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Neuroscience

Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

La presente relazione evidenzia i requisiti cronologici per l'isolamento delle vesciche extracellulari (EV) da microglia o macrofagi di sangue. Gli EV derivati dalla microglia sono stati valutati come regolatori dell'escrescenza di neurite, mentre gli EV derivati dai macrofaci di sangue sono stati studiati nel controllo dell'invasione delle cellule glioma C6 nei saggi in vitro. L'obiettivo è comprendere meglio queste funzioni EV come mediatori immunitari in microambienti specifici.

Abstract

Lo stato neuroinfiammatorio del sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo chiave nelle condizioni fisiologiche e patologiche. La microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, e talvolta i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMSDM), regolano il profilo infiammatorio del loro microambiente nel SNC. Ora è accettato che le popolazioni di vescicoli extracellulari (EV) provenienti da cellule immunitarie agiscano come mediatori immunitari. Pertanto, la loro raccolta e isolamento sono importanti per identificare il loro contenuto, ma anche valutare i loro effetti biologici sulle cellule riceventi. I dati attuali evidenziano i requisiti cronologici per l'isolamento degli EV dalle cellule della microglia o dai macrofagi del sangue, compresi i passi di ultracentrifugazione e cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC). Un'analisi proteomica non mirata ha permesso la convalida delle firme delle proteine come marcatori EV e ha caratterizzato il contenuto di EV biologicamente attivo. Gli EV derivati dalla microglia sono stati utilizzati anche funzionalmente sulla coltura primaria dei neuroni per valutarne l'importanza come mediatori immunitari nella escrescenza di neurite. I risultati hanno mostrato che i veicoli elettrici derivati dalla microglia contribuiscono a facilitare la escrescenza di neurite in vitro. Parallelamente, gli EV derivati dai macrofaci del sangue sono stati usati funzionalmente come mediatori immunitari nelle colture sferoidi delle cellule glioma C6, i risultati mostrano che questi EV controllano l'invasione delle cellule glioma in vitro. La presente relazione evidenzia la possibilità di valutare le funzioni delle cellule immunitarie mediate da EV, ma anche di comprendere le basi molecolari di tale comunicazione. Questa decifrazione potrebbe promuovere l'uso di vesciche naturali e/o la preparazione in vitro di vescicoli terapeutici al fine di imitare le proprietà immunitarie nel microambiente delle patologie del SNC.

Introduction

Molte neuropatologie sono legate allo stato neuroinfiammatorio che è un meccanismo complesso che è sempre più considerato, ma ancora poco compreso perché i processi immunitari sono diversi e dipendono dall'ambiente cellulare. Infatti, i disturbi del SNC non comportano sistematicamente gli stessi segnali di attivazione e le stesse popolazioni di cellule immunitarie e quindi le risposte pro o antinfiammatorie sono difficili da valutare come cause o conseguenze delle patologie. I macrofagi residenti nel cervello chiamati "microglia" sembrano essere all'interfaccia tra il sistema nervoso e il sistema immunitario1. La microglia ha un'origine mieloide e deriva dal sacco di tuorlo durante l'ematopoiesi primitiva per colonizzare il cervello, mentre i macrofagi periferici sono derivati dal fegato fetale durante l'ematopoiesi definitiva per diventare macrofagi periferici2. Le cellule di microglia comunicano con neuroni e cellule gliali derivate da neuroni come astrociti e oligodendrociti3. Diversi studi recenti hanno dimostrato che le microglia sono coinvolte nella plasticità neuronale durante lo sviluppo del SNC e l'omeostasi del tessuto adulto, e anche nello stato infiammatorio associato alle malattie neurodegenerative4,5. In caso contrario, l'integrità della barriera ematoence-encefalica può essere compromessa in altre patologie CNS. Le risposte immunitarie, soprattutto nel cancro del glioblastoma multiforme, non sono supportate solo dalle microglia come la barriera elica viene riorganizzata attraverso processi angiogenici e la presenza di vasi linfatici6,7. Pertanto, un'infiltrazione di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) si verifica nel tumore cerebrale durante i meccanismi di angiogenesi dipendenti dal tumore8. Le cellule tumorali esercitano un'influenza significativa sui BMM infiltrati che portano alle proprietà immunosoppressive e alla crescita del tumore9. Così la comunicazione tra le cellule immunitarie e il loro microambiente cerebrale è difficile da capire in quanto l'origine cellulare e i segnali di attivazione sono diversi10,11. È quindi interessante comprendere le funzioni delle firme molecolari associate alle cellule immunitarie in condizioni fisiologiche. A questo proposito, la comunicazione cellule-cellule tra cellule immunitarie e microambiente cellulare può essere studiata attraverso il rilascio di vesciche extracellulari (EV).

I VE sono sempre più studiati nella regolazione delle funzioni immunitarie in condizioni sane e patologiche12,13. Due popolazioni, esosomi e microvescicoli, possono essere prese in considerazione. Presentano diverse biogenesi e gamme di dimensioni. Gli esosomi sono vesciche di diametro compreso tra 30 e 150 nm e sono generati dal sistema endosomico e secreti durante la fusione di corpi multivessicolari (MVB) con la membrana plasmatica. I microvescicoli hanno un diametro di circa 100-1.000 nm e sono generati da un germogliamento esteriore dalla membrana plasmatica cellulare14. Poiché la discriminazione esosoma contro microvescicolo è ancora difficile da realizzare in base alle dimensioni e ai modelli molecolari, useremo solo il termine EV nella presente relazione. La comunicazione associata a EV nel SNC rappresenta un meccanismo ancestrale poiché gli studi hanno mostrato il loro coinvolgimento nelle specie invertebrate tra cui nematodi, insetti o annelidi15,16. Inoltre, i risultati che mostrano che i veicoli elettrici possono comunicare con cellule di diverse specie dimostrano che questo meccanismo è un sistema di blocco a chiave, basato prima sul riconoscimento superficie-molecola tra vescicoli e cellule riceventi e quindi consentendo l'assorbimento di mediatori16,17. Infatti, gli EVi contengono molte molecole come proteine (ad esempio, enzimi, trasduzione del segnale, fattore biogenesi), lipidi (ad esempio, ceramide, colesterolo) o acidi nucleici (ad esempio DNA, mRNA o miRNA) che agiscono come regolatori diretti o indiretti delle attività delle cellule riceventi14. Ecco perché sono stati effettuati studi metodologici anche sulle cellule immunitarie per isolare i veicoli elettrici e caratterizzare completamente le loro firme proteiche18,19.

I primi studi hanno dimostrato il rilascio di esosomi dalla microglia primaria di ratti coltivati come meccanismo inducibile dopo un'attivazione Wnt3a- o serotonina-dipendente20,21. Funzionalmente nel SNC, gli EV derivati dalla microglia regolano il rilascio di vesciboli era sinaptiche da terminali pressinaptici nei neuroni che contribuiscono al controllo dell'eccitabilità neuronale22,23. Gli EV derivati dalla microglia potrebbero anche propagare la risposta infiammatoria mediata da citochine nelle grandi regioni cerebrali24,25. È importante sottolineare che i diversi ligandi per la famiglia di recettori a pedaggio potrebbero attivare produzioni specifiche di veicoli elettrici nella microglia26. Ad esempio, studi in vitro mostrano che le linee cellulari microglia BV2 attivate da LPS producono contenuti EV differenziali, tra cui citochine pro-infiammatorie27. Pertanto, la diversità funzionale delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nel SNC, nella microglia e nell'infiltrazione di BMM, potrebbe essere valutata attraverso le proprie popolazioni di EV, tra cui l'impatto EV sulle cellule riceventi e l'identificazione del contenuto di EV.

In precedenza abbiamo descritto metodi per valutare le proprietà funzionali degli EV derivati da microglia e BMDM dopo il loro isolamento16,19. Nella presente relazione, proponiamo di valutare in modo indipendente l'effetto dei veicoli elettrici derivati dalla microglia sull'escrescenza dei neuriti e l'effetto dei VE derivati dai macrofaci sul controllo degli aggregati cellulari del glioma. Questo studio propone anche un'ampia analisi proteomica delle frazioni EV al fine di convalidare la procedura di isolamento EV e identificare le firme proteiche biologicamente attive. Gli effetti benefici e la decifrazione molecolare del contenuto di EV potrebbero aiutare la loro possibile manipolazione e uso come agenti terapeutici nei disturbi cerebrali.

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Protocol

1. Cultura primaria di microglia/macrofagi

  1. Cultura primaria della microglia
    1. Microglia primaria di ratto commerciale di coltura (2 x 106 cellule) (vedi la Tabella dei Materiali)nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero senza esosoma, 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL streptomicina e 9,0 g/glucosio a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
    2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 48 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.
  2. Cultura primaria dei macrofagi
    1. Coltura ratto commerciale macrofaages primario (1 x 106 cellule) nel mezzo fornito dal produttore (vedi la tabella dei materiali) a 37 e 5% CO2, con siero privo di esosomi.
    2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 24 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.

2. Isolamento dei veicoli elettrici

  1. Pre-isolamento dei veicoli elettrici dal mezzo condizionato
    1. Trasferire il mezzo di coltura condizionato dalle colture microglia o macrofagi (passaggi 1.1.2 o 1.2.2) in un tubo conico.
    2. Centrifuga a 1.200 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) per pellet le cellule.
    3. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo conico. Centrifuga a 1.200 x g per 20 min a RT per eliminare i corpi apoptotici.
    4. Trasferire il supernatante in un tubo in policarbonato da 10,4 mL e trasferire il tubo in un rotore Ti 70.1. Ultracentrifuga a 100.000 x g per 90 min a 4 gradi centigradi per pelletare gli EV.
    5. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet contenente eV in 200 .ll di 0,20 m filtrato fosfato buffer salina (PBS).
  2. Isolamento dei veicoli elettrici
    1. Preparazione della colonna cromatografia di esclusione delle dimensioni fatta in casa (SEC)
      1. Svuotare una colonna di cromatografia di vetro (lunghezza: 26 cm; diametro: 0,6 cm) (vedere la tabella dei materiali), lavarla e sterilizzarla.
      2. Posizionare un filtro di 60 m nella parte inferiore della colonna.
      3. Impilare la colonna con la matrice di filtrazione gel di agarose cross-linked per creare una fase stazionaria di un diametro di 0,6 cm e un'altezza di 20 cm.
      4. Risciacquare la fase con 50 mL di 0,20 m di PBS filtrato. Conservare a 4 gradi centigradi per essere utilizzati in un secondo momento, se necessario.
    2. Posizionare il pellet EV risospeso sopra la fase stazionaria della colonna SEC.
    3. Raccogliere 20 frazioni sequenziali di 250 gradi l pur continuando ad aggiungere PBS filtrato di 0,20 m sulla parte superiore della fase stazionaria per evitare l'essiccazione della colonna. Se necessario, conservare le frazioni a -20 gradi centigradi.
      NOT: Un'immagazzinamento più lungo di una settimana può essere eseguito a -80 gradi centigradi per mantenere l'integrità di EV per l'analisi molecolare.
  3. Analisi della spettrometria di massa della desorptiazione laser assistita a matrice delle frazioni SEC
    1. Procedere all'isolamento EV come descritto nella sezione 2.2.
    2. Risospendere il pellet EV con 200 l di soluzione di miscela di calibrazione peptide (vedere la Tabella dei Materiali).
    3. Procedere alla raccolta EV come descritto nelle sezioni da 2.2.1 a 2.2.3.
    4. Asciugare completamente la frazione con un concentratore a vuoto.
    5. Ricostituire le frazioni con 10 o L di 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA).
    6. Mescolare 1 -L di frazione ricostituita con 1 -L di matrice di acido idrinamomico (HCCA) su una piastra bersaglio in acciaio lucido MALDI.
    7. Analizza tutte le frazioni con uno spettrometro di massa MALDI.
    8. Analizzare gli spettri generati con un software dedicato (vedere Tabella dei materiali).

3. Caratterizzazione dei veicoli elettrici

  1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    NOTA:     L'analisi NTA viene eseguita con uno strumento di analisi del monitoraggio delle nanoparticelle (vedere la tabella dei materiali) e una pompa di siringa automatizzata.
    1. Effettuare una diluizione (intervallo da 1:50 a 1:500) di ogni frazione SEC dal punto 2.2.3 con PBS filtrato da 0,20 m.
    2. Vorticare la soluzione per eliminare gli aggregati EV.
    3. Mettere la soluzione diluita in una siringa da 1 mL e metterla nella pompa di siringa automatica.
    4. Regolare l'impostazione Fotocamera sul livello di guadagno dello schermo (3) e sul livello della fotocamera (13).
    5. Fare clic su Esegui e avviare lo script seguente.
      1. Caricare il campione nella camera di analisi (tasso di infusione: 1.000 per 15 s).
      2. Diminuire e stabilizzare il flusso di velocità per la registrazione video (velocità di infusione: 25 per 15 s). Cattura tre video da 60 s consecutivi del flusso di particelle.
      3. Regolare il livello della telecamera (13) e la soglia di rilevamento (3) prima dell'analisi dei video. Fare clic su Impostazioni. Ok per avviare l'analisi e fare clic su Esporta quando l'analisi è fatta.
    6. Tra ogni analisi frazionaria, lavare con 1 mL di 0,20 m di PBS filtrato.
  2. Analisi della microscopia elettronica (EM)
    1. Isolare i veicoli elettrici come descritto nella sezione 2.
      NOT: Non sono richieste condizioni sterili.
    2. Ripetere la sezione 3.1 per quantificare i veicoli elettrici.
      NOT: Solo le frazioni positive saranno utilizzate per l'analisi dei risultati.
    3. Utilizzare un filtro centrifugo da 50 kDa (vedere Tabella dei materiali)per concentrare le frazioni SEC contenenti EV.
    4. Risospendere gli EV concentrati in 30 -L del 2% di paraformaldeide (PFA).
    5. Caricare 10 l del campione su una griglia di rame rivestita in carbonio.
    6. Incubare per 20 min in un ambiente umido.
    7. Ripetere i passaggi 3.2.5 e 3.2.6 per un buon assorbimento del campione sulla griglia.
    8. Trasferire la griglia in una goccia di 1% glutaraldeide in PBS per 5 min a RT.
    9. Lavare il campione con acqua ultrapura più volte.
    10. Contrapporre il campione per 10 min sul ghiaccio con una miscela del 4% di acetato uranilo e 2% di metilcellulosa (1:9, v/v). Rimuovere l'eccesso di miscela utilizzando una carta da filtro.
    11. Asciugare il campione e osservarlo al microscopio elettronico a 200 kV (vedere la Tabella dei Materiali).
  3. Analisi delle macchie occidentali
    1. Estrazione di proteine
      1. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.3 per isolare e concentrare i veicoli elettrici.
      2. Miscelare 50 -L di buffer DI RIPA (150 mM di cloruro di sodio [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'-tetraacetic acido [EGTA], 2 mM acido etilenedia-tetractica [EDTA], 100 mM di fluoruro di sodio [NaF], 10 mM di pirofafosfato di sodio, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmetathanesulfonyl fluoruro [PMSF], 1x inibitore di proteasi) con il campione di EV (25 anni L risultante dalla concentrazione EV sul filtro) per 5 min ghiaccio su proteine.
      3. Sonicare per 5 s (ampiezza: 500 W; frequenza: 20 kHz), 3 volte sul ghiaccio.
      4. Rimuovere i detriti vescicolari con centrifugazione a 20.000 x g per 10 min, a 4 gradi centigradi.
      5. Raccogliere il supernatante e misurare la concentrazione proteica con il metodo di saggio della proteina Bradford.
    2. Sodio dodecyl solfato poliacrilamina gel elettroforesi (SDS-PAGE) e gonfiaggio occidentale
      1. Estraenti proteici mix (30 g) con buffer di campione 5c Laemmli (v/v).
      2. Caricare la miscela proteica su un gel poliacrilammide del 12%.
      3. Migrare le proteine nel gel con tampone TGS (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glycine, e 0.1% SDS), a 70 V per 15 min e 120 V per 45 min.
      4. Trasferire le proteine sulla membrana della nitrocellulosa con sistema semi-asciutto a 230 V per 30 min.
      5. Saturare la membrana per 1 h a RT con buffer di blocco (0,05% Tween 20 w/v, 5% latte in polvere w/v in PBS 0,1 M, pH 7,4).
      6. Incubare la membrana durante la notte a 4 gradi centigradi con l'anticorpo anti-umano di shock termico monoclonale del topo 90 (HSP90) diluito nel buffer di blocco (1:100).
      7. Lavare la membrana tre volte con PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) per 15 min.
      8. Incubare la membrana per 1 h a RT con anticorpo secondario IgG con coniugato di rafano di capra conossidasi anti-topo diluito diluito nel buffer di blocco (1:10,000).
        NOT: Un controllo negativo viene eseguito utilizzando solo anticorpi secondari.
      9. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 3.3.2.7).
      10. Rivelare la membrana con una maggiore chemiluminescenza (ECL) kit di substrato di gonfiazione occidentale (vedere Tabella dei materiali).
  4. Analisi proteomica
    1. Estrazione di proteine e digestione in gel
      1. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.3 per isolare e concentrare i veicoli elettrici. Ripetere il passaggio 3.3.1 per l'estrazione di proteine EV.
      2. Eseguire la migrazione delle proteine nel gel di impilamento di un gel poliacrilammide 12%.
      3. Fissare le proteine nel gel con coomassie blu per 20 min a RT.
      4. Accisa ogni pezzo di gel colorato e tagliarlo in piccoli pezzi di 1 mm3.
      5. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 gradi di ciascuna soluzione: acqua ultrapura per 15 min, 100% acetonitrile (ACN) per 15 min, 100 mm di bicarbonato di ammonio (NH4HCO3) per 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) per 15 min e 100% ACN per 5 min con agitazione continua.
      6. Asciugare completamente i pezzi di gel con concentratore a vuoto.
      7. Eseguire la riduzione delle proteine con 100 mL di 100 mM NH4HCO3 contenenti 10 mM dithiothreitol per 1 h a 56oC.
      8. Eseguire l'alchilazione proteica con 100 mL di 100 mM NH4HCO3 contenenti 50 mM iodoacetamide per 45 min al buio a RT.
      9. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 l di ogni soluzione: 100 mM di NH4HCO3 per 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) per 15 min e 100% ACN per 5 min con un agitazione continua.
      10. Asciugare completamente i pezzi di gel con un concentratore a vuoto.
      11. Eseguire la digestione delle proteine con 50 gradi l di trypsin (12,5 g/mL) in 20 mM NH4HCO3 durante la notte a 37 .
      12. Estrarre le proteine digerite dal gel con 50 - L di 100% ACN per 30 min a 37 gradi centigradi e poi 15 min a RT con agitazione continua.
      13. Ripetere due volte le seguenti procedure di estrazione: 50 : L del 5% TFA in 20 mM NH4HCO3 soluzione per 20 min con agitazione continua.
      14. Aggiungere 100 L di 100% ACN per 10 min con agitazione continua.
      15. Proteine digerite a secco con concentratore di vuoto e risospendono in 20 gradi l uno dello 0,1% di TFA.
      16. Desala il campione utilizzando una punta di pipetta da 10 luna con mezzi di deformazione inversa C18 per il desalamento e la concentrazione di peptidi (vedi tabella dei materiali) e peptidi elusi con acido formico ACN:0.1% (FA) (80:20, v/v).
      17. Asciugare completamente il campione con un concentratore di vuoto e risospendere in 20 gradi L di ACN:0.1% FA (2:98, v/v) per la spettrometria di massa tandem di cromato liquida (LC-MS/MS).
    2. LC-MS/MS Analisi
      1. Caricare il peptide digerito nello strumento LC-MS/MS ed eseguire l'analisi dei campioni e dei dati in base ai parametri descritti in dettaglio altrove42.
    3. Analisi dei dati grezzi
      1. Elaborare i dati di spettrometria di massa per identificare le proteine e confrontare le proteine identificate di ogni campione con un pacchetto software proteomico quantitativo utilizzando parametri standard.
      2. Esportare, utilizzando parametri standard, l'elenco delle proteine esclusive e sovrarappresentate da campioni positivi EV in un software che prevede reti proteiche e processi biologici.
      3. Confrontare l'elenco delle proteine identificate nelle frazioni con i primi 100 marcatori EV del database Open Access di Exocarta (vedere la Tabella dei materiali).

4. Analisi degli effetti EV funzionali

  1. Ansaggio delle esocre Neurite sulla linea cellulare PC-12
    1. Coltura PC12 linea cellulare in media DMEM completa (2 mM L-glutamine, 10% siero di cavallo fetale (FHS), 5% siero bovino fetale (FBS), 100 UI / mL penicillina, 100 g / mL streptomycin).
      NOT: I sera sono esosomiliberi in tutta la procedura.
    2. Aggiungere un vetro di copertura (tutti i pozzetti) a una piastra di 24 pozzetti; rivestire la piastra con poli-D-lysina (0,1 mg/mL) e seme 260.000 cellule/bene.
    3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
    4. Dopo 24 h di incubazione, cambiare il mezzo in dMEM medio (DMEM con 2 mM L-glutamina, 0.1% FHS, 100 UI/mL penicillina, 100g/mL streptomicina) con 1 x 106 microglia EV (dal punto 1.1.2).
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza microglia EV nel mezzo di differenziazione.
    5. Al giorno 4 dopo la seeding, caricare tutti i pozze con 100 l di mezzo DMEM completo.
    6. Al giorno 7 dopo la semina, fissare le cellule con 4% PFA per 20 min a RT e risciacquare tre volte (10 min ciascuno) con PBS.
    7. Macchiare le cellule con phalloidinr rhodamina coniugata per 30 min a 4 gradi centigradi e risciacquare 3 volte (10 min ciascuno) con PBS.
    8. Macchiare le cellule con Hoechst 33342 diluito (1:10,000) per 30 min a RT e risciacquare 3 volte (10 min ciascuno) con PBS.
    9. Montare il vetro di copertura su uno scivolo con supporto di montaggio fluorescente (vedere Tabella dei materiali).
    10. Analizzare la diapositiva con un microscopio confocale, prendere 5 immagini casuali di ogni diapositiva.
    11. Misurare la crescita neurite utilizzando un software di quantificazione automatica (lunghezza totale neurite) come descritto in dettaglio altrove43.
  2. Escrescenza di Neurite sui neuroni primari del ratto
    1. Ricoprire un vetrino a 8 pozzetti con poli-D-lysina (0,1 mg/mL) e laminina (20 g/mL).
    2. Coltura ratto neuroni primari commerciali in un mezzo di coltura appropriato (vedi Tabella dei materiali) placcando 50.000 cellule per pozzo e incubando le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 48 h.
      NOT: I sera sono esosomiti nell'intera procedura.
    3. Aggiungere 1 x 106 microglia EV al mezzo di coltura neuronale e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 48 h in più.
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza microglia EV nel mezzo di coltura del neurone.
    4. Seguire i passaggi da 4.1.6 a 4.1.9 per correggere e macchiare le celle.
    5. Seguire i passaggi 4.1.10 e 4.1.11 per analizzare la diapositiva.
  3. Invasione della cellula Glioma
    1. Risospendere le cellule del glioma del ratto C6 nel mezzo DMEM completo (DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotici) contenenti il 5% di collagene ad una concentrazione finale di 8.000 cellule in 20.
      NOT: I sera sono esosomiti nell'intera procedura.
    2. Posizionare 5 mL di PBS sul fondo di un piatto di coltura tissutale di 60 mm. Invertire il coperchio e le gocce di deposito di 20 l (8.000 celle) di sospensione cellulare sul fondo del coperchio.
    3. Invertire il coperchio sulla camera inferiore riempita da PBS e incubare la piastra a 37 e 5% DI CO2 per 72 h fino a formare sferoidi cellulari.
    4. Aggiungere 1 x 108 EV macrofalo (dal punto 1.2.2) a una miscela di collagene da 2,2 mg/mL (2 mL di soluzione di collagene bovino I [3 mg/mL] con 250 x 10x minimo mezzo essenziale (MEM) e 500 - L di 0,1 M di idrossido di sodio).
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza eV macrofaci nella miscela di collagene.
    5. Distribuire la miscela di collagene contenente eV in una piastra di 24 pozze per incorporare sferoidi cellulari.
    6. Impiantare gli sferoidi cellulari appena formati al centro di ogni pozzo.
    7. Incubare la piastra per 30 min a 37oC e 5% CO2 per solidificare il gel.
    8. Successivamente, sovrapporre 400 l di mezzo DMEM completo sulla matrice di collagene in ogni pozzo.
    9. Incubare il sistema completo per un totale di 6 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
      NOT: L'invasione cellulare fuori dallo sferoide è monitorata dalla fotografia digitale utilizzando un microscopio luminoso invertito utilizzando un obiettivo 4x/0.10 N.A.
    10. Acquisire immagini di ogni pozzo ogni giorno.
    11. Elaborare le immagini e quantificare l'invasione delle aree di sferoidi cellulari utilizzando il software come descritto in precedenza nel dettaglio42.
      NOT: Le aree di invasione e sferoide sono state normalizzate per ogni giorno alle aree di invasione e sferoidi misurate il giorno 0.

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Representative Results

Una delle principali sfide per attribuire gli effetti biologici alle vescicle extracellulari (EV) è la capacità di isolare i veicoli elettrici dall'intero mezzo di coltura. In questo rapporto, presentiamo un metodo che utilizza l'ultracentrifugation (UC) e la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) che è accoppiato all'analisi su larga scala delle firme proteiche per convalidare i marcatori EV e identificare i composti bioattivi. I vela di macrofago o microglia sono stati isolati dal mezzo condizionato rispettivamente dopo una coltura di 24 h o 48 h (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: strategie di raccolta e isolamento di Vesicle Extracellulari (EV). I corpi apoptotici e i detriti cellulari sono stati separati dal mezzo con microglia o macrofago con successive fasi di centrifugazione. Dal supernatore, i veicoli elettrici furono isolati dall'ultracentrifugazione (UC). Il pellet UC contenente EV è stato caricato su colonna e separato da cromatografia di esclusione di dimensioni (SEC) in 20 diverse frazioni eluite. Come rivelato nelle fasi successive (microscopia elettronica, analisi del tracciamento delle nanoparticelle e analisi proteomica), le frazioni SEC sono state raggruppate e organizzate in 1F-EV-, 2F-EV e 3F-EV-. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il metodo ha seguito le successive fasi di centrifugazione: il primo per rimuovere le cellule e il secondo per rimuovere i detriti cellulari e corpi apoptotici. Poi, il supernatante è stato trasferito in un nuovo tubo per eseguire un'ultracentrifugazione a 100.000 x g per 90 min. Le vesciche sono state raccolte insieme agli aggregati proteici nel pellet UC finale. Una colonna SEC è stata utilizzata per separare i composti in base alle dimensioni e rimuovere gli aggregati (Figura 1). Per confermare l'isolamento degli EV, ogni frazione SEC ha seguito un'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle(Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Analisi delle frazioni SEC. (A) Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) delle frazioni SEC. Il numero totale di particelle in ogni frazione SEC è presentato con grafici a barre. I grafici a barre arancioni mostrano le tre frazioni consecutive di EV (F5–F7). (B, C) Le catture di schermo della camera NTA mostrano differenze significative nel flusso di particelle tra le frazioni SEC. (D) Analisi complementare della spettrometria di massa MALDI. Da un altro pellet UC contenente EV, è stato aggiunto un set di peptidi di controllo standard prima della separazione SEC al fine di convalidare le prestazioni della strategia SEC. Ogni frazione SEC è stata analizzata con la ionizzazione della desorption laser assistita a matrice - tempo di volo (MALDI-TOF) per determinare le frazioni standard positive. Nei nove primi spettri (frazioni da 1 a 9), non è stato osservato alcun segnale. Il rilevamento di questi standard liberi è stato possibile nelle seguenti frazioni (frazioni da 10 a 20) che confermano la capacità della procedura SEC di separare gli EV (F5–F7) dai componenti solubili (F10–F20). (E) Analisi western delle frazioni SEC come analisi preliminare del marcatore EV. Le frazioni EV (F5–F7) sono state raggruppate come un campione (2F-VE) mentre le frazioni EV (rispettivamente F1–F4 e F8–F20) sono state raggruppate in altri due campioni denominati 1F-EV- e 3F-EV-. I risultati hanno mostrato la presenza di un segnale di proteina di shock termico 90 (HSP90) (marcatore positivo EV) in 2F-EV, e anche nel lysato cellulare come controllo positivo, rispetto alle altre frazioni (1F-EV- e 3F-EV-). (F, G) Analisi della microscopia elettronica del campione positivo di EV (2F-EV). L'osservazione sotto due ingrandimenti successivi ha rivelato la presenza di veicoli elettrici in un range di dimensioni intorno a 100 nm (frecce bianche) e circa 400 nm (punta di freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il numero di particelle era significativamente più alto nelle frazioni 5, 6 e 7 rispetto alle precedenti (F1–F4) e nelle seguenti (F8–F20). È stato possibile vedere un flusso di particelle in queste frazioni anche se sono state osservate poche particelle nelle frazioni seguenti (Figura 2B,C). Questa separazione non impedisce la possibilità che frazioni diverse da F5–F7 possano contenere una piccola quantità di vesciche, o anche che le frazioni ricche di EV da F5 a F7 possano contenere contaminanti molecolari. Per garantire almeno che le frazioni F5-F7 siano prive di molecole di co-eluizione, è stato necessario seguire l'elusione del percorso temporale dei diversi composti nella procedura SEC. Per farlo, gli standard di controllo del peptide sono stati aggiunti a un pellet UC simile utilizzato in precedenza. Questa preparazione è stata nuovamente separata utilizzando la procedura SEC. Quindi, è stata eseguita un'analisi della spettrometria di massa del desorption laser assistita a matrice : analisi del tempo di volo (MALDI) della spettrometria di massa al fine di identificare le frazioni SEC in cui sono state eluite gli standard (Figura 2D). A causa della gamma di massa, solo i prodotti ionizzati provenienti da standard peptidi sono stati seguiti in questa analisi. I risultati hanno mostrato che questi prodotti erano rilevabili nelle frazioni da 10 a 20, dimostrando che qualsiasi proteina solubile non può essere eguagliata nelle stesse frazioni degli EV (F5–F7). Questi risultati hanno confermato l'interesse di questo approccio nella separazione dei veicoli elettrici da componenti non EV. Anche supponendo che le frazioni F8–F20 potessero contenere una frazione residua di EV, abbiamo deciso nei seguenti esperimenti di combinare le frazioni positive EV (F5–F7) in un unico campione chiamato 2F-EV. Abbiamo anche combinato le altre frazioni SEC in due campioni chiamati 1F-EV- (F1–F4) e 3F-EV- (F8–F20). Abbiamo raggruppato in tre campioni per diversi motivi. In primo luogo, il numero di frazioni SEC aumenterebbe il tempo delle analisi molecolari ma anche degli studi funzionali in vitro. Le frazioni SEC positive e V mostrano separatamente un numero di particelle inferiore e compromettono anche la rilevazione di composti molecolari. Allo stesso modo, è stato considerato più giudizioso raggruppare le frazioni F8-F20 per concentrare, se necessario, le vesciche residue e verificare la loro presenza mediante un'analisi preventiva occidentale preliminare contro HSP90, un marcatore EV. È interessante notare che è stato rilevato un segnale positivo per HSP90 nella frazione 2F-EV, anche nella cella lysato come controllo positivo, ma non nei campioni 1F-EV- e 3F-EV-(Figura 2E e Supplementary Figure S1 come controllo). Questa analisi conferma l'interesse solo di 2F-EV e la corretta gestione delle precedenti frazioni SEC. Per affermare l'isolamento degli EV, un ulteriore esperimento che utilizza la microscopia elettronica ha analizzato solo il campione 2F-EV e ha permesso l'osservazione degli EV con una tipica morfologia e eterogeneità delle dimensioni tra 100 e 400 nm (Figura 2F,G).

Un altro passo chiave nella convalida è stato l'analisi proteomica (Figura 3). Abbiamo sviluppato un'analisi della spettrometria di massa completa con obiettivi multipli: (i) confermare l'isolamento degli EV con l'individuazione di un elevato numero di marcatori EV in 2F-EV, (ii) identificare infine le proteine contaminanti nei campioni negativi EV (1F-EV e 3F-EV-) e (iii) caratterizzano il contenuto proteico dei veicoli elettrici che sostengono le loro attività biologiche.

Figure 3
Figura 3: Analisi proteomica dei campioni EV positivi e Negativi Per EV. (A) Dopo tre sistemi indipendenti da simili preparati cellulari di microglia, i campioni 1F-EV-, 2F-EV e 3F-EV- sono stati caricati per l'elettroforesi gel di poliacrilamigia di sodio dodecyl (SDS-PAGE) e migrati fino al gel impilante per concentrare le proteine per realizzare la loro digestione in-digestiona. I peptidi risultanti sono stati poi analizzati dalla spettrometria di massa di tandem cromatografia liquida (LC-MS/MS) per identificare le proteine corrispondenti. (B) Confronto tra le proteine identificate tra i campioni 1F-EV- e 2F-EV, che mostrano proteine comuni in entrambe le frazioni (19) e proteine rilevate esclusivamente nella frazione 2F-EV (522). La mappa termica mostra la rappresentazione relativa in cui tutte le proteine comuni tra i triplicati 1F-EV-EV e 2F-EV sono state sovrarappresentate (rosse) nei campioni 2F-EV. (C) Confronto tra le proteine identificate tra le frazioni 2F-EV e 3F-EV- che mostrano proteine comuni tra triplicati (113) e proteine rappresentate esclusivamente (428 in 2F-EV e 11 in 3F-EV-). La mappa termica mostra la rappresentazione relativa in due cluster. Uno (cluster A) presenta 5 proteine sovrarappresentate nel campione 3F-EV- e un secondo (cluster B) presenta 108 proteine sovrarappresentate in 2F-EV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Da supporti con condizioni cellulari, la procedura UC e SEC ha portato a tre campioni 1F-EV-, 2F-EV e 3F-EV-. Le proteine corrispondenti sono state estratte e concentrate dall'elettroforesi gel di poliacrita di sodio dodecyl (SDS-PAGE). Dopo una breve migrazione nel gel di impilamento, i campioni sono stati raccolti da un'escissione a banda, trasferita in tubi distinti per essere digeriti in gel. I prodotti sono stati separati da cromatografia a fase invertita online direttamente accoppiata ad uno spettrometro di massa per l'analisi (Figura 3A).

I seguenti risultati, come esempio dell'intera procedura, sono stati ottenuti da un mezzo in microglia, dopo una coltura di 48 ore. I dati grezzi sono stati inviati a un database di proteine Rat. Le proteine identificate sono state confrontate tra i campioni 1F-EV- e 2F-EV (Figura 3B) e tra i campioni 2F-EV e 3F-EV- (Figura 3C). Nel primo confronto, il diagramma di Venn ha mostrato 19 proteine comuni in entrambe le frazioni e 522 proteine rilevate esclusivamente nella frazione 2F-EV. L'analisi utilizzando un software proteomico quantitativo ha permesso l'identificazione della rappresentazione relativa delle proteine comuni. I risultati hanno mostrato una mappa termica in cui tutte le proteine comuni tra i triplicati 1F-EV-EV e 2F-EV sono state sovrarappresentate (rosse) nei campioni 2F-EV. Nel secondo confronto tra le frazioni 2F-EV e 3F-EV-, sono state identificate 113 proteine comuni tra i triplicati. Inoltre, 428 proteine sono state rilevate esclusivamente in 2F-EV e 11 proteine sono state trovate esclusivamente in 3F-EV-. Dopo l'analisi quantitativa, la rappresentazione della heatmap delle 113 proteine comuni ha evidenziato due cluster in cui il cluster A presentava cinque proteine sovrarappresentate nel campione 3F-EV- e il cluster B presentava 108 proteine sovrarappresentate in 2F-EV.

Le 428 proteine rappresentate esclusivamente e le 108 proteine sovrarappresentate in 2F-EV sono state inviate al database ad accesso aperto Exocarta al fine di rilevare molecole associate agli EV. L'analisi dei primi 100 marcatori EV in Exocarta ha evidenziato la presenza di 86 proteine associate a EV in 2F-EV (Figura 4A).

Figure 4
Figura 4: Analisi delle proteine del campione 2F-EV. (A) Un pool di 536 proteine (428 proteine esclusive e 108 sovrarappresentate) è stato sottoposto al database Exocarta per rilevare molecole associate all'EV. Simboli molecolari delle 86 proteine associate agli EV rilevati nei primi 100 marcatori EV dal database Exocarta. (B) La previsione delle interazioni proteiche e la loro associazione a processi biologici selezionati hanno mostrato vie immunitarie e neuroprotettive nel campione 2F-EV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

È interessante notare che l'analisi delle 5 proteine comuni nel cluster A e delle 11 proteine rappresentate esclusivamente in 3F-EV- non sono state associate ad alcun marcatore EV (dati non mostrati). Infine, la previsione delle interazioni proteiche e la loro associazione con processi biologici selezionati hanno mostrato la presenza nella frazione 2F-EV dei mediatori immunitari (21%) a volte coinvolti nel controllo della risposta infiammatoria (4,1%) (Figura 4B). Anche il contenuto di EV in 2F-EV è stato associato allo sviluppo neuronale (16,8%), alla differenziazione dei neuroni (5%) e il controllo della morte neuronale (3,8%) che è in conformità con il seguente saggio neurite escrescenza.

Così, la strategia che abbiamo selezionato rende possibile l'accesso di tutti i dati e permette una previsione delle funzioni mediate EV prima dei test biologici che abbiamo poi eseguito (Figura 5).

Figure 5
Figura 5: saggi f unctional dipendenti da EV. Gli effetti dei VE derivati dalla microglia sono stati valutati sull'escrescenza di neurite (fotogramma superiore) e gli effetti dei veli derivati dai macrofaci sono stati valutati sull'invasione delle cellule glioma (telaio inferiore). (A, B) La lunghezza dei neuriti è stata misurata sulle cellule PC-12 (il gruppo A è stato modificato da Raffo-Romero et al.16 con permesso) o neuroni primari del ratto (B). I risultati hanno mostrato un significativo aumento della crescita nei veicoli elettrici (EV) rispetto al controllo (Ctrl). Barra di scala - 20 m. (C, D) Corso di tempo di invasione sferoide glioma C6 nel collagene in presenza di EV derivati da macrofano primario di ratto (C6 e Veicoli) o veicolo (controllo C6). L'invasione 3D dello sferoide C6 nel collagene è stata monitorata e quantificata fino a 6 giorni. La quantificazione dell'invasione delle cellule tumorali è indicata a 1, 2, 3 o 6 giorni (C) come osservato sulle immagini rappresentative (D). Barra della scala: 500 m. Per i saggi di escrescenza neurite, il significato è stato calcolato dal test t-di Student non accoppiato (sezione p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001). Per il test di invasione, il significato è stato calcolato da ANOVA di sola andata seguito dal test post hoc di Tukey. Le barre di errore indicano un errore standard relativo di tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo modo, le funzioni neurotrofie degli EV derivati dalla microglia sono state studiate sui neuroni primari della linea cellulare e del ratto PC-12. I risultati hanno mostrato un effetto positivo sull'escrescenza neurite (Figura 5A,B). La presenza di EV è aumentata rispettivamente di circa 6 e 1,5 volte la rete neurite in lunghezza e/o in numero in PC-12 e neuroni primari rispetto a una condizione di controllo. In un altro contesto, abbiamo anche studiato gli effetti dei vela derivati dai macrofafi su un'invasione del tumore al cervello (Figura 5C,D). È stato valutato utilizzando sferoidi tumorali 3D incorporati in una matrice di collagene. Gli sferoidi generati con cellule di glioma di ratto C6 sono stati coltivati per 6 giorni in una matrice di collagene contenente (o non contiene) EV purificati dal mezzo di coltura dei macrofagi di ratto. La matrice di collagene fornisce una struttura in cui le cellule tumorali possono invadere e diffondersi dallo sferoide. Gli EV derivati dai macrofafi alterò la crescita e l'invasione degli sferoidi del glioma. Dopo una cultura di 6 giorni, una diminuzione del 50% dell'invasione è stata osservata negli sferoidi trattati con EV rispetto al controllo. Questo risultato ha mostrato che i macrofagi possono produrre EV con fattori anti-tumorali e/o anti-invasivi che influenzano la crescita del glioma.

Supplementary Figure S1
Figura supplementare S1: Immagini di membrana utilizzate per l'esperimento di gonfiore occidentale. (A) Immagine originale della macchia occidentale della figura 2E (contro marcatore HSP90 EV). (B) Immagine colorante Ponceau della stessa membrana che mostra il corretto caricamento di estratti proteici da campioni 1F-EV-, 2F-EV e 3F-EV-. Clicca qui per scaricare questa figura.

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Discussion

Il sistema nervoso centrale (CNS) è un tessuto complesso in cui la comunicazione da cellula a cellula regola le normali funzioni neuronali necessarie per l'omeostasi30. I veicoli elettrici sono ora ampiamente studiati e descritti come importanti carichi molecolari per la comunicazione da cellula a cellula31. Essi forniscono specificamente un cocktail di mediatori alle cellule dei destinatari influenzando così le loro funzioni in condizioni sane e patologiche32. Recenti studi indicano che i veicoli elettrici svolgono un ruolo cruciale nel CNS24,33,34 e soprattutto quelli delle cellule immunitarie cerebrali35,36. L'equilibrio tra risposte immunitarie pro e antinfiammatorie è cruciale e consente di mantenere l'integrità del cervello durante lo sviluppo sinaptico e le attività neuronali per tutta la vita. In questo studio sono state discusse due situazioni distinte di risposte immunitarie: la relazione (i) tra microglia e neuroni e (ii) tra macrofagi infiltranti e cellule glioma. In primo luogo, le microglia sono i macrofagi residenti nel tessuto cerebrale in cui svolgono un ruolo immunitario chiave nella gestione dei cambiamenti del microambiente al fine di garantire le attività neuronali. Ma i meccanismi pro-infiammatori eccessivi possono essere supportati da microglia sovraattivate e portare a disturbi neurodegenerativi37,38. Al contrario, i gliomi di alta qualità richiedono profili antinfiammatori e coinvolgono macrofagi associati al tumore (TAM) reclutati nel sito tumorale. I macrofagi derivati dal midollo osseo (BME) rappresentano una grande popolazione di questi TAM in stretta relazione con le cellule del glioma. Sotto l'influenza del tumore, i BMM presentano profili antinfiammatori e pro-tutumorali in vivo39. In che modo questi BMM potrebbero controllare l'invasione delle cellule tumorali in vitro è una questione cruciale in questa relazione. Ecco perché, i Cru derivati dai macrofafi sono stati usati da soli nel saggio di invasione degli sferoidi glioma. Insieme in co-cultura, le cellule del glioma avrebbero influenzato i macrofagi a produrre altre popolazioni di EV con profili antinfiammatori. L'uso diretto di EV immunitari potrebbe essere molto meglio come agente anti-tumorale. Di conseguenza, le cellule immunitarie mantengono la comunicazione da cellula a cellula in microambienti specifici in cui l'equilibrio infiammatorio è fortemente influenzato dai segnali esterni40,41. La comprensione delle risposte immunitarie mediate da EV rappresenta una grande sfida per limitare la patogenesi di molti disturbi. L'identificazione di contenuti EV biologicamente attivi è una chiave per comprendere i processi infiammatori disregolati e proporre nuove strategie terapeutiche42,43.

In questo studio presentiamo una metodologia che consiste in un processo di ultracentrifugazione differenziale come primo passo per eliminare i detriti cellulari, i corpi apoptotici e le molecole solubili, combinati con la cromatografia di esclusione delle dimensioni per isolare gli EV dagli aggregati molecolari. Quando le popolazioni di EV sono valutate in analisi biologiche, è fondamentale discriminare il contenuto di EV da altri materiali co-isolati. Ecco perché abbiamo migliorato l'isolamento al fine di separare i composti EV- da quelli non associati agli EV. Aggiungendo proteine standard nei campioni di controllo presentati alla procedura SEC, siamo stati quindi in grado di localizzare le loro frazioni di eluizione da MALDI-TOF. Poiché gli standard sono molecole libere, globalmente co-eludono con aggregati molecolari associati al campione relativi a materiali non EV. Pertanto, le frazioni EV di campioni sperimentali sono state convalidate in una procedura di isolamento affidabile. Inoltre, abbiamo sviluppato una doppia strategia di analisi proteomica. Ad eccezione dell'uso dell'anticorpo anti-HSP90 da parte del blotting occidentale come rilevamento preliminare del marcatore EV, abbiamo deciso di convalidare la corretta frazione EV mediante un rilevamento non mirato delle firme proteiche associate agli EV. Infatti, l'approccio attuale non si è deliberatamente focalizzato sull'individuazione di più marcatori EV noti a causa dell'insufficiente specificità e sensibilità di alcuni anticorpi. La variabilità e l'abbondanza di alcuni marcatori EV sulla superficie delle sottopopolazioni EV sono ancora controverse nelle procedure di isolamento. Inoltre, una metodologia basata sugli anticorpi potrebbe rappresentare un limite in un elevato numero di organismi a causa della mancanza di anticorpi commerciali, mentre gli studi EV sono ora un argomento caldo in biologia. Questa analisi non mirata ha permesso l'identificazione di un maggior numero di molecole che sono già descritte come marcatori EV (86 proteine nei primi 100 marcatori EV dal database Exocarta). Infine, questo approccio potrebbe essere davvero utile per convalidare l'isolamento degli EV da organismi mal descritti a condizione che le proteine rilevate possano presentare omologie significative ai marcatori EV noti. Come descritto di recente, un'analisi proteomica su larga scala potrebbe essere un'alternativa all'utilizzo di pochi marcatori arbitrari43. Ciò migliorerebbe la discriminazione delle frazioni di EV e l'identificazione del loro contenuto attivo prima dell'uso nei saggi biologici.

Infatti, è necessario associare la caratterizzazione dei contenuti EV agli effetti osservati nei saggi biologici. Infatti, l'impatto biologico dei VE per le cellule ricandotrici suggerisce che i mediatori o gli effetti vescicolari siano coinvolti. Anche in questo caso, la stessa analisi non mirata consente l'identificazione di molecole biologicamente attive. Una possibile ottimizzazione in questa analisi riguarda i tipi di molecole che è possibile identificare. La nostra strategia si basava sull'analisi su larga scala delle firme proteiche e ha portato a percorsi biologici predittivi associati alla risposta immunitaria e alla sopravvivenza dei neuroni. È essenziale considerare, ad esempio, le altre famiglie di molecole, tra cui lipidi, mRNA e microRNA. I nostri studi attuali associano queste identificazioni aggiuntive alle firme delle proteine al fine di ottenere una conoscenza globale di questa comunicazione dipendente da EV.

Molti approcci terapeutici sono previsti nei prossimi anni. Dato che gli EV sono in grado di attraversare facilmente la barriera ematoencefalica e raggiungere i tessuti patologici, questi carichi molecolari possono essere utilizzati in modi diversi. Anche se questo studio non ha evidenziato le molecole superficiali evideole, la loro identificazione è ancora necessaria per comprendere meglio il processo di indirizzamento verso le cellule e i tessuti bersaglio. L'analisi proteomica nella nostra metodologia dà accesso a questi dati. In caso contrario, in questa relazione, abbiamo presentato la produzione in vitro di veicoli elettrici come cocktail benefici. Non abbiamo ottimizzato le migliori condizioni per innescare o attivare le cellule immunitarie in anticipo. Questo punto è cruciale perché, nei tessuti, il microambiente ha un impatto diretto sulle cellule immunitarie e, in ultima analisi, contribuisce a plasmare la biogenesi dei loro EV. Nel caso del glioblastoma, ad esempio, è stato scoperto che le cellule tumorali producono i propri EV, contribuendo così a orientare i TAB vicini verso profili antinfiammatori e la loro immunosoppressione locale44,45. Questo è il motivo per cui i VE derivati dai macrofaci nell'ambiente glioma sono diversi da quelli prodotti in un'unica coltura di macrofafi. Così, abbiamo usato direttamente eV derivati da macrofaci, prodotti separatamente da una singola coltura di macrofaci, per controllare l'invasione degli sferoidi del glioma perché una co-cultura macrofacio-glioma non ha alcun controllo sulla crescita del tumore. Ulteriori strategie terapeutiche potrebbero prevenire questa immunosoppressione in vivo utilizzando EV pro-infiammatori e antitumorali prodotti in vitro da macrofagi attivati. Una strategia simile potrebbe essere utilizzata nel contesto delle malattie neurodegenerative attraverso l'uso di EV derivati dalla microglia adeguatamente avvisati per produrre una risposta neuroprotettiva e antinfiammatoria a favore della sopravvivenza neuronale. In conclusione, gli studi sulla comunicazione mediata da EV tra le cellule immunitarie e il microambiente in vivo sono fondamentali per consentire una migliore comprensione della patogenesi e progettare approcci terapeutici innovativi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il lavoro presentato è stato sostenuto dalla Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Ringraziamo con gratitudine lo strumento BICeL- Campus Scientific City per l'accesso a strumenti e consigli tecnici. Ringraziamo jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier per l'assistenza alla spettrometria di massa. Ringraziamo con gratitudine Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière per il loro forte contributo agli sviluppi scientifici e tecnici.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

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Neuroscienze Problema 160 Funzioni immunitarie microglia macrofagi neuroni cellule glioma vescicoli extracellulari
Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare
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Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

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