Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores inmunes en microambientes específicos.

Abstract

El estado neuroinflamatorio del sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel clave en las condiciones fisiológicas y patológicas. La microglia, las células inmunitarias residentes en el cerebro, y a veces los macrófagos derivados de la médula ósea infiltrantes (BMDM), regulan el perfil inflamatorio de su microambiente en el SNC. Ahora se acepta que las poblaciones de vesícula extracelular (EV) de las células inmunitarias actúan como mediadores inmunes. Por lo tanto, su recolección y aislamiento son importantes para identificar su contenido, pero también evaluar sus efectos biológicos en las células receptoras. Los presentes datos destacan los requisitos cronológicos para el aislamiento EV de las células de microglia o de los macrófagos sanguíneos, incluidos los pasos de la ultracentrifugación y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Un análisis proteómico no dirigido permitió la validación de firmas de proteínas como marcadores EV y caracterizó el contenido de EV biológicamente activo. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también se utilizaron funcionalmente en el cultivo primario de las neuronas para evaluar su importancia como mediadores inmunes en el crecimiento de la neurita. Los resultados mostraron que los vehículos eléctricos derivados de la microglia contribuyen a facilitar el crecimiento de la neurita in vitro. Paralelamente, los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en sangre se utilizaron funcionalmente como mediadores inmunes en cultivos esferoides de células de glioma C6, los resultados que muestran que estos vehículos eléctricos controlan la invasión de células de glioma in vitro. Este informe destaca la posibilidad de evaluar las funciones de las células inmunitarias mediadas por EV, pero también comprender las bases moleculares de dicha comunicación. Este desciframiento podría promover el uso de vesículas naturales y/o la preparación in vitro de vesículas terapéuticas con el fin de imitar las propiedades inmunitarias en el microambiente de las patologías del SNC.

Introduction

Muchas neuropatologías están relacionadas con el estado neuroinflamatorio que es un mecanismo complejo que se considera cada vez más, pero todavía mal entendido porque los procesos inmunológicos son diversos y dependen del entorno celular. De hecho, los trastornos del SNC no implican sistemáticamente las mismas señales de activación y las poblaciones de células inmunitarias y, por lo tanto, las respuestas pro o antiinflamatorias son difíciles de evaluar como causas o consecuencias de las patologías. Los macrófagos residentes en el cerebro llamados "microglia" parecen estar en la interfaz entre los sistemas nervioso e inmune1. Las microglia tienen un origen mieloide y se derivan del saco de yema durante la hematopoyesis primitiva para colonizar el cerebro, mientras que los macrófagos periféricos se derivan del hígado fetal durante la hematopoyesis definitiva para convertirse en macrófagos periféricos2. Las células de microglia se comunican con las neuronas y las células gliales derivadas de las neuronas, como los astrocitos y los oligodendrocitos3. Varios estudios recientes han demostrado que la microglia está implicada en la plasticidad neuronal durante el desarrollo del SNC y la homeostasis de tejido adulto, y también en el estado inflamatorio asociado con enfermedades neurodegenerativas4,,5. De lo contrario, la integridad de la barrera hematoencefálica puede verse comprometida en otras patologías del SNC. Las respuestas inmunitarias, especialmente en el cáncer de glioblastoma multiforme, no son apoyadas sólo por células de microglia, ya que la barrera hematoencefálica se reorganiza a través de procesos angiogénicos y la presencia de vasos linfáticos6,,7. Por lo tanto, una infiltración grande de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) ocurre en el tumor cerebral a través de los mecanismos de angiogénesis dependientes del tumor8. Las células cancerosas ejercen una influencia significativa en los DMO infiltrados que conducen a propiedades inmunosupresoras y crecimiento tumoral9. Por lo tanto, la comunicación entre las células inmunitarias y su microambiente cerebral es difícil de entender ya que el origen celular y las señales de activación son diversas10,,11. Por lo tanto, es interesante aprehender las funciones de las firmas moleculares asociadas a células inmunes en condiciones fisiológicas. En este sentido, la comunicación célula-célula entre las células inmunitarias y el microambiente celular se puede estudiar mediante la liberación de vesículas extracelulares (EV).

Los vehículos eléctricos se están estudiando cada vez más en la regulación de las funciones inmunitarias en condiciones sanas y patológicas12,,13. Se pueden tener en cuenta dos poblaciones, exosomas y microvesículas. Presentan diferentes rangos de biogénesis y tamaño. Los exosomas son vesículas de 30-150 nm de diámetro y se generan a partir del sistema endosomal y se secretan durante la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) con la membrana plasmática. Las microvesículas miden unos 100–1.000 nm de diámetro y son generadas por un árbol externo de la membrana plasmática celular14. Debido a que la discriminación de exosoma versus microvesículas todavía es difícil de realizar de acuerdo con el tamaño y los patrones moleculares, sólo utilizaremos el término EV en el presente informe. La comunicación asociada a los vehículos ves por el VEHÍCULO en el SNC representa un mecanismo ancestral ya que los estudios mostraron su participación en especies de invertebrados, incluidos nematodos, insectos o anélidos15,,16. Además, los resultados que muestran que los vehículos eléctricos pueden comunicarse con células de diferentes especies demuestran que este mecanismo es un sistema de bloqueo de teclas, basado primero en el reconocimiento de moléculas de superficie entre vesículas y células receptoras y luego permitiendo la absorción de mediadores16,,17. De hecho, los vehículos eléctricos contienen muchas moléculas como proteínas (por ejemplo, enzimas, transducción de señales, factor de biogénesis), lípidos (por ejemplo, ceramida, colesterol) o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm o miRNAs) que actúan como reguladores directos o indirectos de las actividades celulares receptoras14. Es por eso que también se realizaron estudios metodológicos en células inmunitarias para aislar los vehículos eléctricos y caracterizar completamente sus firmas proteicas18,,19.

Los primeros estudios demostraron la liberación de exosomas de la microglia de rata cultivada primaria como un mecanismo inducible después de una activación dependiente de Wnt3a o serotonina20,21. Funcionalmente en el SNC, los vehículos eléctricos derivados de la microglia regulan la liberación de vesículas sinápticas por terminales presinápticos en las neuronas que contribuyen al control de la excitabilidad neuronal22,,23. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también podrían propagar la respuesta inflamatoria mediada por citoquinas en regiones cerebrales grandes24,,25. Es importante destacar que los diversos ligandos para la familia de receptores similares a peajes podrían activar producciones específicas de vehículos eléctricos en la microglia26. Por ejemplo, los estudios in vitro muestran que las líneas celulares BV2 de microglia activada por LPS producen contenidos diferenciales de EV, incluidas las citoquinas proinflamatorias27. Por lo tanto, la diversidad funcional de las subpoblaciones de células inmunitarias en el SNC, la microglia y la infiltración de DMO, podría evaluarse a través de sus propias poblaciones de EV, incluido el impacto EV en las células receptoras y la identificación del contenido de EV.

Anteriormente describimos métodos para evaluar las propiedades funcionales de los vehículos eléctricos derivados de microglia y BMDM después de su aislamiento16,19. En el presente informe, proponemos evaluar de forma independiente el efecto de los vehículos eléctricos derivados de la microglia en el crecimiento de la neurita, y el efecto de los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en el control de los agregados celulares del glioma. Este estudio también propone un amplio análisis proteómico de las fracciones EV con el fin de validar el procedimiento de aislamiento EV, así como identificar las firmas de proteínas biológicamente activas. Los efectos beneficiosos y el descifrado molecular de los contenidos de EV podrían ayudar a su posible manipulación y uso como agentes terapéuticos en trastornos cerebrales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultura primaria de microglia/macrofagos

  1. Cultivo primario de microglia
    1. Cultivo de microglia primaria de rata comercial (2 x 106 células) (ver la tabla de materiales) en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero libre de exosomas, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, y 9,0 g/L de glucosa a 37 oC y 5% deCOC.
    2. Recoger el medio acondicionado después de una cultura de 48 h y proceder al aislamiento de los vehículos eléctricos.
  2. Cultivo primario de macrófagos
    1. Cultivo de macrófagos primarios de ratas comerciales (1 x 106 células) en el medio proporcionado por el fabricante (ver la Tabla de Materiales) a 37oC y 5% CO2,con suero libre de exosomas.
    2. Recoger el medio acondicionado después de un cultivo de 24 horas y proceder al aislamiento de los vehículos eléctricos.

2. Aislamiento de vehículos eléctricos

  1. Preaislado de vehículos eléctricos del medio acondicionado
    1. Transfiera el medio de cultivo condicionado de cultivos de microglia o macrófagos (pasos 1.1.2 o 1.2.2) a un tubo cónico.
    2. Centrifugar a 1.200 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para peletizar las células.
    3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico. Centrífuga a 1.200 x g durante 20 min en RT para eliminar los cuerpos apoptóticos.
    4. Transfiera el sobrenadante en un tubo de policarbonato de 10,4 ml y transfiera el tubo a un rotor de 70,1 Ti. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 90 min a 4oC para peletizar los vehículos eléctricos.
    5. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene EV que contiene EV en 200 l de solución salina tampón de fosfato filtrada (PBS) de 0,20 m.
  2. Aislamiento de vehículos eléctricos
    1. Preparación de la columna de cromatografía de exclusión de tamaño casera (SEC)
      1. Vaciar una columna de cromatografía de vidrio (longitud: 26 cm; diámetro: 0,6 cm) (ver la Tabla de Materiales),lavarla y esterilizarlo.
      2. Coloque un filtro de 60 m en la parte inferior de la columna.
      3. Apilar la columna con una matriz base de filtración de gel de agarosa reticulada para crear una fase estacionaria de 0,6 cm de diámetro y una altura de 20 cm.
      4. Enjuague la fase con 50 ml de PBS filtrado de 0,20 m. Conservar a 4oC para su uso posterior si es necesario.
    2. Coloque el pellet EV resuspendido en la parte superior de la fase estacionaria de la columna SEC.
    3. Recoja 20 fracciones secuenciales de 250 l mientras continúa agregando PBS filtrado de 0,20 m en la parte superior de la fase estacionaria para evitar el secado de la columna. Almacene las fracciones a -20 oC si es necesario.
      NOTA: Se puede realizar un almacenamiento más largo que una semana a -80 oC para mantener la integridad del EV para el análisis molecular.
  3. Análisis de espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz (MALDI) de las fracciones SEC
    1. Proceda al aislamiento EV como se describe en la sección 2.2.
    2. Resuspender el pellet EV con 200 l de solución de mezcla de calibración de péptidos (ver tabla de materiales).
    3. Proceda a la colección EV como se describe en las secciones 2.2.1 a 2.2.3.
    4. Seque completamente la fracción con un concentrador de vacío.
    5. Reconstituir las fracciones con 10 l de ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA).
    6. Mezclar 1 l de fracción reconstituida con 1 l de matriz de ácido hidroxicinnámico (HCCA) de 1 oC en una placa de destino de acero MALDI pulido.
    7. Analice todas las fracciones con un espectrómetro de masas MALDI.
    8. Analizar los espectros generados con software dedicado (consulte Tabla de materiales).

3. Caracterización de los vehículos eléctricos

  1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    NOTA:     El análisis NTA se realiza con un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas (ver Tabla de materiales)y una bomba de jeringa automatizada.
    1. Haga una dilución (rango de 1:50 a 1:500) de cada fracción SEC desde el paso 2.2.3 con 0.20 m de PBS filtrado.
    2. Vortex la solución para eliminar agregados EV.
    3. Coloque la solución diluida en una jeringa de 1 ml y colóquela en la bomba de jeringa automatizada.
    4. Ajuste la configuración de la cámara al nivel de ganancia de pantalla (3) y al nivel de la cámara (13).
    5. Haga clic en Ejecutar e inicie el siguiente script.
      1. Cargue la muestra en la cámara de análisis (velocidad de perfusión: 1.000 para 15 s).
      2. Disminuir y estabilizar el flujo de velocidad para la grabación de vídeo (velocidad de perfusión: 25 para 15 s). Captura tres videos consecutivos de 60 s del flujo de partículas.
      3. Ajuste el nivel de la cámara (13) y el umbral de detección (3) antes del análisis de vídeos. Haga clic en Configuración . . . . . . . . . . Ok para iniciar el análisis y haga clic en Exportar cuando se realiza el análisis.
    6. Entre cada análisis de fracción, lavar con 1 ml de PBS filtrado de 0,20 m.
  2. Análisis de microscopía electrónica (EM)
    1. Aísle los vehículos eléctricos como se describe en la sección 2.
      NOTA: No se requieren condiciones estériles.
    2. Repita la sección 3.1 para cuantificar los vehículos eléctricos.
      NOTA: Solo se utilizarán fracciones positivas para el análisis EM.
    3. Utilice un filtro centrífugo de 50 kDa (ver Tabla de materiales)para concentrar fracciones SEC que contienen EV.
    4. Resuspend EVs concentrados en 30 l de 2% de paraformaldehído (PFA).
    5. Cargue 10 l de la muestra sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono.
    6. Incubar durante 20 min en un ambiente húmedo.
    7. Repita los pasos 3.2.5 y 3.2.6 para una buena absorción de la muestra en la rejilla.
    8. Transfiera la rejilla a una caída de 1% de glutaraldehído en PBS durante 5 min en RT.
    9. Lave la muestra con agua ultrapura varias veces.
    10. Contraste la muestra durante 10 minutos sobre hielo con una mezcla de acetato de uranilo al 4% y 2% de metilcelulosa (1:9, v/v). Retire el exceso de la mezcla con un papel de filtro.
    11. Seque la muestra y observándola bajo un microscopio electrónico de transmisión a 200 kV (ver tabla de materiales).
  3. Análisis de western blot
    1. Extracción de proteínas
      1. Repita los pasos 3.2.1 a 3.2.3 para aislar y concentrar los vehículos eléctricos.
      2. Mezclar 50 l de tampón RIPA (150 mM de cloruro sódico [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM de etilenglicol-bis(2-aminoétilemás)-N,N,N-,ácido tetraacético [EGTA], ácido etilendiamina-tetraacético de 2 mM [EDTA], Fluoruro de sodio de 100 mM [NaF], 10 mM de pirofosfato sódico, 1% No 40, 1 mM fluoruro de fenimetanofonil [PMSF], inhibidor de 1x proteasa) con la muestra EV (25 l resultante de la concentración de EV en el filtro) durante 5 minutos en hielo para extraer proteínas.
      3. Sonicar para 5 s (amplitud: 500 W; frecuencia: 20 kHz), 3 veces en hielo.
      4. Retire los residuos vesiculares por centrifugación a 20.000 x g durante 10 min, a 4oC.
      5. Recoger el sobrenadante y medir la concentración de proteínas con el método de ensayo de proteína Bradford.
    2. Electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato de sodio (SDS-PAGE) e hinchazón occidental
      1. Mezclar extractos proteicos (30 g) con tampón de muestra de 5c Laemmli (v/v).
      2. Cargue la mezcla de proteínas en un gel de poliacrilamida al 12%.
      3. Migre las proteínas en el gel con tampón TGS (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM de glicina y 0,1% sdS), a 70 V durante 15 min y 120 V durante 45 min.
      4. Transfiera las proteínas a la membrana de nitrocelulosa con sistema semi-seco a 230 V durante 30 min.
      5. Saturar la membrana durante 1 h en RT con tampón de bloqueo (0,05% Tween 20 p/v, 5% leche en polvo w/v en 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Incubar la membrana durante la noche a 4oC con anticuerpos monoclonales anti-humanos de proteína de choque térmico 90 (HSP90) de ratón diluidos en tampón de bloqueo (1:100).
      7. Lave la membrana tres veces con PBS-Tween (PBS, 0.05% Tween 20 w/v) durante 15 min.
      8. Incubar la membrana durante 1 h en RT con anticuerpos secundarios IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante de cabra diluidos en tampón de bloqueo (1:10.000).
        NOTA: Se realiza un control negativo utilizando anticuerpos secundarios solos.
      9. Repita el paso de lavado (paso 3.3.2.7).
      10. Revelar la membrana con kit de sustrato de hinchazón occidental de quimiminiscencia (ECL) mejorado (ver Tabla de materiales).
  4. Análisis proteómico
    1. Extracción de proteínas y digestión en gel
      1. Repita los pasos 3.2.1 a 3.2.3 para aislar y concentrar los vehículos eléctricos. Repita el paso 3.3.1 para la extracción de proteína EV.
      2. Realizar la migración de proteínas en el gel de apilamiento de un 12% de gel de poliacrilamida.
      3. Fijar las proteínas en el gel con coomassie azul durante 20 min en RT.
      4. Ex impuestos cada pieza de gel de color y cortarlo en trozos pequeños de 1 mm3.
      5. Lavar las piezas de gel sucesivamente con 300 l de cada una de las soluciones: agua ultrapura durante 15 min, 100% acetonitrilo (ACN) para bicarbonato de amonio de 15 min, 100 mM (NH4HCO3) durante 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) durante 15 min, y 100% ACN para 5 min con agitación continua.
      6. Seque completamente las piezas de gel con concentrador de vacío.
      7. Realizar la reducción de proteínas con 100 l de 100 mM NH4HCO3 que contiene 10 mM de ditiothreitol durante 1 h a 56oC.
      8. Realizar alquilación proteica con 100 ml de 100 mM NH4HCO3 que contenga 50 mM de yodoacetamida durante 45 minutos en la oscuridad en RT.
      9. Lavar las piezas de gel sucesivamente con 300 ml de cada solución: 100 mM de NH4HCO3 durante 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) durante 15 min, y 100% ACN durante 5 min con una agitación continua.
      10. Seque completamente las piezas de gel con un concentrador de vacío.
      11. Realizar la digestión proteica con 50 ml de tripsina (12,5 g/ml) en 20 mM NH4HCO3 durante la noche a 37 oC.
      12. Extraiga las proteínas digeridas del gel con 50 l de 100% ACN durante 30 min a 37oC y luego 15 min a RT con agitación continua.
      13. Repita los siguientes procedimientos de extracción dos veces: 50 ml de 5% de TFA en 20 mM de solución NH4HCO3 durante 20 min con agitación continua.
      14. Añadir 100 l de 100% ACN durante 10 min con agitación continua.
      15. Proteínas digeridas en seco con un concentrador de vacío y resuspend en 20 l de 0,1% de AFC.
      16. Desalir la muestra utilizando una punta de pipeta de 10 l con medios de fase inversa C18 para desalar y concentrar péptidos (ver tabla de materiales)y péptidos elute con ácido fórmico ACN:0,1% (FA) (80:20, v/v).
      17. Seque completamente la muestra con un concentrador de vacío y resuspend en 20 ml de ACN:0.1% FA (2:98, v/v) para espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS).
    2. Análisis LC-MS/MS
      1. Cargue el péptido digerido en el instrumento LC-MS/MS y realice análisis de muestras y datos según los parámetros descritos en detalle en otro lugar42.
    3. Análisis de datos sin procesar
      1. Procesar datos de espectrometría de masas para identificar proteínas y comparar proteínas identificadas de cada muestra con un paquete de software proteómico cuantitativo utilizando parámetros estándar.
      2. Exportar, utilizando parámetros estándar, la lista de proteínas exclusivas y sobre-representadas a partir de muestras positivas EV en un software que predice redes de proteínas y procesos biológicos.
      3. Compare la lista de proteínas identificadas en las fracciones con los 100 marcadores EV principales de la base de datos de acceso abierto exocarta (consulte la Tabla de materiales).

4. Ensayo de efectos de vehículos eléctricos funcionales

  1. Ensayo de crecimiento de neurita en la línea celular PC-12
    1. Cultivo de línea celular PC12 en medio DMEM completo (2 mM L-glutamina, 10% suero de caballo fetal (FHS), 5% suero bovino fetal (FBS), 100 UI/ml de penicilina, 100 g/mL estreptomicina).
      NOTA: Los sueros son libres de exosomas en todo el procedimiento.
    2. Añadir un vidrio de cubierta (todos los pozos) a una placa de 24 pozos; cubrir la placa con poli-D-lisina (0,1 mg/ml) y semilla 260.000 células/pozo.
    3. Incubar las células a 37oC por debajo del 5% de CO2.
    4. Después de 24 horas de incubación, cambie el medio a medio de diferenciación DMEM (DMEM con 2 mM de L-glutamina, 0,1% FHS, 100 UI/ml de penicilina, estreptomicina de 100 g/ml) con 1 x 106 microgliaVS (desde el paso 1.1.2).
      NOTA: La condición de control se realiza sin microglia EVs en el medio de diferenciación.
    5. En el día 4 después de la siembra, cargue todos los potes con 100 l de medio DMEM completo.
    6. En el día 7 después de la siembra, fijar las células con 4% de PFA durante 20 minutos en RT y enjuagar tres veces (10 min cada uno) con PBS.
    7. Manchar las células con falhalloidina conjugada con rodamina durante 30 min a 4 oC y enjuagar 3 veces (10 min cada una) con PBS.
    8. Manchar las células con Hoechst diluido 33342 (1:10.000) durante 30 min a RT y enjuagar 3 veces (10 min cada uno) con PBS.
    9. Monte el cristal de la cubierta en un portaobjetos con medio de montaje fluorescente (consulte Tabla de materiales).
    10. Analizar la diapositiva con un microscopio confocal, tomar 5 imágenes aleatorias de cada diapositiva.
    11. Mida el crecimiento de la neurita utilizando un software automatizado de cuantificación (longitud total de la neurita) como se describe en detalle en otroslugares 43.
  2. Neurita supera el crecimiento de las neuronas primarias de rata
    1. Recubrir un portaobjetos de vidrio de 8 pocín con poli-D-lisina (0,1 mg/ml) y laminina (20 g/ml).
    2. Neuronas primarias comerciales de ratas de cultivo en medio de cultivo adecuado (ver Tabla de Materiales) mediante el enchapado de 50.000 células por pozo e incubando las células a 37 oC por debajo del 5% de CO2 durante 48 h.
      NOTA: Los sueros están libres de exosomas en todo el procedimiento.
    3. Añadir 1 x 106 microglia EV al medio de cultivo de neuronas e incubar a 37 oC por debajo del 5% deCO2 durante 48 h más.
      NOTA: La condición de control se realiza sin microglia EVs en el medio de cultivo de neuronas.
    4. Siga los pasos 4.1.6 a 4.1.9 para fijar y manchar las células.
    5. Siga los pasos 4.1.10 y 4.1.11 para analizar la diapositiva.
  3. Invasión de células de Glioma
    1. Células de glioma de rata resuspendidas C6 en medio DMEM completo (DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1x antibióticos) que contienen 5% de colágeno a una concentración final de 8.000 células en 20 l.
      NOTA: Los sueros están libres de exosomas en todo el procedimiento.
    2. Coloque 5 ml de PBS EN la parte inferior de un plato de cultivo de tejido de 60 mm. Invierta la tapa y deposite las gotas de 20 ml (8.000 células) de la suspensión celular en la parte inferior de la tapa.
    3. Invierta la tapa en la cámara inferior llena de PBS e incuba la placa a 37oC y 5%coc durante 72 h hasta que se forme esferoides celulares.
    4. Añadir 1 x 108 EVs de macrófagos (del paso 1.2.2) a una mezcla de colágeno de 2,2 mg/ml (2 ml de solución de colágeno bovino tipo I [3 mg/ml] con 250 ml de medio esencial mínimo de 10x (MEM) y 500 l de hidróxido de sodio de 0,1 M).
      NOTA: La condición de control se realiza sin vehículos eléctricos macrófagos en la mezcla de colágeno.
    5. Distribuir la mezcla de colágeno que contiene EV en una placa de 24 pozos para incrustar esferoides celulares.
    6. Implantar los esferoides celulares recién formados en el centro de cada pozo.
    7. Incubar la placa durante 30 min a 37oC y 5% de CO2 para solidificar el gel.
    8. A partir de entonces, superponga 400 l de un medio DMEM completo en la matriz de colágeno en cada pocól.
    9. Incubar el sistema completo durante un total de 6 días a 37oC y 5% de CO2.
      NOTA: La invasión celular fuera del esferoide es monitoreada por la fotografía digital usando un microscopio de luz invertido usando un objetivo 4x/0.10 N.A.
    10. Adquiere imágenes de cada pozo todos los días.
    11. Procesar imágenes y cuantificar la invasión de áreas esferoides celulares utilizando el software como se describió anteriormente en detalle42.
      NOTA: Las áreas de invasión y esferoides se normalizaron por cada día a las áreas de invasión y esferoides medidas el día 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uno de los principales desafíos para atribuir efectos biológicos a las vesículas extracelulares (EV) es la capacidad de aislar los vehículos eléctricos de todo el medio de cultivo. En este informe, presentamos un método que utiliza la ultracentrifugación (UC) y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) que se acopla al análisis a gran escala de firmas de proteínas para validar marcadores EV e identificar compuestos bioactivos. Los vehículos eléctricos derivados de macrófagos o microglia fueron aislados del medio acondicionado después de un cultivo de 24 h o 48 h respectivamente (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Estrategias de recolección y aislamiento de Vesícula Extracelular (EV). Los cuerpos apoptóticos y los desechos celulares fueron separados del medio condicionado por microglia o macrófago por sucesivos pasos de centrifugación. Desde el sobrenadante, los vehículos eléctricos fueron aislados por ultracentrifugación (UC). El pellet UC que contiene EV se cargó en la columna y se separó por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en 20 fracciones eluidas diferentes. Como se reveló en los pasos posteriores (microscopía electrónica, análisis de seguimiento de nanopartículas y análisis proteómico), las fracciones de la SEC se agruparon y organizaron en 1F-EV-, 2F-EV+ y 3F-EV-. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El método siguió los sucesivos pasos de centrifugación: el primero en eliminar las células y el segundo para eliminar los desechos celulares y los cuerpos apoptóticos. Luego, el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo para realizar una ultracentrifugación a 100.000 x g durante 90 min. Las vesículas se recogieron junto con los agregados proteicos en el pellet final de la UC. Se utilizó una columna SEC para separar los compuestos según su tamaño y eliminar los agregados (Figura 1). Para confirmar el aislamiento de los vehículos eléctricos, cada fracción SEC siguió un análisis de seguimiento de nanopartículas(Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Análisis de las fracciones SEC. (A) Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) de fracciones SEC. El número total de partículas en cada fracción SEC se presenta con gráficos de barras. Los gráficos de barras naranjas muestran las tres fracciones EV+ consecutivas (F5–F7). (B, C) Las capturas de pantalla de la cámara NTA muestran diferencias significativas en el flujo de partículas entre las fracciones SEC. (D) Análisis de espectrometría de masas MALDI complementario. A partir de otro pellet UC que contiene EV, se agregó un conjunto de péptidos de control estándar antes de la separación sec para validar el rendimiento de la estrategia SEC. Cada fracción SEC se analizó con ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para determinar fracciones de estándar positivo. En los nueve primeros espectros (fracciones 1 a 9), no se observó ninguna señal. La detección de estas normas libres fue posible en las siguientes fracciones (fracciones 10 a 20) confirmando la capacidad del procedimiento SEC para separar los vehículos eléctricos (F5–F7) de los componentes solubles (F10–F20). (E) Análisis de manchas occidentales de fracciones SEC como análisis preliminar de marcador EV. Las fracciones EV+ (F5–F7) se agruparon como una muestra (2F-VE+), mientras que las fracciones EV (F1–F4 y F8–F20 respectivamente) se agruparon en otras dos muestras llamadas 1F-EV- y 3F-EV-. Los resultados mostraron la presencia de una señal de proteína de choque térmico 90 (HSP90) (marcador positivo EV) en 2F-EV+, y también en el izado celular como control positivo, en comparación con las otras fracciones (1F-EV- y 3F-EV-). (F, G) Análisis de microscopía electrónica de la muestra positiva EV (2F-EV+). La observación bajo dos aumentos sucesivos reveló la presencia de vehículos eléctricos en un rango de tamaño alrededor de 100 nm (flechas blancas) y alrededor de 400 nm (punta de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El número de partículas fue significativamente mayor en las fracciones 5, 6 y 7 que en las anteriores (F1–F4) y siguientes (F8–F20). Fue posible ver un flujo de partículas en estas fracciones incluso si se observaron algunas partículas en las siguientes fracciones (Figura 2B,C). Esta separación no impide la posibilidad de que fracciones distintas de F5–F7 puedan contener una pequeña cantidad de vesículas, o incluso que las fracciones ricas en EV F5 a F7 puedan contener contaminantes moleculares. Para al menos asegurarse de que las fracciones F5-F7 están libres de contaminar moléculas de elución, era necesario seguir la elución de tiempo-curso de los diferentes compuestos en el procedimiento sección. Para ello, se añadieron estándares de péptidos de control a un pellet UC similar al utilizado anteriormente. Esta preparación se separó de nuevo mediante el procedimiento SEC. A continuación, se realizó un análisis de espectrometría de masas asistida por desorción láser asistida por matriz : análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI) con el fin de identificar las fracciones sec en las que se eluyen las normas (Figura 2D). Debido a la gama de masas, sólo se siguieron los productos ionizados de los estándares de péptidos en este análisis. Los resultados mostraron que estos productos eran detectables en las fracciones 10 a 20, lo que demuestra que ninguna proteína soluble no puede ser eluida en las mismas fracciones que los vehículos eléctricos (F5–F7). Estos resultados confirmaron el interés de este enfoque en la separación de los vehículos eléctricos de los componentes no EV. Incluso suponiendo que las fracciones F8-F20 pudieran contener una fracción residual de EV, decidimos en los siguientes experimentos combinar las fracciones positivas EV (F5–F7) en una sola muestra llamada 2F-EV+. También combinamos las otras fracciones de la SEC en dos muestras llamadas 1F-EV- (F1–F4) y 3F-EV- (F8–F20). Agrupamos en tres muestras por varias razones. En primer lugar, el número de fracciones de la SEC aumentaría el tiempo de los análisis moleculares, pero también los estudios in vitro funcionales. Las fracciones SEC positivas EV exhiben por separado números de partículas más bajos y también comprometen la detección de compuestos moleculares. De la misma manera, se consideró más juicioso agrupar las fracciones F8–F20 para concentrar, si es necesario, las vesículas residuales y comprobar su presencia mediante un análisis preliminar de la mancha occidental contra HSP90, un marcador EV. Curiosamente, se detectó una señal positiva para HSP90 en la fracción 2F-EV+, también en el izado celular como control positivo, pero no en muestras 1F-EV- y 3F-EV-(Figura 2E y Figura Suplementaria S1 como control). Este análisis confirma el interés de 2F-EV+ solamente y la correcta gestión de las fracciones SEC anteriores. Para afirmar el aislamiento EV, un experimento adicional con microscopía electrónica analizó sólo la muestra 2F-EV+ y permitió la observación de vehículos eléctricos con una morfología típica y heterogeneidad de tamaño entre 100 y 400 nm(Figura 2F,G).

Otro paso clave en la validación fue el análisis proteómico(Figura 3). Desarrollamos todo un análisis de espectrometría de masas con múltiples objetivos: (i) confirmar el aislamiento de los vehículos eléctricos con la detección de un gran número de marcadores EV en 2F-EV+, (ii) eventualmente identificar proteínas contaminantes en las muestras negativas EV (1F-EV- y 3F-EV-) y (iii) caracterizar el contenido proteico de los vehículos eléctricos que apoyan sus actividades biológicas.

Figure 3
Figura 3: Análisis proteómico de muestras EV-positivas y EV-negativas. (A) Después de tres aislamientos EV independientes de preparaciones celulares de microglia similares, las muestras 1F-EV-, 2F-EV+ y 3F-EV- se cargaron para la electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecrilato sódico (SDS-PAGE) y se migraron hasta que el gel de apilamiento para concentrar las proteínas con el fin de realizar su digestión en gel. Los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS) para identificar las proteínas correspondientes. (B) Comparación de proteínas identificadas entre muestras 1F-EV- y 2F-EV+ que muestran proteínas comunes tanto en fracciones (19) como proteínas detectadas exclusivamente en la fracción 2F-EV+ (522). El mapa de calor muestra la representación relativa donde todas las proteínas comunes entre los triplicados 1F-EV- y 2F-EV+ estaban sobre-representadas (rojo) en las muestras 2F-EV+. (C) Comparación de proteínas identificadas entre las fracciones 2F-EV+ y 3F-EV- que muestran proteínas comunes entre triplicados (113) y proteínas representadas exclusivamente (428 en 2F-EV+ y 11 en 3F-EV-). El mapa de calor muestra la representación relativa en dos clústeres. Un (grupo A) presenta 5 proteínas sobre-representadas en la muestra 3F-EV- y una segunda (grupo B) presenta 108 proteínas sobre-representadas en 2F-EV+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

De los medios condicionados por células, el procedimiento UC y SEC condujo a tres muestras 1F-EV-, 2F-EV+ y 3F-EV-. Las proteínas correspondientes fueron extraídas y concentradas por electroforesis de gel de dodecilo sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE). Después de una breve migración en el gel de apilamiento, las muestras fueron recogidas por una escisión de banda, transferidas en tubos distintos para ser digeridas en gel. Los productos fueron separados por cromatografía en línea de fase inversa directamente acoplada a un espectrómetro de masas para su análisis (Figura 3A).

Los siguientes resultados, como ejemplo de todo el procedimiento, se obtuvieron de un medio condicionado por microglia después de un cultivo de 48 h. Los datos sin procesar se enviaron a una base de datos de proteínas Rat. Las proteínas identificadas se compararon entre muestras 1F-EV- y 2F-EV+ (Figura 3B) y entre muestras 2F-EV+ y 3F-EV- (Figura 3C). En la primera comparación, el diagrama de Venn mostró 19 proteínas comunes en ambas fracciones y 522 proteínas detectadas exclusivamente en la fracción 2F-EV+. El análisis utilizando un software proteómico cuantitativo permitió la identificación de la representación relativa de las proteínas comunes. Los resultados mostraron un mapa de calor donde todas las proteínas comunes entre triplicados 1F-EV- y 2F-EV+ estaban sobre-representadas (rojo) en las muestras 2F-EV+. En la segunda comparación entre las fracciones 2F-EV+ y 3F-EV-, se identificaron 113 proteínas comunes entre triplicados. Además, se detectaron exclusivamente 428 proteínas en 2F-EV+ y 11 proteínas se encontraron exclusivamente en 3F-EV-. Tras el análisis cuantitativo, la representación de mapas de calor de las 113 proteínas comunes destacó dos racimos donde el clúster A presentó cinco proteínas sobre-representadas en la muestra 3F-EV- y el clúster B presentó 108 proteínas sobre-representadas en 2F-EV+.

Las 428 proteínas representadas exclusivamente y las 108 proteínas sobre-representadas en 2F-EV+ fueron presentadas a la base de datos de acceso abierto Exocarta con el fin de detectar moléculas asociadas a EV. El análisis de los 100 mejores marcadores de vehículos eléctricos en Exocarta puso de relieve la presencia de 86 proteínas asociadas a EV en 2F-EV+ (Figura 4A).

Figure 4
Figura 4: Análisis de proteínas a partir de la muestra 2F-EV+. (A) Se presentó a la base de datos Exocarta un conjunto de 536 proteínas (428 proteínas exclusivas y 108 sobrerepresentadas) para detectar moléculas asociadas a EV. Símbolos de moléculas de las 86 proteínas asociadas a EV detectadas en los 100 marcadores EV principales de la base de datos Exocarta. (B) La predicción de las interacciones proteicas y su asociación con procesos biológicos seleccionados mostró vías inmunitarias y neuroprotectoras en la muestra 2F-EV+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Curiosamente, el análisis de las 5 proteínas comunes en el clúster A y las 11 proteínas representadas exclusivamente en 3F-EV- no se asoció a ningún marcador EV (datos no mostrados). Por último, la predicción de las interacciones proteicas y su asociación con procesos biológicos seleccionados mostró la presencia en la fracción 2F-EV+ de mediadores inmunes (21%) a veces involucrados en el control de la respuesta inflamatoria (4,1%) (Figura 4B). El contenido de EV en 2F-EV+ también se asoció con el desarrollo neuronal (16,8%), diferenciación de neuronas (5%) y el control de la muerte neuronal (3,8%) que está de acuerdo con el siguiente ensayo de crecimiento de neurita.

Así, la estrategia que seleccionamos hace posible el acceso a todos los datos y permite una predicción de las funciones mediadas por EV antes de los ensayos biológicos que luego realizamos (Figura 5).

Figure 5
Figura 5: Ensayos f nocionales dependientes de EV. Los efectos de los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron en el crecimiento de la neurita (marco superior) y se evaluaron los efectos de los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en la invasión de células de glioma (marco inferior). (A, B) La longitud del neurito se midió en células PC-12 (el Panel A fue modificado de Raffo-Romero et al.16 con permiso) o neuronas primarias de rata (B). Los resultados mostraron un aumento significativo en los vehículos eléctricos (+ EVs) en comparación con el control (Ctrl). Barra de escala a 20 m. (C, D) Curso de tiempo de invasión de esferoides C6 en colágeno en presencia de EV derivados de macrófagos primarios de rata (C6 + EV) o vehículo (control C6). La invasión 3D de esferoide C6 en colágeno fue monitoreada y cuantificada hasta 6 días. La cuantificación de la invasión de células tumorales se muestra en 1, 2, 3 o 6 días (C) como se observa en las imágenes representativas (D). Barra de escala a 500 m. Para los ensayos de crecimiento de neurita, el significado se calculó mediante la prueba t delestudiante no realizada (* p < 0.05, ** p < 0.01 y *** p < 0.001). Para el ensayo de invasión, el significado se calculó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las barras de error indican un error estándar relativo de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

De esta manera, las funciones neurotróficas de los vehículos eléctricos derivados de la microglia se estudiaron en la línea celular PC-12 y las neuronas primarias de rata. Los resultados mostraron un efecto positivo en el crecimiento de la neurita (Figura 5A, B). La presencia de vehículos eléctricos aumentó respectivamente alrededor de 6 y 1,5 veces la red de neuritos en longitud y/o en número en PC-12 y neuronas primarias en comparación con una condición de control. En otro contexto, también estudiamos los efectos de los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en una invasión de tumor cerebral(Figura 5C,D). Se evaluó utilizando esferoides tumorales 3D incrustados en una matriz de colágeno. Los esferoides generados con células de glioma de rata C6 se cultivaron durante 6 días en una matriz de colágeno que contiene (o no contiene) EV purificados a partir de medios de cultivo de macrófagos de rata. La matriz de colágeno proporciona una estructura en la que las células tumorales pueden invadir y propagarse fuera del esferoide. Los vehículos eléctricos derivados de macrófagos deterioraron el crecimiento y la invasión de los esferoides del glioma. Después de un cultivo de 6 días, se observó una disminución del 50% de la invasión en los esferoides tratados con EV en comparación con el control. Este resultado mostró que los macrófagos pueden producir vehículos eléctricos con factores antitumorales y/o anti-invasivos que afectan el crecimiento del glioma.

Supplementary Figure S1
Figura suplementaria S1: Imágenes de membrana utilizada para el experimento de hinchazón occidental. (A) Imagen original de la mancha occidental de la Figura 2E (contra el marcador HSP90 EV). (B) Imagen de tinción Ponceau de la misma membrana que muestra la carga correcta de extractos proteicos de muestras 1F-EV-, 2F-EV+ y 3F-EV-. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El sistema nervioso central (SNC) es un tejido complejo en el que la comunicación de célula a célula regula las funciones neuronales normales necesarias para la homeostasis30. Los vehículos eléctricos ahora son ampliamente estudiados y descritos como cargas moleculares importantes para la comunicación de célula a célula31. Entregan específicamente un cóctel de mediadores a las células receptoras, afectando así a sus funciones en condiciones sanas y patológicas32. Estudios recientes indican que los vehículos eléctricos desempeñan un papel crucial en el SNC24,33,34 y especialmente los de las células inmunitarias del cerebro35,36. El equilibrio entre las respuestas inmunitarias pro y antiinflamatorias es crucial y permite mantener la integridad cerebral durante el desarrollo sináptico y las actividades neuronales a lo largo de la vida. En este estudio se discutieron dos situaciones distintas de respuestas inmunitarias: la relación (i) entre la microglia y las neuronas y ii) entre los macrófagos infiltrados y las células del glioma. En primer lugar, la microglia son los macrófagos residentes en el tejido cerebral donde desempeñan un papel inmune clave en el manejo de los cambios de microambientes con el fin de asegurar las actividades neuronales. Pero los mecanismos proinflamatorios excesivos pueden ser apoyados por microglia activada excesiva y conducir a trastornos neurodegenerativos37,,38. Por el contrario, los gliomas de alto grado requieren perfiles antiinflamatorios e involucran macrófagos asociados al tumor (TAM) reclutados en el sitio del tumor. Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) representan una gran población de estos TAIM en estrecha relación con las células del glioma. Bajo la influencia del tumor, los DMO exhiben perfiles antiinflamatorios in vivo y pro-tumorales39. La forma en que estos DMO podrían controlar la invasión in vitro de células tumorales es una pregunta crucial en este informe. Es por eso que, los vehículos eléctricos derivados de macrófagos se utilizaron solos en el ensayo de invasión esferoide de glioma. Juntos en el co-cultivo, las células del glioma habrían influido en los macrófagos para producir otras poblaciones de EV con perfiles antiinflamatorios. El uso directo de vehículos eléctricos inmunes podría ser mucho mejor que el agente antitumo tumoral. En consecuencia, las células inmunitarias mantienen la comunicación de célula a célula en microambientes específicos donde el equilibrio inflamatorio está fuertemente influenciado por las señales externas40,,41. La comprensión de las respuestas inmunitarias mediadas por EV representa un gran desafío para limitar la patogénesis de muchos trastornos. La identificación de contenidos de EV biológicamente activos es una clave para entender los procesos inflamatorios desregulados y proponer nuevas estrategias terapéuticas42,,43.

En este estudio presentamos una metodología que consiste en un proceso diferencial de ultracentrifugación como primer paso para eliminar los residuos celulares, los cuerpos apoptóticos y las moléculas solubles, combinado con cromatografía de exclusión de tamaño para aislar los vehículos eléctricos de los agregados moleculares. Cuando las poblaciones de EV se evalúan en ensayos biológicos, es crucial discriminar el contenido de EV de otros materiales coaislados. Es por eso que mejoramos el aislamiento con el fin de separar EV- de compuestos no asociados a EV. Mediante la adición de proteínas estándar en las muestras de control enviadas al procedimiento sec, pudimos localizar sus fracciones de elución por MALDI-TOF. Debido a que los estándares son moléculas libres, se coinopta a nivel mundial con agregados moleculares asociados a la muestra relacionados con materiales no EV. Por lo tanto, las fracciones EV de muestras experimentales fueron validadas en un procedimiento de aislamiento confiable. Además, desarrollamos una estrategia de análisis proteómico doble. Excepto el uso del anticuerpo anti-HSP90 por la hinchazón occidental como una detección preliminar de marcador EV, decidimos validar el fraccionamiento EV correcto mediante una detección no dirigida de firmas de proteínas asociadas a EV. De hecho, el enfoque actual no se centró deliberadamente en la detección de múltiples marcadores EV conocidos debido a la insuficiente especificidad y sensibilidad de ciertos anticuerpos. La variabilidad y la abundancia de algunos marcadores EV en la superficie de las subpoblaciones EV siguen siendo controvertidos en los procedimientos de aislamiento. Además, una metodología basada en anticuerpos podría representar un límite en un alto número de organismos debido a la falta de anticuerpos comerciales, mientras que los estudios de EV son ahora un tema candente en biología. Este análisis no dirigido permitió la identificación de un mayor número de moléculas que ya se describen como marcadores EV (86 proteínas en los 100 marcadores EV superiores de la base de datos Exocarta). Por último, este enfoque podría ser realmente útil para validar el aislamiento EV de organismos mal descritos, siempre que las proteínas detectadas puedan presentar homologías significativas a marcadores EV conocidos. Como se ha descrito recientemente, un análisis proteómico a gran escala podría ser una alternativa al uso de sólo unos pocos marcadores arbitrarios43. Esto mejoraría la discriminación de las fracciones EV+ y la identificación de sus contenidos activos antes de su uso en ensayos biológicos.

De hecho, es necesario asociar la caracterización de los contenidos de EV a los efectos que se observaron en los ensayos biológicos. De hecho, el impacto biológico de los vehículos eléctricos en las células receptoras sugiere que los mediadores o efectos vesiculares participen. Una vez más, el mismo análisis no dirigido permite la identificación de moléculas biológicamente activas. Una posible optimización en este análisis se refiere a los tipos de moléculas que es posible identificar. Nuestra estrategia se basó en el análisis a gran escala de las firmas de proteínas y condujo a vías biológicas predictivas asociadas a la respuesta inmune y la supervivencia de las neuronas. Es esencial considerar las otras familias de moléculas, incluyendo lípidos, ARNm y microRNAs, por ejemplo. Nuestros estudios actuales asocian estas identificaciones adicionales a las firmas de proteínas con el fin de obtener un conocimiento global de esta comunicación dependiente de EV.

Se prevén muchos enfoques terapéuticos en los próximos años. Dado que los vehículos eléctricos son capaces de cruzar fácilmente la barrera hematoencefálica y llegar a los tejidos patológicos, estos cargos moleculares se pueden utilizar de diferentes maneras. Aunque este estudio no resaltó las moléculas de superficie EV, su identificación sigue siendo necesaria para comprender mejor el proceso de direccionamiento hacia las células y tejidos diana. El análisis proteómico de nuestra metodología da acceso a estos datos. De lo contrario, en este informe, presentamos la producción in vitro de vehículos eléctricos como cócteles beneficiosos. No optimizamos las mejores condiciones para preparar o activar las células inmunitarias de antemano. Este punto es crucial porque, en los tejidos, el microambiente tiene un impacto directo en las células inmunitarias y, en última instancia, contribuye a dar forma a la biogénesis de sus vehículos eléctricos. En el caso del glioblastoma, por ejemplo, se ha encontrado que las células cancerosas producen sus propios vehículos eléctricos, contribuyendo así a orientar los TAI vecinos hacia perfiles antiinflamatorios y su inmunosupresión local44,,45. Esta es la razón por la que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en el entorno del glioma son diferentes de los producidos en un solo cultivo de macrófagos. Por lo tanto, utilizamos directamente EV derivados de macrófagos, producidos por separado a partir de un único cultivo de macrófagos, para controlar la invasión del esferoide del glioma porque un co-cultivo de macrófago-glioma no tiene control sobre el crecimiento tumoral. Otras estrategias terapéuticas podrían prevenir esta inmunosupresión in vivo mediante el uso de vehículos eléctricos proinflamatorios y antitumorales producidos in vitro a partir de macrófagos activados. Una estrategia similar podría ser utilizada en el contexto de enfermedades neurodegenerativas a través del uso de VEHÍCULOs eléctricos derivados de microglia debidamente alertado para producir una respuesta neuroprotectora y antiinflamatoria favoreciendo la supervivencia neuronal. En conclusión, los estudios de la comunicación mediada por EV entre las células inmunitarias y el microambiente in vivo son clave para permitir una mejor comprensión de la patogénesis y diseñar enfoques terapéuticos innovadores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo presentado contó con el apoyo del Ministerio de Educación Nacional, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos al BICeL- Campus Scientific City Facility por el acceso a instrumentos y consejos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier por la asistencia de espectrometría de masas. Agradecemos a Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli y Pierre-Eric Sautiére por su fuerte contribución a los avances científicos y técnicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Neurociencia Número 160 Funciones inmunes microglia macrófagos neuronas células de glioma vesículas extracelulares
Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter