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Neuroscience

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que médiateurs immunitaires dans des microenvironnements spécifiques.

Abstract

L’état neuroinflammatoire du système nerveux central (SNC) joue un rôle clé dans les conditions physiologiques et pathologiques. Les microglies, les cellules immunitaires résidentes dans le cerveau, et parfois les macrophages infiltrés dérivés de la moelle osseuse (BMDM), régulent le profil inflammatoire de leur microenvironnement dans le SNC. Il est maintenant admis que les populations extracellulaires de vésicule (EV) des cellules immunitaires agissent comme médiateurs immunitaires. Ainsi, leur collecte et leur isolement sont importants pour identifier leur contenu, mais aussi évaluer leurs effets biologiques sur les cellules bénéficiaires. Les données actuelles mettent en évidence les exigences chronologiques pour l’isolement des ev des cellules de microglies ou des macrophages sanguins, y compris les étapes ultracentrifugation et chromatographie de taille-exclusion (SEC). Une analyse protéomique non ciblée a permis la validation des signatures protéiques comme marqueurs EV et a caractérisé le contenu biologiquement actif de EV. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont également été utilisés fonctionnellement sur la culture primaire des neurones pour évaluer leur importance en tant que médiateurs immunitaires dans la excroissance neurite. Les résultats ont montré que les véhicules électriques dérivés de microglies contribuent à faciliter la excroissance neurite in vitro. En parallèle, les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été fonctionnellement utilisés comme médiateurs immunitaires dans les cultures sphéroïdes des cellules de glioma de C6, les résultats montrant que ces véhicules électriques contrôlent l’invasion de cellules de gliome in vitro. Ce rapport met en évidence la possibilité d’évaluer les fonctions des cellules immunitaires à médiation EV, mais aussi de comprendre les bases moléculaires d’une telle communication. Ce déchiffrement pourrait favoriser l’utilisation de vésicules naturelles et/ou la préparation in vitro de vésicules thérapeutiques afin d’imiter les propriétés immunitaires dans le microenvironnement des pathologies du SNC.

Introduction

Beaucoup de neuropathologies sont liées à l’état neuro-inflammatoire qui est un mécanisme complexe qui est de plus en plus considéré, mais toujours mal compris parce que les processus immunitaires sont divers et dépendent de l’environnement cellulaire. En effet, les troubles du SNC n’impliquent pas systématiquement les mêmes signaux d’activation et les mêmes populations de cellules immunitaires et, par conséquent, les réponses pro ou anti-inflammatoires sont difficiles à évaluer comme causes ou conséquences de pathologies. Les macrophages résidents du cerveau appelés "microglies" semblent être à l’interface entre le système nerveux et le système immunitaire1. Les microglies ont une origine myéloïde et sont dérivées du sac jaune pendant l’hématopoiesis primitive pour coloniser le cerveau, tandis que les macrophages périphériques sont dérivés du foie foetal pendant l’hématopoiesis définitif pour devenir macrophages périphériques2. Les cellules de microglies communiquent avec les neurones et les cellules gliales dérivées de neurones telles que les astrocytes et les oligodendrocytes3. Plusieurs études récentes ont démontré que les microglies sont impliquées dans la plasticité neuronale pendant le développement de CNS et l’homéostasie adulte de tissu, et également dans l’état inflammatoire lié aux maladies neurodegenerative4,,5. Dans le cas contraire, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique peut être compromise dans d’autres pathologies du SNC. Les réponses immunitaires, en particulier dans le cancer multiforme de glioblastome, ne sont pas soutenues seulement par des cellules de microglie que la barrière hémato-encéphalique est réorganisée par des processus angiogéniques et la présence des vaisseaux lymphatiques6,7. Par conséquent, une grande infiltration de macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDM) se produit dans la tumeur de cerveau à travers les mécanismes d’angiogenèse tumeur-dépendante8. Les cellules cancéreuses exercent une influence significative sur les MMO infiltrés menant aux propriétés immunosuppressives et à la croissance de tumeur9. Ainsi, la communication entre les cellules immunitaires et leur microenvironnement cérébral est difficile à comprendre car l’origine cellulaire et les signaux d’activation sont divers10,11. Il est donc intéressant d’appréhender les fonctions des signatures moléculaires associées aux cellules immunitaires dans des conditions physiologiques. À cet égard, la communication cellulaire entre les cellules immunitaires et le microenvironnement cellulaire peut être étudiée par la libération de vésicules extracellulaires (VE).

Les véhicules électriques sont de plus en plus étudiés dans la régulation des fonctions immunitaires dans des conditions saines ainsi que pathologiques12,13. Deux populations, exosomes et microvess, peuvent être prises en compte. Ils présentent différentes gammes de biogenèse et de taille. Les exosomes sont des vésicules de 30 à 150 nm de diamètre et sont générées à partir du système endosomal et sécrétées lors de la fusion des corps multivesculaires (MVBs) avec la membrane plasmatique. Les microsévères ont environ 100 à 1 000 nm de diamètre et sont générées par un bourgeonnement extérieur de la membrane plasmatiquecellulaire 14. Étant donné que la discrimination exosome versus microvesicle est encore difficile à réaliser selon la taille et les modèles moléculaires, nous n’utiliserons le terme DEV que dans le présent rapport. La communication associée à l’EV dans le SNC représente un mécanisme ancestral puisque des études ont montré leur implication dans des espèces d’invertébrés, y compris les nématodes, les insectes ou les annelides15,16. En outre, les résultats montrant que les véhicules électriques peuvent communiquer avec des cellules de différentes espèces démontrent que ce mécanisme est un système de verrouillage des clés, basé d’abord sur la reconnaissance des molécules de surface entre les vésicules et les cellules de receveur, puis permettant l’absorption des médiateurs16,17. En effet, les véhicules électriques contiennent de nombreuses molécules comme les protéines (par exemple, les enzymes, la transduction de signaux, le facteur de biogenèse), les lipides (p. ex. le céramide, le cholestérol) ou les acides nucléiques (p. ex., ADN, ARNm ou miARN) agissant comme régulateurs directs ou indirects des activités cellulairesbénéficiaires 14. C’est pourquoi des études méthodologiques ont également été réalisées sur des cellules immunitaires pour isoler les véhicules électriques et caractériser pleinement leurs signatures protéiques18,19.

Les premières études ont démontré la libération d’exosomes de la microglie de rat de culture primaire comme mécanisme inductible suivant une activation Wnt3a- ou sérotonine-dépendante20,21. Fonctionnellement dans le SNC, les véhicules électriques dérivés de microglies régulent la libération de vésicule synaptique par des terminaux présynaptiques dans les neurones contribuant au contrôle de l’excitabilité neuronale22,23. Les véhicules électriques dérivés de microglies pourraient également propager la réponse inflammatoire cytokines-négociée dans les grandes régions du cerveau24,25. Fait important, les ligands divers pour la famille des récepteurs de péage-comme pourrait activer des productions spécifiques de véhicules électriques dans la microglie26. Par exemple, des études in vitro montrent que les lignées cellulaires BV2 de microglie activées par LPS produisent un contenu EV différentiel comprenant des cytokines pro-inflammatoires27. Par conséquent, la diversité fonctionnelle des sous-populations de cellules immunitaires dans le SNC, les microglies et les BMDM infiltrés, pourrait être évaluée par leurs propres populations de véhicules électriques, y compris l’impact des véhicules électriques sur les cellules bénéficiaires et l’identification du contenu des véhicules électriques.

Nous avons déjà décrit des méthodes pour évaluer les propriétés fonctionnelles des véhicules électriques dérivés des microglies et des BMDM après leur isolement16,19. Dans le présent rapport, nous proposons d’évaluer indépendamment l’effet des véhicules électriques dérivés de microglies sur la excroissance neurite, et l’effet des véhicules électriques dérivés du macrophage sur le contrôle des agrégats de cellules de gliome. Cette étude propose également une vaste analyse protéomique des fractions EV afin de valider la procédure d’isolement des ev et d’identifier les signatures de protéines biologiquement actives. Les effets bénéfiques et le déchiffrement moléculaire du contenu EV pourraient aider leur manipulation possible et l’utilisation comme agents thérapeutiques dans les troubles du cerveau.

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Protocol

1. Culture primaire des Microglies/Macrophages

  1. Culture primaire de la microglie
    1. Microglie primaire de rat commercial de culture (2 x 106 cellules) (voir la Table des Matériaux) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum sans exosome, 100 U/mL de pénicilline, 100 'g/mL streptomycine, et 9,0 g/L de glucose à 37 'C et 5% deCO2%.
    2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 48 h et procéder à l’isolement des véhicules électriques.
  2. Culture primaire des macrophages
    1. Macrophages primaires de rat commercial de culture (1 x 106 cellules) dans le milieu fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux) à 37 oC et 5% de CO2, avec sérum exosome-libre.
    2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 24 h et procéder à l’isolement des véhicules électriques.

2. Isolement des véhicules électriques

  1. Pré-isolement des véhicules électriques du milieu conditionné
    1. Transférer le milieu de culture conditionné des cultures de microglies ou de macrophage (étapes 1.1.2 ou 1.2.2) dans un tube conique.
    2. Centrifugeuse à 1200 x g pendant 10 minutes à température ambiante (RT) pour pelleter les cellules.
    3. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique. Centrifugeuse à 1200 x g pendant 20 min à RT pour éliminer les corps apoptotiques.
    4. Transférer le supernatant dans un tube en polycarbonate de 10,4 ml et transférer le tube dans un rotor Ti de 70,1. Ultracentrifuge à 100.000 x g pendant 90 min à 4 oC pour pelleter les véhicules électriques.
    5. Jetez le supernatant et réutilisez la granulé contenant des véhicules électriques dans 200 L de 0,20 m de tampon de phosphate filtré (PBS).
  2. Isolement des véhicules électriques
    1. Préparation de la colonne d’exclusion de taille maison (SEC)
      1. Vider une colonne de chromatographie en verre (longueur : 26 cm; diamètre : 0,6 cm) (voir la Table des Matériaux),lavez-la et stérilisez-la.
      2. Placez un filtre de 60 m au bas de la colonne.
      3. Empilez la colonne avec la matrice de base de filtration de gel d’agarose liée à la croix pour créer une phase stationnaire d’un diamètre de 0,6 cm et d’une hauteur de 20 cm.
      4. Rincer la phase avec 50 ml de PBS filtré de 0,20 m. Conserver à 4 oC pour être utilisé plus tard si nécessaire.
    2. Placez le granule EV réutilisé au-dessus de la phase stationnaire de la colonne SEC.
    3. Recueillir 20 fractions séquentielles de 250 ll tout en continuant à ajouter 0,20 m PBS filtré sur le dessus de la phase stationnaire pour empêcher le séchage de la colonne. Conservez les fractions à -20 oC si nécessaire.
      REMARQUE: Un stockage plus long d’une semaine peut être effectué à -80 oC pour maintenir l’intégrité evs pour l’analyse moléculaire.
  3. Analyse de spectrométrie de masse assistée par matrice au laser (MALDI) des fractions de la SEC
    1. Procéder à l’isolement EV tel que décrit à l’article 2.2.
    2. Réutilisez la granule EV avec 200 L de solution de mélange d’étalonnage de peptide (voir la Table des Matériaux).
    3. Procéder à la collecte ev comme décrit dans les sections 2.2.1 à 2.2.3.
    4. Sécher complètement la fraction avec un concentrateur à vide.
    5. Reconstituer les fractions avec 10 L d’acide trifluorocéacique (TFA) de 0,1 %.
    6. Mélanger 1 L de fraction reconstituée avec 1 L de matrice d’acide hydroxycinnamique (HCCA) sur une plaque cible en acier poli MALDI.
    7. Analyser toutes les fractions à l’égard d’un spectromètre de masse MALDI.
    8. Analyser les spectres générés avec un logiciel dédié (voir Tableau des matériaux).

3. Caractérisation des véhicules électriques

  1. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    REMARQUE :     L’analyse NTA est effectuée avec un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux)et une pompe à seringues automatisée.
    1. Faire une dilution (gamme de 1:50 à 1:500) de chaque fraction SEC de l’étape 2.2.3 avec 0.20 'm filtré PBS.
    2. Vortex la solution pour éliminer les agrégats EV.
    3. Mettez la solution diluée dans une seringue de 1 ml et placez-la dans la pompe automatisée de seringue.
    4. Ajuster le réglage de la caméra pour atteindre le niveau de gain (3) et le niveau de la caméra (13).
    5. Cliquez sur Run et lancez le script suivant.
      1. Chargez l’échantillon dans la chambre d’analyse (taux de perfusion : 1 000 pour 15 s).
      2. Diminuer et stabiliser le débit de vitesse pour l’enregistrement vidéo (taux de perfusion : 25 pour 15 s). Capturez trois vidéos consécutives de 60 s du flux de particules.
      3. Ajuster le niveau de la caméra (13) et le seuil de détection (3) avant l’analyse des vidéos. Cliquez sur Paramètres Ok pour commencer l’analyse et cliquez sur Export lorsque l’analyse est effectuée.
    6. Entre chaque analyse de fraction, laver avec 1 mL de PBS filtré de 0,20 m.
  2. Analyse de la microscopie électronique (EM)
    1. Isoler les véhicules électriques tels que décrits à la section 2.
      REMARQUE: Les conditions stériles ne sont pas requises.
    2. Répétez la section 3.1 pour quantifier les véhicules électriques.
      REMARQUE: Seules des fractions positives seront utilisées pour l’analyse EM.
    3. Utilisez un filtre centrifuge de 50 kDa (voir tableau des matériaux)pour concentrer les fractions SEC contenant des EV.
    4. Résuspendent des véhicules électriques concentrés dans 30 L de 2% de paraformaldéhyde (PFA).
    5. Charger 10 L de l’échantillon sur une grille de cuivre recouverte de carbone.
    6. Incuber pendant 20 min dans un environnement humide.
    7. Répétez les étapes 3.2.5 et 3.2.6 pour une bonne absorption de l’échantillon sur la grille.
    8. Transférer la grille dans une baisse de 1% glutaraldéhyde dans PBS pendant 5 minutes à RT.
    9. Laver l’échantillon avec de l’eau ultrapure plusieurs fois.
    10. Comparez l’échantillon pendant 10 min sur la glace avec un mélange de 4 % d’acétate d’uranyl et de 2 % de méthylcellulose (1:9, v/v). Supprimer l’excès du mélange à l’aide d’un papier filtre.
    11. Séchez l’échantillon et observez-le sous un microscope électronique de transmission à 200 kV (voir la Table des Matériaux).
  3. Analyse de tache occidentale
    1. Extraction de protéines
      1. Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.3 pour isoler et concentrer les véhicules électriques.
      2. Mélanger 50 l de tampon RIPA (150 mM de chlorure de sodium [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N,N,N', acide tétraacetic [EGTA], 2 mM Ethylenediamine-tétraacetic acid [EDTA], 100 mM de fluorure de sodium [NaF], 10 mM de sodium pyrophosphate, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluorure [PMSF], 1x inhibiteur de protéase) avec l’échantillon EV (25 L résultant de la concentration DE EV sur le filtre) pour 5 min sur la glace pour extraire des protéines.
      3. Sonicate pour 5 s (amplitude: 500 W; fréquence: 20 kHz), 3 fois sur la glace.
      4. Enlever les débris vésiculaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 10 min, à 4 oC.
      5. Recueillir le supernatant et mesurer la concentration de protéines avec la méthode d’analyse de protéines Bradford.
    2. Electrophoresis de gel de polyacrylamide de sulfate de dodéthyle de sodium (SDS-PAGE) et ballonnement occidental
      1. Mélanger les extraits de protéines (30 g) avec un tampon d’échantillon Laemmli de 5c (v/v).
      2. Chargez le mélange de protéines sur un gel polyacrylamide de 12 %.
      3. Migrer les protéines dans le gel avec tampon TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM glycine, et 0,1% SDS), à 70 V pour 15 min et 120 V pour 45 min.
      4. Transférer les protéines sur la membrane de nitrocellulose avec un système semi-sec à 230 V pendant 30 min.
      5. Saturate la membrane pour 1 h à RT avec tampon de blocage (0,05% Tween 20 w/v, 5% de lait en poudre w/v en 0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. Incuber la membrane pendant la nuit à 4 oC avec la protéine anti-humaine monoclonale anti-choc 90 (HSP90) anticorps dilués dans le tampon de blocage (1:100).
      7. Laver la membrane trois fois avec PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) pour 15 min.
      8. Incuber la membrane pendant 1 h à RT avec le raifort de chèvre peroxidase-conjugué anticorps secondaires IgG dilué dans le tampon de blocage (1:10,000).
        REMARQUE: Un contrôle négatif est effectué à l’aide d’anticorps secondaires seul.
      9. Répétez l’étape de lavage (étape 3.3.2.7).
      10. Révéler la membrane avec une chimioluminescence améliorée (ECL) kit de substrat ballonnement occidental (voir Tableau des matériaux).
  4. Analyse protéomique
    1. Extraction des protéines et digestion en gel
      1. Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.3 pour isoler et concentrer les véhicules électriques. Répéter l’étape 3.3.1 pour l’extraction de protéines EV.
      2. Effectuez la migration des protéines dans le gel d’empilement d’un gel polyacrylamide de 12 %.
      3. Fixer les protéines dans le gel avec le bleu coomassie pendant 20 min à RT.
      4. Accisez chaque morceau de gel coloré et coupez-le en petits morceaux de 1 mm3.
      5. Laver successivement les morceaux de gel avec 300 ll de chaque solution : eau ultrapure pendant 15 min, 100% acetonitrile (ACN) pour 15 min, 100 m d’ammonium bicarbonate (NH4HCO3) pour 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) pour 15 min, et 100% ACN pour 5 min en remuant continu.
      6. Sécher complètement les morceaux de gel avec le concentrateur sous vide.
      7. Effectuez une réduction des protéines avec 100 ll de 100 mM NH4HCO3 contenant 10 mM dithiothreitol pour 1 h à 56 oC.
      8. Effectuer l’alkylation des protéines avec 100 L de 100 mM NH4HCO3 contenant 50 mM iodoacetamide pendant 45 min dans l’obscurité à RT.
      9. Laver successivement les morceaux de gel avec 300 lL de chaque solution : 100 mM de NH4HCO3 pour 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) pour 15 min, et 100% ACN pendant 5 min avec une agitation continue.
      10. Sécher complètement les morceaux de gel avec un concentrateur sous vide.
      11. Effectuez la digestion des protéines avec 50 L de trypsine (12,5 g/ml) en 20 mM NH4HCO3 pendant la nuit à 37 oC.
      12. Extraire les protéines digérées du gel avec 50 L de 100% ACN pendant 30 min à 37 oC, puis 15 min à RT en remuant continuellement.
      13. Répétez les procédures d’extraction suivantes deux fois : 50 L de TFA de 5 % dans la solution NH4HCO3 de 20 mM pour 20 min en remuant continuellement.
      14. Ajouter 100 L de 100% ACN pendant 10 min en remuant continuellement.
      15. Protéines digérées sèches avec un concentrateur sous vide et une résuspendance dans 20 L de 0,1% DT.
      16. Desalt l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette de 10 L avec un support de phase inverse C18 pour désalting et concentrer les peptides (voir la Table des Matériaux) et elute peptides avec ACN:0.1% d’acide formique (FA) (80:20, v/v).
      17. Séchez complètement l’échantillon avec un concentrateur sous vide et résutilisez-le dans 20 L d’ACN:0,1% FA (2:98, v/v) pour la spectrométrie de masse tandem de chromatographie liquide (LC-MS/MS).
    2. Analyse LC-MS/MS
      1. Chargez le peptide digéré dans l’instrument LC-MS/MS et effectuez l’analyse de l’échantillon et des données selon les paramètres décrits en détail ailleurs42.
    3. Analyse des données brutes
      1. Traiter les données de spectrométrie de masse pour identifier les protéines et comparer les protéines identifiées de chaque échantillon avec un logiciel de protéomique quantitative à l’aide de paramètres standard.
      2. Export, en utilisant des paramètres standard, la liste des protéines exclusives et surreprésentées provenant d’échantillons positifs EV dans un logiciel prévoyant les réseaux protéiques et les processus biologiques.
      3. Comparez la liste des protéines identifiées dans les fractions avec les 100 principaux marqueurs EV de la base de données En libre accès Exocarta (voir le Tableau des matériaux).

4. Effets d’e-ve fonctionnels Assay

  1. Essai de excroissance neurite sur la ligne de cellules PC-12
    1. Culture PC12 lignée cellulaire en moyenne DMEM complète (2 mM L-glutamine, 10% sérum de cheval fœtal (FHS), 5% sérum bovin fœtal (FBS), 100 UI/mL pénicilline, 100 g/mL streptomycine).
      REMARQUE: Les sérums sont exosome libre dans toute la procédure.
    2. Ajouter un verre de couverture (tous les puits) dans une assiette de 24 puits; enrober l’assiette de poly-D-lysine (0,1 mg/mL) et de graines 260 000 cellules/puits.
    3. Incuber les cellules à 37 oC sous 5% de CO2.
    4. Après 24 h d’incubation, changez le milieu au milieu de différenciation DMEM (DMEM avec 2 mM L-glutamine, 0,1% FHS, 100 UI/mL penicillin, 100 g/mL streptomycine) avec 1 x 106 microglia EV (à partir de l’étape 1.1.2).
      REMARQUE: L’état de contrôle est effectué sans microglie e-temps dans le milieu de différenciation.
    5. Au jour 4 après l’ensemencement, chargez tous les puits avec 100 L de milieu DMEM complet.
    6. Au jour 7 après l’ensemencement, fixez les cellules avec 4% de PFA pendant 20 min à RT et rincez trois fois (10 min chacune) avec PBS.
    7. Tacher les cellules avec de la phalloidine conjuguée à la rhodamine pendant 30 min à 4 oC et rincer 3 fois (10 min chacune) avec PBS.
    8. Tacher les cellules avec Hoechst dilué 33342 (1:10,000) pendant 30 min à RT et rincer 3 fois (10 min chacun) avec PBS.
    9. Monter le verre de couverture sur un toboggan avec le milieu de montage fluorescent (voir Tableau des matériaux).
    10. Analyser la diapositive à l’égard d’un microscope confocal, prendre 5 images aléatoires de chaque diapositive.
    11. Mesurer la excroissance neurite à l’aide d’un logiciel de quantification automatisé (longueur totale de neurite) tel que décrit en détail ailleurs43.
  2. Excroissance neurite sur les neurones primaires de rat
    1. Enrober une lame de verre de 8 puits de poly-D-lysine (0,1 mg/ml) et de stratifié (20 g/mL).
    2. Culture rat commercial neurones primaires dans le milieu de culture approprié (voir Tableau des matériaux) en placage 50.000 cellules par puits et incubation des cellules à 37 oC sous 5% CO2 pour 48 h.
      REMARQUE: Les sérums sont exosome-libres dans toute la procédure.
    3. Ajouter 1 x 106 microglies DE vitesses à la culture neuronale moyenne et incuber à 37 oC sous 5% de CO2 pour 48 h de plus.
      REMARQUE: L’état de contrôle est effectué sans microglie EVs dans le milieu de la culture neuronale.
    4. Suivez les étapes 4.1.6 à 4.1.9 pour fixer et tacher les cellules.
    5. Suivez les étapes 4.1.10 et 4.1.11 pour analyser la diapositive.
  3. Invasion de cellules Glioma
    1. Cellules de gliome de rat de C6 de réanimée dans le milieu complet de DMEM (DMEM avec 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotiques) contenant 5% de collagène à une concentration finale de 8.000 cellules en 20 'L.
      REMARQUE: Les sérums sont exosome-libres dans toute la procédure.
    2. Placez 5 ml de PBS AU fond d’un plat de culture tissulaire de 60 mm. Inverser le couvercle et déposer des gouttes de 20 l (8 000 cellules) de suspension cellulaire sur le fond du couvercle.
    3. Inverser le couvercle sur la chambre inférieure remplie de PBS et incuber la plaque à 37 oC et 5% de CO2 pour 72 h jusqu’à ce que des sphéroïdes cellulaires soient formés.
    4. Ajouter 1 x 108 véhicules électriques macrophage (de l’étape 1.2.2) à un mélange de collagène de 2,2 mg/mL (2 ml de solution de type I de collagène bovin [3 mg/mL] avec 250 L de milieu essentiel minimum de 10x (MEM) et 500 L de 0,1 M d’oxyde de sodium).
      REMARQUE: L’état de contrôle est effectué sans véhicules électriques macrophage dans le mélange de collagène.
    5. Répartissez le mélange de collagène contenant des véhicules électriques dans une plaque de 24 puits pour intégrer les sphéroïdes cellulaires.
    6. Implanter les sphéroïdes cellulaires nouvellement formés au centre de chaque puits.
    7. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 oC et 5% de CO2 pour solidifier le gel.
    8. Par la suite, superposer 400 L de support DMEM complet sur la matrice de collagène dans chaque puits.
    9. Incuber le système complet pour un total de 6 jours à 37 oC et 5% de CO2.
      REMARQUE: L’invasion cellulaire hors du sphéroïde est surveillée par la photographie numérique à l’aide d’un microscope lumineux inversé à l’aide d’un objectif de 4x/0.10 N.A.
    10. Acquérir des images de chaque puits tous les jours.
    11. Traiter les images et quantifier l’invasion des zones sphéroïdes cellulaires à l’aide du logiciel décrit précédemment en détail42.
      REMARQUE: Les zones d’invasion et de sphéroïde ont été normalisées pour chaque jour aux zones d’invasion et de sphéroïde mesurées le jour 0.

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Representative Results

L’un des principaux défis à l’attribution des effets biologiques aux vésicules extracellulaires (VE) est la capacité d’isoler les véhicules électriques de l’ensemble du milieu de la culture. Dans ce rapport, nous présentons une méthode utilisant l’ultracentrifugation (UC) et la chromatographie de taille-exclusion (SEC) qui est couplée à l’analyse à grande échelle des signatures de protéine pour valider des marqueurs EV et identifier des composés bioactifs. Les véhicules électriques dérivés du macrophage ou des microglies ont été isolés du milieu conditionné après une culture de 24 h ou 48 h respectivement(figure 1).

Figure 1
Figure 1 : Stratégies de collecte et d’isolement extracellulaires de Vesicle (EV). Les corps apoptotiques et les débris cellulaires ont été séparés du milieu microglia-ou macrophage conditionné par des étapes successives de centrifugation. Du supernatant, les véhicules électriques ont été isolés par ultracentrifugation (UC). La pastille UC contenant des véhicules électriques a été chargée sur la colonne et séparée par la chromatographie de taille-exclusion (SEC) dans 20 fractions eluted différentes. Comme indiqué dans les autres étapes (microscopie électronique, analyse de suivi des nanoparticules et analyse protéomique), les fractions SEC ont été mises en commun et organisées en 1F-EV-, 2F-EV et 3F-EV-. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La méthode a suivi les étapes successives de centrifugation : la première à enlever les cellules et la seconde pour enlever les débris cellulaires et les corps apoptotiques. Puis, le supernatant a été transféré dans un nouveau tube pour effectuer une ultracentrifugation à 100.000 x g pendant 90 min. Les vésicules ont été recueillies avec les agrégats de protéines dans le granule final de l’UC. Une colonne SEC a été utilisée pour séparer les composés en fonction de leur taille et enlever les agrégats(figure 1). Afin de confirmer l’isolement des véhicules électriques, chaque fraction de la SEC a suivi une analyse de suivi des nanoparticules(figure 2A).

Figure 2
Figure 2 : Analyse des fractions de la SEC. (A) Analyse de suivi des nanoparticules (NTA) des fractions SEC. Le nombre total de particules dans chaque fraction SEC est présenté avec des graphiques à barres. Les graphiques à barres orange montrent les trois fractions EVMD consécutives (F5-F7). (B, C) Les captures d’écran de la chambre NTA montrent des différences significatives dans le flux de particules entre les fractions SEC. (D) Analyse complémentaire de spectrométrie de masse MALDI. À partir d’une autre granule UC contenant des véhicules électriques, un ensemble de peptide de commande standard a été ajouté avant la séparation de la SEC afin de valider les performances de la stratégie de la SEC. Chaque fraction de SEC a été analysée avec l’ionisation de desorption de laser assistée de matrice - temps de vol (MALDI-TOF) pour déterminer des fractions standard-positives. Dans les neuf premiers spectres (fractions 1 à 9), aucun signal n’a été observé. La détection de ces normes libres a été possible dans les fractions suivantes (fractions 10 à 20) confirmant la capacité de la procédure SEC à séparer les véhicules électriques (F5-F7) des composants solubles (F10-F20). (E) Analyse occidentale de tache des fractions de SEC comme analyse préliminaire de marqueur EV. Les fractions EVMD (F5-F7) ont été regroupées sous forme d’un seul échantillon (2F-VEMD) tandis que les fractions EV (F1-F4 et F8-F20 respectivement) ont été regroupées dans deux autres échantillons appelés 1F-EV- et 3F-EV-. Les résultats ont montré la présence d’un signal de protéine de choc thermique 90 (HSP90) (marqueur positif EV) dans 2F-EVMD, et aussi dans le lysate cellulaire comme contrôle positif, comparé aux autres fractions (1F-EV- et 3F-EV-). (F, G) Analyse de microscopie électronique de l’échantillon positif EV (2F-EVMD). L’observation sous deux grossissements successifs a révélé la présence de véhicules électriques dans une gamme de taille d’environ 100 nm (flèches blanches) et d’environ 400 nm (pointe de flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le nombre de particules était significativement plus élevé dans les fractions 5, 6 et 7 que dans les précédentes (F1-F4) et suivantes (F8-F20). Il a été possible de voir un flux de particules dans ces fractions, même si quelques particules ont été observées dans les fractions suivantes(figure 2B,C). Cette séparation n’empêche pas la possibilité que des fractions autres que le F5-F7 puissent contenir une petite quantité de vésicules, ou même que les fractions F5 à F7 riches en véhicules électriques puissent contenir des contaminants moléculaires. Pour au moins s’assurer que les fractions F5-F7 sont exemptes de contamination des molécules de co-eluting, il était nécessaire de suivre l’elution de cours de temps des différents composés dans la procédure SEC. Pour ce faire, des normes de peptide de contrôle ont été ajoutées à une pastille UC similaire à celle précédemment utilisée. Cette préparation a de nouveau été séparée à l’aide de la procédure SEC. Ensuite, une matrice a aidé l’ionisation de désorption laser — l’analyse de spectrométrie de masse de temps de vol (MALDI) a été effectuée afin d’identifier les fractions de LA SEC dans lesquelles les normes ont été adoptées (figure 2D). En raison de la gamme de masse, seuls les produits ionisés des normes de peptide ont été suivis dans cette analyse. Les résultats ont montré que ces produits étaient détectables dans les fractions 10 à 20, ce qui démontre que toute protéine soluble ne peut pas être élucidée dans les mêmes fractions que les véhicules électriques (F5-F7). Ces résultats ont confirmé l’intérêt de cette approche dans la séparation des véhicules électriques des composants non EV. Même en supposant que les fractions F8-F20 pouvaient contenir une fraction résiduelle de véhicules électriques, nous avons décidé dans les expériences suivantes de combiner les fractions positives EV (F5-F7) dans un seul échantillon appelé 2F-EV. Nous avons également combiné les autres fractions de la SEC en deux échantillons appelés 1F-EV- (F1-F4) et 3F-EV- (F8-F20). Nous avons regroupé trois échantillons pour plusieurs raisons. Tout d’abord, le nombre de fractions de la SEC augmenterait le temps des analyses moléculaires mais aussi des études in vitro fonctionnelles. Les fractions DE SEC EV-positives présentent séparément des nombres de particules plus faibles et compromettent également la détection des composés moléculaires. De la même manière, il a été jugé plus judicieux de regrouper les fractions F8-F20 pour concentrer, si nécessaire, les vésicules résiduelles et vérifier leur présence par une analyse préliminaire de tache occidentale contre HSP90, un marqueur EV. Fait intéressant, un signal positif pour HSP90 a été détecté dans la fraction 2F-EV, également dans la cellule lysate comme contrôle positif, mais pas dans 1F-EV- et 3F-EV- échantillons(figure 2E et la figure supplémentaire S1 comme contrôle). Cette analyse confirme l’intérêt de 2F-EVmd seulement et la bonne gestion des fractions précédentes de la SEC. Pour affirmer l’isolement des véhicules électriques, une expérience supplémentaire utilisant la microscopie électronique n’a analysé que l’échantillon 2F-EVMD et a permis l’observation des véhicules électriques avec une morphologie typique et une hétérogénéité de taille comprise entre 100 et 400 nm(figure 2F,G).

Une autre étape clé de la validation a été l’analyse protéomique(figure 3). Nous avons développé une analyse de spectrométrie de masse entière avec de multiples objectifs : (i) confirmer l’isolement des véhicules électriques avec la détection d’un nombre élevé de marqueurs EV dans 2F-EVMD, (ii) éventuellement identifier les protéines contaminantes dans les échantillons négatifs EV (1F-EV- et 3F-EV-) et (iii) caractériser le contenu protéique des véhicules électriques soutenant leurs activités biologiques.

Figure 3
Figure 3 : Analyse protéomique des échantillons EV-positifs et EV-négatifs. (A) Après trois isolements evvaux indépendants des préparations similaires de cellules de microgliales, les échantillons 1F-EV-, 2F-EV ET 3F-EV- ont été chargés pour l’électrophoresis de gel polyacrylamide de sulfate de dodéthyle de sodium (SDS-PAGE) et ont migré jusqu’à ce que le gel d’empilage concentre des protéines afin de réaliser leur digestion en gel. Les peptides qui en ont résulté ont ensuite été analysés par spectrométrie de masse tandem de chromatographie liquide (LC-MS/MS) pour identifier les protéines correspondantes. (B) Comparaison des protéines identifiées entre les échantillons 1F-EV et 2F-EVMD montrant des protéines communes dans les deux fractions (19) et les protéines exclusivement détectées dans la fraction 2F-EVMD (522). La carte thermique montre la représentation relative où toutes les protéines communes entre les triplicates 1F-EV et 2F-EVMD étaient surreprésentées (rouge) dans les échantillons de 2F-EVMD. (C) Comparaison des protéines identifiées entre les fractions 2F-EV ET 3F-EV- montrant des protéines communes entre les triplicates (113) et les protéines exclusivement représentées (428 en 2F-EV ET 11 en 3F-EV-). La carte thermique montre la représentation relative dans deux grappes. L’un (cluster A) présente 5 protéines surreprésentées dans l’échantillon 3F-EV et une seconde (cluster B) présente 108 protéines surreprésentées dans 2F-EVMD. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

À partir de supports conditionnés par les cellules, la procédure UC et SEC a conduit à trois échantillons 1F-EV-, 2F-EV ET 3F-EV-. Les protéines correspondantes ont été extraites et concentrées par l’électrophoresis du gel en polyacrylamide de sulfate de dodéthyle de sodium (SDS-PAGE). Après une courte migration dans le gel d’empilement, les échantillons ont été prélevés par une excision de bande, transférée dans des tubes distincts pour être digérées dans le gel. Les produits ont été séparés par une chromatographie en phase inversée en ligne directement couplée à un spectromètre de masse pour analyse(figure 3A).

Les résultats suivants, comme exemple de l’ensemble de la procédure, ont été obtenus à partir de microglie-conditionné milieu après une culture de 48 h. Les données brutes ont été soumises à une base de données sur les protéines Rat. Les protéines identifiées ont été comparées entre les échantillons 1F-EV- et 2F-EVMD(figure 3B) et entre les échantillons 2F-EVMD et 3F-EV-(figure 3C). Dans la première comparaison, le diagramme de Venn a montré 19 protéines communes dans les deux fractions et 522 protéines exclusivement détectées dans la fraction de 2F-EV. L’analyse à l’aide d’un logiciel de protéomique quantitative a permis l’identification de la représentation relative des protéines communes. Les résultats ont montré une carte thermique où toutes les protéines communes entre les triplicates 1F-EV et 2F-EVMD étaient surreprésentées (rouge) dans les échantillons de 2F-EVMD. Dans la deuxième comparaison entre les fractions 2F-EV et 3F-EV-, 113 protéines communes ont été identifiées entre les triplicates. En outre, 428 protéines ont été exclusivement détectées dans 2F-EV ET 11 protéines ont été trouvées exclusivement dans 3F-EV-. À la suite de l’analyse quantitative, la représentation de la canicule des 113 protéines communes a mis en évidence deux grappes où le cluster A présentait cinq protéines surreprésentées dans l’échantillon 3F-EV-EV et le cluster B présentait 108 protéines surreprésentées dans 2F-EVMD.

Les 428 protéines exclusivement représentées et les 108 protéines surreprésentées dans 2F-EVMD ont été soumises à la base de données en libre accès Exocarta afin de détecter les molécules associées aux EV. L’analyse des 100 principaux marqueurs EV d’Exocarta a mis en évidence la présence de 86 protéines associées aux EV dans 2F-EVMD(figure 4A).

Figure 4
Figure 4 : Analyse des protéines de l’échantillon 2F-EVMD. (A) Un pool de 536 protéines (428 protéines exclusives et 108 protéines surreprésentées) a été soumis à la base de données Exocarta afin de détecter les molécules associées aux EV. Symboles de molécules des 86 protéines associées à EV détectées dans les 100 principaux marqueurs EV de la base de données Exocarta. (B) La prédiction des interactions protéiques et leur association à certains processus biologiques ont montré des voies immunitaires et neuroprotectrices dans l’échantillon 2F-EVMD. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fait intéressant, l’analyse des 5 protéines communes dans le cluster A et les 11 protéines exclusivement représentées dans 3F-EV- n’ont été associées à aucun marqueur EV (données non montrées). Enfin, la prédiction des interactions protéiques et leur association avec certains processus biologiques ont montré la présence dans la fraction 2F-EVMD des médiateurs immunitaires (21 %) parfois impliqués dans le contrôle de la réponse inflammatoire (4,1 %) (Figure 4B). Le contenu des EV dans 2F-EVMD a également été associé au développement neuronal (16,8 %), à la différenciation des neurones (5 %) et le contrôle de la mort neuronale (3,8%) qui est en accord avec l’essai de excroissance neurite suivante.

Ainsi, la stratégie que nous avons choisie permet l’accès à toutes les données et permet de prédire les fonctions à médiation EV avant les essais biologiques que nous avons ensuite effectués(figure 5).

Figure 5
Figure 5 : Essais nonctionnels dépendants de la VE. Les effets des véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués sur la excroissance neurite (cadre supérieur) et les effets des véhicules électriques dérivés du macrophage ont été évalués sur l’invasion de cellules de glioma (cadre inférieur). (A, B) La longueur de la neurite a été mesurée sur les cellules PC-12 (le panneau A a été modifié à partir de Raffo-Romero et al.16 avec permission) ou les neurones primaires de rat (B). Les résultats ont montré une augmentation significative de la croissance sous les véhicules électriques (VE) par rapport au contrôle (Ctrl). Barre d’échelle de 20 m. (C, D) Cours de temps de l’invasion sphéroïde de 6 glioma dans le collagène en présence de véhicules électriques dérivés du macrophage primaire de rat (C6 et V.O.) ou de véhicule (contrôle C6). L’invasion 3D sphéroïde C6 dans le collagène a été surveillée et quantifiée jusqu’à 6 jours. La quantification de l’invasion de cellules tumorales est montrée à 1, 2, 3 ou 6 jours (C) comme observé sur les images représentatives (D). Barre d’échelle à 500 m. Pour les essais de excroissance neurite, l’importance a été calculée par le t-testde l’étudiant non appréré (p 'lt; 0,05, 'p 'lt; 0.01 et 'p 'lt; 0.001). Pour l’analyse d’invasion, l’importance a été calculée par ANOVA à sens unique suivi par le test post hoc de Tukey. Les barres d’erreur indiquent une erreur standard relative de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

De cette façon, les fonctions neurotrophiques des véhicules électriques dérivés de microglies ont été étudiées sur la lignée cellulaire PC-12 et les neurones primaires du rat. Les résultats ont montré un effet positif sur la croissance neurite (figure 5A,B). La présence de véhicules électriques a augmenté d’environ 6 et 1,5 fois le réseau de neurites dans la longueur et / ou en nombre dans PC-12 et les neurones primaires par rapport à une condition de contrôle. Dans un autre contexte, nous avons également étudié les effets des véhicules électriques dérivés du macrophage sur une invasion de tumeur cérébrale(figure 5C,D). Il a été évalué à l’aide de sphéroïdes de tumeur 3D intégrés dans une matrice de collagène. Les sphéroïdes générés avec les cellules de gliome de rat de C6 ont été cultivés pendant 6 jours dans une matrice de collagène contenant (ou ne contenant pas) des VÉHICULES purifiés du milieu de culture de macrophages de rat. La matrice de collagène fournit une structure dans laquelle les cellules tumorales peuvent envahir et s’étaler hors du sphéroïde. Les véhicules électriques dérivés du macrophage ont altéré la croissance et l’invasion des sphéroïdes de gliome. Après une culture de 6 jours, une diminution de 50% de l’invasion a été observée dans les sphéroïdes EV-traités comparés au contrôle. Ce résultat a montré que les macrophages peuvent produire des véhicules électriques avec des facteurs antitumorals et/ou anti-invasifs affectant la croissance du gliome.

Supplementary Figure S1
Figure supplémentaire S1 : Images de membrane utilisées pour l’expérience de ballonnement occidental. (A) Image originale de la tache occidentale de la figure 2E (contre HSP90 EV marqueur). (B) Ponceau image de coloration de la même membrane montrant la charge correcte des extraits de protéines de 1F-EV-, 2F-EV et 3F-EV- échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

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Discussion

Le système nerveux central (SNC) est un tissu complexe dans lequel la communication cellule-cellule régule les fonctions neuronales normales nécessaires pour l’homéostasie30. Les véhicules électriques sont maintenant largement étudiés et décrits comme des cargaisons moléculaires importantes pour la communication cellule-cellule31. Ils livrent spécifiquement un cocktail de médiateurs aux cellules de destinataire affectant ainsi leurs fonctions dans des conditions saines et pathologiques32. Des études récentes indiquent que les véhicules électriques jouent un rôle crucial dans le SNC24,33,34 et surtout ceux des cellules immunitaires du cerveau35,36. L’équilibre entre les réponses immunitaires pro-inflammatoires et anti-inflammatoires est crucial et permet de maintenir l’intégrité du cerveau pendant le développement synaptique et les activités neuronales tout au long de la vie. Deux situations distinctes de réponses immunitaires ont été discutées dans cette étude : la relation (i) entre les microglies et les neurones et (ii) entre l’infiltration des macrophages et des cellules de gliome. Tout d’abord, les microglies sont les macrophages résidents dans le tissu cérébral où ils jouent un rôle immunitaire clé dans la gestion des changements de microenvironnement afin d’assurer les activités neuronales. Mais les mécanismes pro-inflammatoires excessifs peuvent être soutenus par des microglies sur-activées et conduire à des troubles neurodégénératifs37,38. En revanche, les gliomes de haute qualité exigent des profils anti-inflammatoires et impliquent des macrophages tumeur-associés (TAM) recrutés dans le site de tumeur. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) représentent une grande population de ces TAM en relation étroite avec les cellules de gliome. Sous l’influence de la tumeur, les BMDM présentent des profils anti-inflammatoires et pro-tumoraux in vivo39. Comment ces BMDM pourraient contrôler l’invasion tumorale in vitro de cellules est une question cruciale dans ce rapport. C’est pourquoi, les véhicules électriques dérivés du macrophage ont été utilisés seuls dans l’essai d’invasion sphéroïde de glioma. Ensemble, dans la co-culture, les cellules de gliome auraient influencé les macrophages pour produire d’autres populations de véhicules électriques avec des profils anti-inflammatoires. L’utilisation directe des véhicules électriques immunitaires pourrait être beaucoup mieux que l’agent antitumoral. Par conséquent, les cellules immunitaires maintiennent la communication cellule-cellule dans des microenvironnements spécifiques où l’équilibre inflammatoire est fortement influencé par les signaux externes40,41. La compréhension des réponses immunitaires à médiation EV représente un grand défi pour limiter la pathogénie de nombreux troubles. L’identification du contenu biologiquement actif de EV est une clé pour comprendre les processus inflammatoires dysrégulés et proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques42,43.

Dans cette étude, nous présentons une méthodologie consistant en un processus d’ultracentrifugation différentiel comme première étape pour éliminer les débris cellulaires, les corps apoptotiques et les molécules solubles, combiné avec la chromatographie d’exclusion de taille pour isoler les véhicules électriques des agrégats moléculaires. Lorsque les populations de véhicules électriques sont évaluées dans les essais biologiques, il est crucial de discriminer le contenu des véhicules électriques à partir d’autres matériaux co-isolés. C’est pourquoi nous avons amélioré l’isolement afin de séparer les composés non associés aux véhicules électriques. En ajoutant des protéines standard dans les échantillons témoins soumis à la procédure SEC, nous avons ensuite pu localisé leurs fractions d’elution par MALDI-TOF. Parce que les normes sont des molécules libres, elles co-intéressent globalement les agrégats moléculaires associés à l’échantillon liés aux matériaux non EV. Ainsi, les fractions EV provenant d’échantillons expérimentaux ont été validées dans le cas d’une procédure d’isolement fiable. De plus, nous avons élaboré une stratégie d’analyse double protéomique. À l’exception de l’utilisation de l’anticorps anti-HSP90 par le ballonnement occidental comme marqueur EV détection préliminaire, nous avons décidé de valider la fractionnement evencieuse correcte par une détection non ciblée des signatures de protéines associées aux EV. En effet, l’approche actuelle n’était pas délibérément axée sur la détection de plusieurs marqueurs EV connus en raison de la spécificité et de la sensibilité insuffisantes de certains anticorps. La variabilité et l’abondance de certains marqueurs EV à la surface des sous-populations ev sont encore controversées dans les procédures d’isolement. En outre, une méthodologie basée sur les anticorps pourrait représenter une limite dans un nombre élevé d’organismes en raison d’un manque d’anticorps commerciaux alors que les études EV sont maintenant un sujet chaud en biologie. Cette analyse non ciblée a permis l’identification d’un nombre plus élevé de molécules qui sont déjà décrites comme des marqueurs EV (86 protéines dans les 100 principaux marqueurs EV de la base de données Exocarta). Enfin, cette approche pourrait être vraiment utile pour valider l’isolement EV des organismes mal décrits à condition que les protéines détectées puissent présenter des homologies significatives aux marqueurs EV connus. Comme décrit récemment, une analyse protéomique à grande échelle pourrait être une alternative à l’utilisation de seulement quelques marqueurs arbitraires43. Cela améliorerait la discrimination des fractions de EV et l’identification de leur contenu actif avant d’être utilisés dans les essais biologiques.

En effet, il est nécessaire d’associer la caractérisation du contenu EV aux effets observés dans les essais biologiques. En effet, l’impact biologique des véhicules sur les cellules bénéficiaires suggère que des médiateurs ou des effecteurs vésiculaires sont impliqués. Encore une fois, la même analyse non ciblée permet l’identification de molécules biologiquement actives. Une optimisation possible dans cette analyse concerne les types de molécules qu’il est possible d’identifier. Notre stratégie était basée sur l’analyse à grande échelle des signatures de protéines et a mené à des voies biologiques prédictives associées à la réponse immunitaire et à la survie des neurones. Il est essentiel de considérer les autres familles de molécules, y compris les lipides, l’ARNm et les microARN par exemple. Nos études actuelles associent ces identifications supplémentaires aux signatures de protéines afin d’obtenir une connaissance globale de cette communication dépendante des véhicules électriques.

De nombreuses approches thérapeutiques sont envisagées dans les années à venir. Étant donné que les véhicules électriques sont capables de traverser facilement la barrière hémato-encéphalique et d’atteindre les tissus pathologiques, ces cargaisons moléculaires peuvent être utilisées de différentes façons. Bien que cette étude n’ait pas mis en évidence les molécules de surface de EV, leur identification est toujours nécessaire afin de mieux comprendre le processus d’adressaire vers les cellules et les tissus cibles. L’analyse protéomique de notre méthodologie donne accès à ces données. Sinon, dans ce rapport, nous avons présenté la production in vitro de véhicules électriques comme des cocktails bénéfiques. Nous n’avons pas optimisé les meilleures conditions pour élécenter ou activer les cellules immunitaires à l’avance. Ce point est crucial parce que, dans les tissus, le microenvironnement a un impact direct sur les cellules immunitaires et contribue finalement à façonner la biogenèse de leurs véhicules électriques. Dans le cas du glioblastome par exemple, il a été constaté que les cellules cancéreuses produisent leurs propres véhicules électriques, contribuant ainsi à orienter les TAM voisins vers les profils anti-inflammatoires et leur immunosuppression locale44,45. C’est la raison pour laquelle les véhicules électriques dérivés du macrophage dans l’environnement du gliome sont différents de ceux produits dans une culture macrophage unique. Ainsi, nous avons directement utilisé des véhicules électriques dérivés du macrophage, produits séparément à partir d’une seule culture de macrophage, pour contrôler l’invasion sphéroïde de glioma parce qu’une co-culture macrophage-glioma n’a aucun contrôle sur la croissance tumorale. D’autres stratégies thérapeutiques pourraient empêcher cette immunosuppression in vivo en utilisant des véhicules électriques pro-inflammatoires et anti-tumoraux produits in vitro à partir de macrophages activés. Une stratégie similaire pourrait être utilisée dans le contexte des maladies neurodégénératives grâce à l’utilisation de véhicules électriques dérivés de microglies correctement alertées pour produire une réponse neuroprotectrice et anti-inflammatoire favorisant la survie neuronale. En conclusion, les études de la communication par les véhicules électriques entre les cellules immunitaires et le microenvironnement in vivo sont essentielles pour permettre une meilleure compréhension de la pathogénie et concevoir des approches thérapeutiques novatrices.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les travaux présentés ont été soutenus par le Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche et l’INSERM. Nous remercions l’installation BICeL- Campus Scientific City pour l’accès aux instruments et aux conseils techniques. Nous remercions Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard et Isabelle Fournier pour l’assistance à la spectrométrie de masse. Nous remercions Tanina Arab, Christelle van Camp, Françoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli et Pierre-Eric Sautière pour leur forte contribution aux développements scientifiques et techniques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

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Neurosciences Numéro 160 Fonctions immunitaires microglies macrophages neurones cellules gliomes vésicules extracellulaires
Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire
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Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

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