪ (ث / الخامس)(الشكل 3B، C). أي فرق في الحجم يدل على الانقسام.
7- تحرير الجينوم الدقيق في الخلايا الجذعية المتعددة القوى باستخدام الحمض النووي القلة الوحيد الذي لامع (ssODNs)
- تصميم 100 نقطة أساس ssODNs تتمحور حول تسلسل gRNA الأكثر كفاءة تحديد أن يكون أفضل كفاءة القطع.
- منع إعادة انشقاق ODN المعاد دمجها عن طريق إدخال الطفرات الصامتة في تسلسل gRNA. طفرة صامتة واحدة في تسلسل PAM كافية، ولكن إذا لم يكن ذلك ممكنا، سوف 3-4 الطفرات الصامتة تعمل.
ملاحظة: لتسهيل فحص الحيوانات المستنسخة المستهدفة، يعتبر إدخال موقع تقييد ضمن حوالي 20 نقطة أساس من تسلسل gRNA مثاليًا. - تصميم ODN واحد مع التغيير الأساسي المطلوب (ق) لخلق طفرة من الفائدة وODN واحد دون التغيير الأساسي (ق).
ملاحظة: يجب ألا تزيد هذه التغييرات عن حوالي 20 نقطة أساس من موقع القطع المتوقع CRISPR/CAS9، حيث تنخفض إعادة التركيب بشكل كبير على مسافات أكبر. - طلب ssODNs اثنين من البائع من اختيار وإعادة تعليق في الماء لجعل 1 ميكروغرام / ميكرولتر الأسهم. تخزين الأسهم في -20 درجة مئوية.
8. إعداد التغوط
- لنقل ssODN وplasmids CRISPR-CAS9، لوحة خط الخلية المستهدفة في طبق 6 جيدا على MEFs المشع ة للوصول إلى 70-80٪ من الملاءمة بعد حضانة O / N.
- إعداد رد فعل الانفّاطي كما هو موضح في الجدول 6. خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والحضانة لمدة 15 دقيقة في RT. إضافة خليط رد فعل الانفتيف إسقاط إلى الخلايا.
- بعد 48 ساعة، قم بإعداد الخلايا لفرز الخلايا كما هو موضح في القسم 5.3.
- اختيار المستعمرات ~ 10 أيام بعد طلاء خلايا واحدة باستخدام ماصة 200 درجة مئوية. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى بئر واحد من 24 أو 48 لوحة جيدا المغلفة سابقا مع الجيلاتين وMEFs المشع في hESC المتوسطة مع Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد. استخدم الـ 100 ميكرولتر المتبقية لعزل الحمض النووي كما هو موضح في القسم 6.
9. التحقق من وجود طفرات في مستعمرات واحدة
- للتحقق من التكامل الناجح للssODN، خذ 5 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول من كل مستعمرة لإجراء PCR باستخدام التمهيديات الفحص المصممة في القسم 2. تنقية منتجات PCR(جدول المواد)وإعداد هضم الإنزيم المقيد باستخدام موقع الإنزيم الفريد الذي تم إنشاؤه في ssODN.
ملاحظة: يتضمن هذا الهضم أيضًا حاجز إنزيم التقييد والتركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة لإنزيم تقييد في حجم 40 ميكرولتر. - مزيج رد الفعل عن طريق الأنابيب والحضانة في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لمدة 1-3 ساعة.
- تصور منتجات PCR المهضومة على 1.5٪ (ث / ف) EtBr agarose هلام الكهربائي في 80-100 V لمدة 40 دقيقة. إذا حدث التكامل الناجح للssODN، تسلسل طفرات محددة باستخدام التمهيدي متداخلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توليد الـ RNAs وفحص الإندلات
سيتم استنساخ كل gRNA في متجه بلازميد ويعبر عنها باستخدام المروج U6. يتم استخدام إنزيم تقييد AflII لخطي بلازميد (#41824) ويقع بعد المروج U6. يتم استنساخ الفرقة 100 نقطة أساس التي تم إنشاؤها بعد صلب اثنين 60 نقطة أساس oligos في ناقلات التعبير gRNA باستخدام تجميع الحمض النووي. وبمجرد توليد البلازميدات المرناة، يتم نقلها إلى hESCs أو iPSCs جنبا إلى جنب مع بلازميد GFP كريسبس-CAS9 (#44719 الجين). يتم فرز خلايا GFP+ بعد يومين لإثراء الخلايا المنقولة ومطلي (انظر القسم 5). بعد 10-14 يوما، يتم اختيار المستعمرات المشتقة من خلية واحدة واستخدامها لعزل الحمض النووي لفحص لتشكيل الإندل ولدت لكل gRNA. يتم استخدام تضخيم PCR مع التمهيديات التي تغطي موقع gRNA لتصور تشكيل الإندل باستخدام هلام أغاروز 2.5٪ (ث / الخامس) مع EtBr، الكهربائي في 70-90 V لمدة ساعة واحدة.
توليد 100 نقطة أساس ssODN لإدخال طفرات محددة
تم تصميم اثنين من القلة ssODN حول gRNA مع القطع الأكثر كفاءة. كل gRNA هو 100 نقطة أساس ويحتوي على طفرات صامتة، ويفضل أن يكون في تسلسل PAM، لتجنب إعادة قطع(الشكل 4A). يمكن أن تولد طفرة صامتة في تسلسل PAM موقع تقييد فريد، مما يساعد على فحص الاندماج الناجح في واحد أو اثنين من الأليلات(الشكل 4B).
نتائج إعادة تركيب ssODN
وباستخدام هذا البروتوكول، يظهر في الشكل 5تواتر استهداف الأحداث لستة جينات مختلفة باستخدام نهج ssODN. من خلال دراسة التعديل الجيني في موقع gRNA في كل من الأليلات، كان من المتوقع نتائج مختلفة بما في ذلك إعادة تركيب النمط البري (WT) ssODN، وssODN متحولة وتشكيل indel. المستنسخات في أيّ فقط واحدة [ألّل] تلقّى يكون قد خضع إعادة إدماج, كان النتيجة عاديّة أكثر [إيندل] تشكيل في الثاني [ألّل] (10-42%). وقد أدت عمليات الاستنساخ التي كانت تحتوي على تكامل الـ ssODNs في كل من الأليلات إلى ثلاث نتائج مختلفة: 1) دمج الـ WT ssODN في كل من الأليلات (0-8٪)، 2) دمج ssODN المتحولة في كل من الأليلات (0-25٪)، و3) التكامل بين كل من WT وssODN WT (8-21٪).
الشكل 1: نظرة عامة على توليد الحمض النووي الريبي. (أ)في المنطقة ذات الأهمية، تصميم أربعة gRNAs تنتهي في GG التي لا تزيد عن 20 نقطة أساس بصرف النظر. (B)كل gRNA من 23 نقطة أساس لديه تسلسل PAM من NGG في نهاية 3'. (C)وتتألف التمهيديات 60 نقطة بأكثر من تسلسل 40 بيوم مكملة للبلازميد العمود الفقري gRNA وتسلسل 20 bp gRNA دون تسلسل PAM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجدول الزمني للبروتوكول الخاص بفرز جيل واستنساخ الرنا. يظهر الجدول الزمني لتوليد gRNA واستنساخ الفرز. تصميم واستنساخ gRNA التعبير بلازميدس يستغرق ما يقرب من أسبوع واحد. بعد حوالي 48 ساعة من نقل التغوط إلى PSCs الإنسان، يتم فرز خلايا GFP + ومطلي في الحد من التخفيف. يجب أن تكون المستعمرات مرئية بين 7-10 أيام وفي اليوم 20 تقريبا، يمكن اختيار الحيوانات المستنسخة للفحص، والتوسع، وتأكيد التسلسل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختبار gRNA لكفاءة القطع. (أ)لبناء gRNA، يتم استئصال نطاق 100 نقطة أساس من هلام أغاروز 1.5٪. (B)بعد نقل الخلايا، يتم تصور التحقق من قطع gRNA باستخدام هلام أغاروز 2.5٪. يتم استخدام منتج PCR 180 bp للتحقق من تشكيل الإندل الذي يتم فيه تحليل عنصر تحكم غير مقطوع ومستنسخات مختلفة لتحولات النطاق التي تدل على تشكيل الإندل. (C)قد يكون gRNAs مختلفة كفاءة القطع المختلفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توليد وفحص الطفرات باستخدام اثنين من ssODNs. (أ)لتجنب إعادة قطع كريسبر-CAS9 من الأليلات المحررة، يمكن تعديل تسلسل PAM باستخدام طفرة G إلى A الصامتة. يضيف هذا التعديل موقع تقييد EcoRI فريد يمكن استخدامه للفحص. بالإضافة إلى هذه الطفرة الصامتة، يحتوي ssODN المتحول على التغيير الأساسي المطلوب. (ب)فحص إعادة تركيب oligonucleotide باستخدام EcoRI تقييد هضم الإنزيم يمكن أن يؤدي إلى ثلاث نتائج ممكنة: لا قطع ممثلة بنطاق WT في ~ 650 نقطة أساس، وإعادة تركيبفي أليل واحد ممثلة بنطاق غير المصقول من 650 نقطة أساس واثنين نطاقات أصغر أو الإدراج في كل من الأليلات التي تمثلها العصابات الصغيرة فقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: كفاءة التكامل والنتائج في نظام ssODN. تم تحديد كفاءة التكامل ونتائج نهج ssODN اثنين من خلال تحليل ستة جينات مختلفة. إذا تم الكشف عن واحد فقط ssODN متكاملة، عادة ما يتم الكشف عن تشكيل indel في الأليل الأخرى. وفي حالة تكامل اثنين من الشبكات الخاصة بالمواد المستنفدة للأوزون، تم الكشف عن ثلاث نتائج محتملة، كما هو مبين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| كاشف | حجم (ميكرولتر) |
| dNTPs (10 mM) | 0.4 |
| طاقة بوليميراز | 0.2 |
| المخزن المؤقت لـ PCR | 4.0 |
| القلة الصلبة (10 درجة مئوية) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
الجدول 1: شروط استنساخ الـ PCR لـ gRNA.
| برنامج PCR | |
| الخطوة 1 | 98 درجة مئوية ل30 s |
| الخطوة 2 | 98 درجة مئوية ل10 s |
| الخطوة 3 | 55 درجة مئوية ل20 s |
| الخطوة 4 | 72 درجة مئوية ل30 s |
| الخطوة 5 | كرر الخطوات 2-4 لمدة 30 دورة |
| الخطوة 6 | 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق |
| الخطوة 7 | عقد في 4 درجة مئوية |
الجدول 2: بارامترات ركوب الدراجات في الـ PCR.
| كاشف | حجم (ميكرولتر) |
| متجه gRNA الخطي باستخدام AflII (أي 50 نانوغرام/ميكرولتر) | 1.0 |
| 100 نقطة أساس من الحمض النووي (أي 250 نانوغرام/ميكرولتر) | 1.0 |
| ماجستير مزيج 2X | 10.0 |
| ddH2O | س. س. إلى 20 |
الجدول 3: شروط تفاعل التجميع gRNA.
| كاشف | المبلغ |
| DMEM/F12 | 50.0 ميكرولتر |
| pCas9_GFP ناقلات (إضافة بلازميد 44719) | 0.5 ميكروغرام |
| غارنا بلازميد | 0.5 ميكروغرام |
| الدهون الكاشف التغوط | 3.0 ميكرولتر |
الجدول 4: الخليط الرئيسي للمُفِّت في الخلية.
| hESC المتوسطة | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| DMEM/F12 | |
| استبدال المصل بالضربة القاضية (KDR) | 15 في المائة (خامسا/خامسا) |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | 100 درجة مئوية |
| بيروفات الصوديوم | 1 مليون متر مربع |
| الجلوتامين | 2 مليون متر مربع |
| بيتا-ميركابتوإيثانول | 0.1 مليون متر مربع |
| bFGF الإنسان (عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية) | 10 نانوغرام/مل |
| 10x بروتيناز K العازلة | |
| Tris.HCl الحموضة: 7.4 | 50 مليون متر مربع |
| كبريتات الأمونيوم الحموضة: 9.3 | 15 مليون متر مربع |
| إم جي إل2 | 2.5 مليون متر مربع |
| توين 20 | 0.1 في المائة (v/v) |
| بروتيناز K | 100 ميكروغرام/مل |
| كاشف | المبلغ |
| DMEM/F12 | 50.0 ميكرولتر |
| pCas9_GFP ناقلات (إضافة بلازميد 44719) | 0.5 ميكروغرام |
| غارنا بلازميد | 0.5 ميكروغرام |
| ssODN (0.5 ميكروغرام من كل ssODN) | 1.0 ميكروغرام |
| الدهون الكاشف التغوط | 3.0 ميكرولتر |
الجدول 6: SsODN خلية التغوط الخليط الرئيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، يظهر استخدام CRISPR-CAS9 جنبا إلى جنب مع اثنين من قوالب إصلاح ssODN لتوليد تغييرات محددة في الجينوم غير المتجانس أو المتجانس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى. وقد أدى هذا الأسلوب إلى نجاح توليد خطوط الخلايا المسببة للسرطان التي تعبر عن التغيرات الجينية غير المتجانسة بكفاءة تقارب 10%. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لكل من الـ ESCs البشري وiPSCs التي نمت على العوامل المتوسطة الدخل المشعة التي تدعم نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة بعد زراعة الخلايا في كثافة منخفضة بعد فرز الخلايا. يمكن تقليل موت الخلايا عن طريق الحفاظ على الخلايا مع 10 نانوغرام / مل bFGF و Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد. ومن الممكن أن يتكيف هذا البروتوكول مع نظم الثقافة الحرة المغذية، ولكن قد يكون من الضروري زيادة تحسينه.
كفاءة الانسياق يمكن أن تكون متغيرة من خط الخلية إلى خط الخلية، ولكن استخدام 3 ميكروغرام من الحمض النووي و 3 ميكرولتر من كاشف الانسياق الدهني أعطى عموما أفضل النتائج بين 0.5-2٪ كفاءة الانفذيب. ومع ذلك، إذا كانت كفاءة التغوط أقل، يمكن إجراء الأمثل لكمية الحمض النووي وكاشف الدهون. كما يمكن للمحقق اختبار كواشف أخرى للتغوط.
وسوف تختلف كفاءة توليد الإندل باختلاف الـ gRNAs ويمكن أن تتأثر بالموقع الجيني. وفي الغالبية العظمى من الحالات، إذا تم تصميم أربع مناطق من نوع "جي آر إن آر إن" تعمل بكفاءة، في حالة تصميم أربع مرات واحدة ومرات عديدة من مرتين إلى ثلاث مرات. بالإضافة إلى ذلك، قبل اختبار gRNAs، من المهم تحسين استراتيجية PCR لتصور الإندلمع مع منتج الحمض النووي بنطاق واحد نظيف. لفحص تحرير الجينوم القائم على ssODN، فمن الأفضل إضافة موقع إنزيم تقييدي عند إدخال طفرة صامتة ،ولكن إذا لم يكن ذلك ممكنا، يمكن استخدام حذف موقع إنزيم تقييد كذلك. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب إصلاح homology الموجهة بنشاط خلايا ركوب الدراجات وبالتالي فإن كثافة الخلايا من الثقافات قبل transfection أمر بالغ الأهمية لتعزيز تواتر استنساخ إصلاح باستخدام قالب ssODN المقدمة.
وترتبط بعض أوجه القصور في هذا البروتوكول بالوضع في الجينوم الذي سيتم تحريره. عند تعديل مناطق الترميز، ssODN تحمل الطفرات الصامتة منع Cas9 من إعادة قطع الموقع المحرر والطفرات الصامتة لا يغير المنتج البروتين. ومع ذلك، يصبح التحرير في المناطق التنظيمية أو غير الترميزية باستخدام هذه المنهجية أكثر صعوبة حيث أن الطفرات الصامتة غير ممكنة. إذا كانت القاعدة التي سيتم تحريرها جزءًا من تسلسل PAM، يمكن القيام بذلك بنجاح ولكن يمكن إنشاء تغييرات متجانسة فقط بكفاءة.
البروتوكول الموضح هنا مفيد لتوليد أو تصحيح طفرات الترميز heterozygous دون إضافة indels غير مقصودة في الأليل الثاني. وسييسر هذا البروتوكول استخدام المراكز البشرية للدعم في الأحياء لدراسة طائفة واسعة من المواضيع من البيولوجيا الإنمائية إلى نمذجة الأمراض الوراثية. استخدام خطوط isogenic أمر بالغ الأهمية لتحديد وظائف طفرة الترميز معينة دون آثار مربكة بسبب الخلفيات الوراثية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI)، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال المنح U01HL099656 (P.G. وD.L.F.) وU01HL134696 (P.G. و D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
