Neuroscience

प्रतिरक्षा सेल-व्युत्पन्न एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स का लक्षण वर्णन और सेल पर्यावरण पर कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करना

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118

Quentin Lemaire¹, Marie Duhamel¹, Antonella Raffo-Romero¹, Michel Salzet¹, Christophe Lefebvre¹

¹U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

वर्तमान रिपोर्ट में माइक्रोग्लिया या रक्त मैक्रोफेज से एक्सट्रासेलुलर वेसिकल (ईवी) अलगाव के लिए कालक्रम आवश्यकताओं पर प्रकाश डाला गया है। माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस का मूल्यांकन न्यूराइट आउटग्रोथ के नियामकों के रूप में किया गया जबकि रक्त मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का अध्ययन इन विट्रो assays में C6 ग्लियोमा सेल आक्रमण के नियंत्रण में किया गया था । लक्ष्य विशिष्ट माइक्रोवातावरण में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में इन ईवी कार्यों को बेहतर ढंग से समझना है।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की न्यूरोभड़काऊ स्थिति शारीरिक और रोग की स्थितियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं, और कभी-कभी घुसपैठ करने वाली अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम), सीएनएस में उनके माइक्रोएनवायरमेंट के भड़काऊ प्रोफ़ाइल को विनियमित करती हैं। अब यह स्वीकार किया जाता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बाह्य वेसिकल (ईवी) आबादी प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में कार्य करती है। इस प्रकार, उनके संग्रह और अलगाव उनकी सामग्री की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर उनके जैविक प्रभावों का मूल्यांकन भी करते हैं। वर्तमान डेटा अल्ट्रासेन्ट्रियूजन और आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) चरणों सहित माइक्रोग्लिया कोशिकाओं या रक्त मैक्रोफेज से ईवी अलगाव के लिए कालक्रम आवश्यकताओं को उजागर करता है। एक गैर-लक्षित प्रोटेओमिक विश्लेषण ने ईवी मार्कर के रूप में प्रोटीन हस्ताक्षरों के सत्यापन की अनुमति दी और जैविक रूप से सक्रिय ईवी सामग्री की विशेषता बताई। न्यूराइट आउटग्रोथ में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में उनके महत्व का आकलन करने के लिए माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति पर भी कार्यात्मक रूप से किया गया था। परिणामों से पता चला है कि माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस विट्रो में न्यूराइट आउटग्रोथ को सुविधाजनक बनाने में योगदान देते हैं । समानांतर में, रक्त मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग सी6 ग्लियोमा कोशिकाओं की स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में कार्यात्मक रूप से किया जाता था, परिणाम दिखाते हैं कि ये ईवीएस विट्रो में ग्लियोमा सेल आक्रमण को नियंत्रित करते हैं। इस रिपोर्ट में ईवी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों का मूल्यांकन करने की संभावना पर प्रकाश डाला गया है, लेकिन इस तरह के संचार के आणविक ठिकानों को भी समझते हैं । यह गूढ़ प्राकृतिक वेसिकल्स के उपयोग को बढ़ावा दे सकता है और/या सीएनएस विकृतियों के सूक्ष्म वातावरण में प्रतिरक्षा गुणों की नकल करने के लिए चिकित्सीय वेसिकल्स की इन विट्रो तैयारी ।

Introduction

कई न्यूरोपैथोलॉजी न्यूरो-भड़काऊ स्थिति से संबंधित हैं जो एक जटिल तंत्र है जिसे तेजी से माना जाता है, लेकिन फिर भी खराब समझा जाता है क्योंकि प्रतिरक्षा प्रक्रियाएं विविध हैं और कोशिका पर्यावरण पर निर्भर करती हैं। दरअसल, सीएनएस विकारों में व्यवस्थित रूप से एक ही सक्रियण संकेतऔर प्रतिरक्षा कोशिका आबादी शामिल नहीं है और इस प्रकार समर्थक या विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन रोगों के कारणों या परिणामों के रूप में करना मुश्किल है। "माइक्रोग्लिया" नामक मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज तंत्रिका और प्रतिरक्षा प्रणाली¹के बीच इंटरफेस पर दिखाई देते हैं। माइक्रोग्लिया में एक माइलॉयड मूल होता है और मस्तिष्क को उपनिवेश बनाने के लिए आदिम हेमेटोपोइसिस के दौरान जर्दी थैली से प्राप्त होते हैं, जबकि परिधीय मैक्रोफेज निश्चित हेमेटोपोइसिस के दौरान भ्रूण यकृत से परिधीय मैक्रोफेज²बनने के लिए प्राप्त होते हैं। माइक्रोग्लिया कोशिकाएं न्यूरॉन्स और न्यूरॉन-व्युत्पन्न ग्लियल कोशिकाओं जैसे एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स³के साथ संवाद करती हैं। हाल के कई अध्ययनों से पता चला है कि माइक्रोग्लिया सीएनएस विकास और वयस्क ऊतक होमोस्टोसिस के दौरान न्यूरोनल प्लास्टिसिटी में शामिल हैं, और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों^सेजुड़े भड़काऊ राज्य में भी^4,^5। अन्यथा, रक्त मस्तिष्क बाधा की अखंडता अन्य सीएनएस विकृतियों में समझौता किया जा सकता है। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं, विशेष रूप से ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफोर्म कैंसर में, केवल माइक्रोग्लिया कोशिकाओं द्वारा समर्थित नहीं हैं क्योंकि रक्त मस्तिष्क बाधा एंजियोजेनिक प्रक्रियाओं और लिम्फेटिक जहाजों की उपस्थिति^6,^,⁷के माध्यम से पुनर्गठित की जाती है। इसलिए, ट्यूमर पर निर्भर एंजियोजेनेसिस तंत्र⁸भर में ब्रेन ट्यूमर में एक बड़ी अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) घुसपैठ होती है। कैंसर कोशिकाएं घुसपैठ बीएमडीएम पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालती हैं जिससे इम्यूनोसप्रेसिव गुण और ट्यूमर विकास⁹होता है । इस प्रकार प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके मस्तिष्क के सूक्ष्म वातावरण के बीच संचार को समझना मुश्किल है क्योंकि कोशिका मूल और सक्रियण संकेत विविध¹⁰^,¹¹हैं । इस प्रकार शारीरिक परिस्थितियों में प्रतिरक्षा कोशिका से जुड़े आणविक हस्ताक्षरों के कार्यों को पकड़ना दिलचस्प है। इस संबंध में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और सेल माइक्रोएनवायरमेंट के बीच सेल-सेल संचार का अध्ययन एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) की रिहाई के माध्यम से किया जा सकता है।

ईवीएस का अध्ययन स्वस्थ और रोग की स्थिति¹²^,¹³में प्रतिरक्षा कार्यों के नियमन में अधिक से अधिक किया जा रहा है । दो आबादी, एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स को ध्यान में रखा जा सकता है। वे विभिन्न जैव उत्पत्ति और आकार पर्वतमाला पेश करते हैं। एक्सोसोम ~ 30-150 एनएम व्यास के वेसिकल्स हैं और एंडोसोमल सिस्टम से उत्पन्न होते हैं और प्लाज्मा झिल्ली के साथ मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के संलयन के दौरान स्रावित होते हैं। माइक्रोवेसिकल्स व्यास में लगभग 100-1,000 एनएम होते हैं और सेल प्लाज्मा झिल्ली¹⁴से एक जावक नवोदित द्वारा उत्पन्न होते हैं। क्योंकि एक्सोसोम बनाम माइक्रोवेसिकल भेदभाव अभी भी आकार और आणविक पैटर्न के अनुसार महसूस करना मुश्किल है, हम केवल वर्तमान रिपोर्ट में ईवीएस शब्द का उपयोग करेंगे । सीएनएस में ईवी-संबद्ध संचार एक पैतृक तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि अध्ययनों से निमाटोड, कीड़े या एनेलिड्स^15,^,¹⁶सहित अकशेरुकी प्रजातियों में उनकी भागीदारी दिखाई गई। इसके अलावा, यह दर्शाने वाले परिणाम कि ईवीएस विभिन्न प्रजातियों की कोशिकाओं के साथ संवाद कर सकता है, इस तंत्र को एक कुंजी-लॉक प्रणाली के रूप में प्रदर्शित करता है, जो पहले वेसिकल्स और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच सतह-अणु मान्यता पर आधारित होता है और फिर^{मध्यस्थों 16,}^,¹⁷के तेज होने की अनुमति देता है। दरअसल, ईवीएस में प्रोटीन (जैसे, एंजाइम, सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन, बायोजेनेसिस फैक्टर), लिपिड (जैसे, सेरामाइड, कोलेस्ट्रॉल) या न्यूक्लिक एसिड (जैसे, डीएनए, एमआरएनए या मिरना) जैसे कई अणु होते हैं जो प्राप्तकर्ता सेल गतिविधियों¹⁴के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष नियामकों के रूप में कार्य करते हैं। यही कारण है कि ईवीएस को अलग करने और¹⁸^,¹⁹के प्रोटीन हस्ताक्षरों की पूरी तरह से विशेषता के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर पद्धतिगत अध्ययन भी किए गए .

शुरुआती अध्ययनों ने प्राथमिक सुसंस्कृत चूहे माइक्रोग्लिया से एक उत्कर्दित तंत्र के रूप में एक्सोसोम की रिहाई को एक Wnt3a-या सेरोटोनिन-निर्भर सक्रियण^20,^,²¹के बाद प्रदर्शित किया। सीएनएस में कार्यात्मक रूप से, माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस न्यूरॉन्स में प्रेसनैप्टिक टर्मिनलों द्वारा सिनैप्टिक वेसिकल रिलीज को विनियमित करता है जो न्यूरोनल एक्सीबिलिटी^22,^,²³के नियंत्रण में योगदान देता है। माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों^24,^,²⁵में साइटोकिन्स-मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया का प्रचार भी कर सकता है । महत्वपूर्ण बात, टोल की तरह रिसेप्टर परिवार के लिए विविध ligands माइक्रोग्लिया²⁶में EVs के विशिष्ट प्रस्तुतियों को सक्रिय कर सकता है । उदाहरण के लिए, इन विट्रो अध्ययनों से पता चलता है कि एलपीएस-सक्रिय माइक्रोग्लिया बीवी 2 सेल लाइनें प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स²⁷सहित अंतर ईवी सामग्री का उत्पादन करती हैं। इसलिए, सीएनएस, माइक्रोग्लिया और घुसपैठ बीएमडब्ल्यूएम में प्रतिरक्षा कोशिका उपआबादी की कार्यात्मक विविधता का मूल्यांकन प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर ईवी प्रभाव और ईवी सामग्री की पहचान सहित उनकी स्वयं की ईवी आबादी के माध्यम से किया जा सकता है।

हमने पहले माइक्रोग्लिया और बीएमडीएम-व्युत्पन्न ईवीएस के कार्यात्मक¹⁶^,¹⁹गुणों का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन किया था। वर्तमान रिपोर्ट में, हम न्यूराइट आउटग्रोथ पर माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभाव और ग्लियोमा सेल समुचित के नियंत्रण पर मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभाव का स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन करने का प्रस्ताव करते हैं। इस अध्ययन में ईवी अलगाव प्रक्रिया को मान्य करने के साथ-साथ जैविक रूप से सक्रिय प्रोटीन हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए ईवी अंशों के व्यापक प्रोटेओमिक विश्लेषण का भी प्रस्ताव है। लाभकारी प्रभाव और EV सामग्री के आणविक गूढ़ उनके संभावित हेरफेर और मस्तिष्क विकारों में चिकित्सीय एजेंटों के रूप में उपयोग में मदद कर सकता है ।

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Protocol

1. माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज की प्राथमिक संस्कृति

माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृति
1. संस्कृति वाणिज्यिक चूहा प्राथमिक माइक्रोग्लिया (2 x 10⁶ कोशिकाओं) (सामग्री की मेजदेखें) Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में 10% exosome मुक्त सीरम, पेनिसिलिन के १०० यू/mL, १०० μg/mL streptomycin, और ९.० जी/एल ग्लूकोज ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂।
2. 48 एच संस्कृति के बाद वातानुकूलित माध्यम को इकट्ठा करें और ईवीएस के अलगाव के लिए आगे बढ़ें।
मैक्रोफेज की प्राथमिक संस्कृति
1. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए माध्यम में संस्कृति वाणिज्यिक चूहा प्राथमिक मैक्रोफेज (1 x 10⁶ कोशिकाएं) (सामग्री की तालिकादेखें) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂में, एक्सोसोम-मुक्त सीरम के साथ।
2. एक 24 घंटे संस्कृति के बाद वातानुकूलित माध्यम ले लीजिए और EVs के अलगाव के लिए आगे बढ़ें ।

2. ईवीएस का अलगाव

वातानुकूलित माध्यम से ईवीएस का पूर्व-अलगाव
1. वातानुकूलित संस्कृति माध्यम को माइक्रोग्लिया या मैक्रोफेज संस्कृतियों (चरण 1.1.2 या 1.2.2) से शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
2. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 न्यूनतम के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
3. अधिष्ठाता को एक नई शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें। अपोप्टोटिक निकायों को खत्म करने के लिए आरटी में 20 मिन के लिए 1,200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
4. सुपरनेटेंट को 10.4 एमएल पॉलीकार्बोनेट ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब को 70.1 टीआई रोटर में स्थानांतरित करें। ईवीएस को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिन के लिए 100,000 x ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज।
5. सुपरनेट को त्यागें और 0.20 माइक्रोन फ़िल्टर फॉस्फेट बफर लवइन (पीबीएस) के 200 माइक्रोन में ईवीएस युक्त गोली को फिर से निलंबित करें।
ईवीएस का अलगाव
1. घर में बने आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी कॉलम (एसईसी) की तैयारी
  1. एक ग्लास क्रोमेटोग्राफी कॉलम खाली करें (लंबाई: 26 सेमी; व्यास: 0.6 सेमी) (सामग्री की तालिकादेखें), इसे धोएं और स्टरलाइज करें।
  2. कॉलम के नीचे 60 माइक्रोन फिल्टर रखें।
  3. 0.6 सेमी व्यास और 20 सेमी ऊंचाई का स्थिर चरण बनाने के लिए क्रॉस-लिंक्ड एग्गारोज जेल फिल्ट्रेशन बेस मैट्रिक्स के साथ कॉलम को ढेर करें।
  4. 0.20 माइक्रोन फ़िल्टर पीबीएस के 50 मीटर के साथ चरण कुल्ला। जरूरत पड़ने पर बाद में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. एसईसी कॉलम के स्थिर चरण के शीर्ष पर पुनर्निलंबित ईवी गोली रखें।
3. कॉलम के सूखने से रोकने के लिए स्थिर चरण के शीर्ष पर 0.20 माइक्रोन फ़िल्टर किए गए पीबीएस को जोड़ते हुए 250 माइक्रोन के 20 अनुक्रमिक अंशों को एकत्र करें। यदि आवश्यक हो तो अंशों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  नोट: आणविक विश्लेषण के लिए ईवी अखंडता को बनाए रखने के लिए एक सप्ताह से अधिक लंबा भंडारण -80 डिग्री सेल्सियस पर किया जा सकता है।
मैट्रिक्स ने एसईसी अंशों के लेजर डिकोरेटन आयनीकरण (मालडीआई) द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की सहायता की
1. धारा 2.2 में वर्णित ईवी अलगाव के लिए आगे बढ़ें।
2. पेप्टाइड अंशांकन मिश्रण समाधान के 200 माइक्रोन के साथ ईवी पैलेट को फिर से निलंबित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
3. 2.2.1 से 2.2.3 अनुभागों में वर्णित ईवी संग्रह पर आगे बढ़ें।
4. वैक्यूम एकाग्रता के साथ अंश को पूरी तरह से सुखा लें।
5. 0.1% ट्राइफ्लोरोएस्टिक एसिड (टीएफए) के 10 माइक्रोन के साथ अंशों का पुनर्गठन करें।
6. माल्डी पॉलिश स्टील टारगेट प्लेट पर α-cyano-4-हाइड्रोक्सिकसिनिनामिक एसिड (एचसीसीए) मैट्रिक्स के 1 μL के साथ पुनर्गठित अंश के 1 μL मिलाएं।
7. एक मालदी मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ सभी अंशों का विश्लेषण करें।
8. समर्पित सॉफ्टवेयर के साथ उत्पन्न स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिकादेखें)।

3. ईवीएस का लक्षण वर्णन

नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)
नोट: एनटीए विश्लेषण नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) और एक स्वचालित सिरिंज पंप के साथ किया जाता है।
1. 0.20 माइक्रोन फ़िल्टर पीबीएस के साथ चरण 2.2.3 से प्रत्येक सेकंड अंश की एक कमजोर पड़ने (1:50 से 1:500 की सीमा) बनाएं।
2. भंवर ईवी समुचेगेट को खत्म करने के लिए समाधान।
3. पतला घोल को 1 मिलीस सिरिंज में डालकर ऑटोमेटेड सिरिंज पंप में रखें।
4. स्क्रीन गेन लेवल (3) और कैमरा लेवल (13) के लिए कैमरा सेटिंग को एडजस्ट करें।
5. रन पर क्लिक करें और निम्नलिखित स्क्रिप्ट लॉन्च करें।
  1. नमूना विश्लेषण कक्ष में लोड करें (जलसेक दर: 15 एस के लिए 1,000)।
  2. वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए गति प्रवाह को कम और स्थिर करें (जलसेक दर: 15 एस के लिए 25)। कण प्रवाह के लगातार तीन 60 एस वीडियो कैप्चर करें।
  3. वीडियो विश्लेषण से पहले कैमरा स्तर (13) और डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड (3) को समायोजित करें। सेटिंग्स पर क्लिक करें । विश्लेषण शुरू करने के लिए ठीक है और जब विश्लेषण किया जाता है निर्यात पर क्लिक करें ।
6. प्रत्येक अंश विश्लेषण के बीच, 0.20 माइक्रोन फ़िल्टर पीबीएस के 1 mL के साथ धोएं।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) विश्लेषण
1. धारा 2 में वर्णित ईवीएस को अलग करें।
  नोट: बाँझ स्थितियों की आवश्यकता नहीं है।
2. ईवीएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए धारा 3.1 दोहराएं।
  नोट: ईएम विश्लेषण के लिए केवल सकारात्मक अंशों का उपयोग किया जाएगा।
3. EV-युक्त एसईसी अंशों को केंद्रित करने के लिए 50 केडीए अपकेंद्रित्र फिल्टर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
4. 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 30 माइक्रोन में केंद्रित ईवीएस को फिर से निलंबित करें।
5. कार्बन-लेपित कॉपर ग्रिड पर नमूने के 10 माइक्रोन लोड करें।
6. गीले वातावरण में 20 मिन के लिए इनक्यूबेट।
7. ग्रिड पर नमूने के अच्छे अवशोषण के लिए चरण 3.2.5 और 3.2.6 दोहराएं।
8. आरटी में 5 मिन के लिए पीबीएस में 1% ग्लूटाराल्डिहाइड की एक बूंद में ग्रिड स्थानांतरित करें।
9. कई बार अल्ट्राप्योर पानी से सैंपल धोएं।
10. 4% मूत्र एसीटेट और 2% मिथाइलसेल्यूलोज (1:9, v/v) के मिश्रण के साथ बर्फ पर 10 मिन के लिए नमूना इसके विपरीत । फिल्टर पेपर का उपयोग करके मिश्रण की अतिरिक्त राशि निकालें।
11. नमूना सूखी और यह 200 केवी पर एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण (सामग्री की मेजदेखें) ।
पश्चिमी दाग विश्लेषण
1. प्रोटीन निकालने
  1. ईवीएस को अलग करने और केंद्रित करने के लिए चरण 3.2.1 से 3.2.3 तक दोहराएं।
  2. रिपा बफर के 50 माइक्रोन (150 एमएम सोडियम क्लोराइड [नासीएल], 50 एमएम ट्रिस, 5 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (2-अमीनोएथालेथर) - एन,एन,एन', एन टेट्रासेटिक एसिड [ईटीए], 2 एम एम एथिलीनडियामाइन-टेट्रासेटिक एसिड [ईटीए], 100 मीटर सोडियम फ्लोराइड [एनएफ], 10 एमएम सोडियम पायरोफॉस्फेट, 1% नोनिडेट पी-40, 1 एमएम फिनिलमेथेनसल्फोनाइल फ्लोराइड [पीएमएसएफ], 1x प्रोटीज अवरोधक) के साथ ईवी नमूना (फिल्टर पर ईवी एकाग्रता के परिणामस्वरूप 25 माइक्रोन) प्रोटीन निकालने के लिए बर्फ पर 5 मिन के लिए।
  3. 5 एस के लिए सोनीकेट (आयाम: 500 डब्ल्यू; आवृत्ति: 20 kHz), बर्फ पर 3 बार।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 20,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा वैसिकुलर मलबे को हटा दें।
  5. अधिनेता को इकट्ठा करें और ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख विधि के साथ प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
2. सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) और वेस्टर्न ब्लॉटिंग
  1. 5सी लैमली सैंपल बफर (v/v) के साथ प्रोटीन अर्क (30 μg) मिलाएं ।
  2. प्रोटीन मिश्रण को 12% पॉलीएक्रिलैमाइड जेल पर लोड करें।
  3. 15 मिन के लिए 70 वी और 45 मिन के लिए 120 वी पर टीजीएस बफर (25 एमएम ट्रिस पीएच 8.5, 192 एमएम ग्लाइसिन और 0.1% एसडी) के साथ जेल में प्रोटीन माइग्रेट करें।
  4. प्रोटीन को 30 मिन के लिए 230 वी पर अर्ध-शुष्क प्रणाली के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
  5. बफर को अवरुद्ध करने के साथ आरटी में 1 घंटे के लिए झिल्ली संतृप्त (०.०५% ट्वीन 20 w/v, 5% मिल्क पाउडर w/v में ०.१ एम पीबीएस, पीएच ७.४) ।
  6. माउस मोनोक्लोनल एंटी-ह्यूमन हीट-शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी90) एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली को इनक्यूबेट करें बफर (1:100) को अवरुद्ध करने में पतला।
  7. 15 मिन के लिए पीबीएस-ट्वीन (पीबीएस, 0.05% ट्वीन 20 w/v) के साथ तीन बार झिल्ली को धोएं।
  8. बकरी सहिजन peroxidase के साथ आरटी में 1 घंटे के लिए झिल्ली इनक्यूबेट-conjugated विरोधी माउस IgG माध्यमिक एंटीबॉडी बफर (1:10,000) अवरुद्ध में पतला ।
    नोट: अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण किया जाता है।
  9. वाशिंग स्टेप (चरण 3.3.2.7) दोहराएं।
  10. बढ़ी हुई केमिमिनेंस (ईसीएल) पश्चिमी ब्लॉटिंग सब्सट्रेट किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ झिल्ली प्रकट करें।
प्रोटेओमिक विश्लेषण
1. प्रोटीन निष्कर्षण और इन-जेल पाचन
  1. ईवीएस को अलग करने और केंद्रित करने के लिए चरण 3.2.1 से 3.2.3 तक दोहराएं। EV प्रोटीन निष्कर्षण के लिए चरण 3.3.1 दोहराएं।
  2. 12% पॉलीएक्रिलैमाइड जेल के स्टैकिंग जेल में प्रोटीन माइग्रेशन करें।
  3. आर टी में 20 मिन के लिए कूमस्सी नीले रंग के साथ जेल में प्रोटीन को ठीक करें।
  4. प्रत्येक रंगीन जेल टुकड़े को उत्पादित करें और इसे 1 मिमी³के छोटे टुकड़ों में काट लें।
  5. जेल के टुकड़ों को प्रत्येक समाधान के 300 माइक्रोन के साथ क्रमिक रूप से धोएं: 15 मिन के लिए अल्ट्राप्ली पानी, 15 मिन के लिए 100% एसीटोनिट्रिल (एसीएन), 15 मिन के लिए 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एनएच₄एचसीओ_3),15 मिन के लिए 100 एमएम एनएच₄एचसीओ₃ (1:1, वी/वी) 15 मिन के लिए, और 100% एसीएन लगातार सरगर्मी के साथ 5 मिन के लिए।
  6. वैक्यूम एकाग्रता के साथ पूरी तरह से जेल के टुकड़े सूखी।
  7. 100 मीटर एनएच₄एचसीओ₃ के 100 माइक्रोन के साथ प्रोटीन में कमी करें जिसमें 1 0 मीटर डिथिओथ्रेइटॉल 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हो।
  8. आरटी में अंधेरे में 45 मिन के लिए 50 मीटर आईओडोसेटामाइड युक्त 100 मीटर एनएच₄एचसीओ₃ के 100 माइक्रोन के साथ प्रोटीन एल्किलेशन करें।
  9. प्रत्येक समाधान के 300 माइक्रोन के साथ जेल के टुकड़ों को क्रमिक रूप से धोएं: 15 मिन के लिए एनएच₄एचसीओ₃ का 100 एमएम, एसीएएन: 20 एमएम एनएच₄एचसीओ₃ (1:1, वी/वी) 15 मिन के लिए, और 100% एसीएन 5 मिन के लिए निरंतर सरगर्मी के साथ।
  10. वैक्यूम एकाग्रता के साथ जेल के टुकड़ों को पूरी तरह से सुखा लें।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात 20 एमएम एनएच₄एचसीओ₃ में 50 माइक्रोन (12.5 माइक्रोन/एमएल) के साथ प्रोटीन पाचन करें।
  12. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 किमी के लिए 100% ACN के 50 μL के साथ जेल से पचा प्रोटीन निकालें और फिर लगातार सरगर्मी के साथ आरटी पर 15 किमी।
  13. निम्नलिखित निष्कर्षण प्रक्रियाओं को दो बार दोहराएं: निरंतर सरगर्मी के साथ 20 मीटर के लिए 20 मीटर एनएच₄एचसीओ₃ समाधान में 5% टीएफए का 50 माइक्रोन।
  14. लगातार सरगर्मी के साथ 10 00 00 00 के लिए 100% ACN के 100 μL जोड़ें।
  15. वैक्यूम कंसंट्रेटर के साथ ड्राई डाइजेस्ट प्रोटीन और 0.1% टीएफए के 20 माइक्रोन में फिर से सस्पेंड।
  16. डिसाल्टिंग और ध्यान केंद्रित पेप्टाइड्स के लिए C18 रिवर्स चरण मीडिया के साथ 10 μL पिपेट टिप का उपयोग कर नमूना desalt (सामग्री की मेजदेखें) और ACN के साथ elute पेप्टाइड्स: 0.1% formic एसिड (एफए) (80:20, v/v) ।
  17. एक वैक्यूम एकाग्रता के साथ नमूना पूरी तरह से सूखी और ACN के 20 μL में फिर से निलंबित: 0.1% एफए (2:98, v/v) तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडेमरी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के लिए ।
2. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण
  1. पचाए गए पेप्टाइड को एलसी-एमएस/एमएस इंस्ट्रूमेंट में लोड करें और कहीं और^{विस्तार}से वर्णित मापदंडों के अनुसार नमूना और डेटा विश्लेषण करें ।
3. रॉ डेटा विश्लेषण
  1. प्रोटीन की पहचान करने और मानक मापदंडों का उपयोग करके मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ प्रत्येक नमूने के चिन्हित प्रोटीन की तुलना करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा की प्रक्रिया करें।
  2. निर्यात, मानक मापदंडों का उपयोग कर, प्रोटीन नेटवर्क और जैविक प्रक्रियाओं की भविष्यवाणी करने वाले सॉफ्टवेयर में ईवी सकारात्मक नमूनों से अनन्य और अधिक प्रतिनिधित्व वाले प्रोटीन की सूची।
  3. अंशों में पहचाने गए प्रोटीन की सूची की तुलना एक्सोकार्टा ओपन एक्सेस डेटाबेस से शीर्ष 100 ईवी मार्कर के साथ करें (सामग्री की तालिकादेखें)।

4. कार्यात्मक ईवीएस प्रभाव परख

पीसी-12 सेल लाइन पर न्यूराइट आउटग्रोथ परख
1. संस्कृति PC12 सेल लाइन पूर्ण DMEM माध्यम में (2 mM एल ग्लूटामाइन, 10% भ्रूण घोड़ा सीरम (FHS), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० UI/mL पेनिसिलिन, १०० μg/mL streptomycin) ।
  नोट: सेरा पूरी प्रक्रिया में एक्सोसोम मुक्त हैं।
2. एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक कवर ग्लास (सभी कुओं) जोड़ें; थाली-डी-लिसिन (0.1 मिलीग्राम/mL) और बीज 260,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से कोट करें।
3. कोशिकाओं को 5% सीओ₂के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।
4. 24 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, 1 x 10⁶ माइक्रोग्लिया ईवीएस (स्टेप 1.1.2 से) के साथ 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 0.1% एफएचएस, 100 यूआई/एमएल पेनिसिलिन, 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम को डीएमईएम विभेदन माध्यम (डीएमईएम में बदलें) ।
  नोट: नियंत्रण स्थिति भेदभाव माध्यम में माइक्रोग्लिया ईवीएस के बिना किया जाता है।
5. सीडिंग के बाद दिन 4 पर, सभी कुओं को पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ लोड करें।
6. सीडिंग के बाद 7 दिन में, आरटी में 20 मिन के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और पीबीएस के साथ तीन बार (10 गुना प्रत्येक) कुल्ला करें।
7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए रोडामिन-कंजुगेड फालोलाइड िन के साथ कोशिकाओं को दाग दें और पीबीएस के साथ 3 गुना (10 मिन प्रत्येक) कुल्ला करें।
8. टी में 30 मिन के लिए पतला Hoechst 33342 (1:10,000) के साथ कोशिकाओं दाग और PBS के साथ 3 बार (10 मिन प्रत्येक) कुल्ला ।
9. फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम के साथ एक स्लाइड पर कवर ग्लास माउंट (सामग्री की तालिकादेखें) ।
10. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड का विश्लेषण करें, प्रत्येक स्लाइड की 5 यादृच्छिक छवियां लें।
11. एक स्वचालित क्वांटिफिकेशन सॉफ्टवेयर (कुल न्यूराइट लंबाई) का उपयोग करके न्यूराइट आउटग्रोथ को मापें, जैसा^किकहीं और विस्तार से वर्णित है।
चूहा प्राथमिक न्यूरॉन्स पर न्यूराइट आउटग्रोथ
1. पॉली-डी-लाइसिन (0.1 मिलीग्राम/mL) और लेमिनिन (20 μg/mL) के साथ एक 8-अच्छी तरह से ग्लास स्लाइड कोट करें।
2. उपयुक्त संस्कृति माध्यम में संस्कृति चूहा वाणिज्यिक प्राथमिक न्यूरॉन्स (सामग्री की तालिकादेखें) प्रति अच्छी तरह से 50,000 कोशिकाओं को चढ़ाना और 48 घंटे के लिए 5% सीओ₂ के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करके।
  नोट: सेरा पूरी प्रक्रिया में एक्सोसोम-मुक्त हैं।
3. न्यूरॉन कल्चर मीडियम में 1 x 10⁶ माइक्रोग्लिया ईवीएस जोड़ें और 48 घंटे अधिक के लिए 5% सीओ₂ के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  नोट: न्यूरॉन कल्चर मीडियम में माइक्रोग्लिया ईवीएस के बिना कंट्रोल कंडीशन किया जाता है।
4. कोशिकाओं को ठीक करने और दाग ने के लिए चरण 4.1.6 से 4.1.9 का पालन करें।
5. स्लाइड का विश्लेषण करने के लिए चरण4.1.10 और 4.1.11 का पालन करें।
ग्लियोमा सेल आक्रमण
1. पूर्ण DMEM माध्यम में C6 चूहा ग्लियोमा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (10% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1x एंटीबायोटिक्स के साथ डीएमईएम) जिसमें 20 माइक्रोन में 8,000 कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता पर 5% कोलेजन होते हैं।
  नोट: सेरा पूरी प्रक्रिया में एक्सोसोम-मुक्त हैं।
2. 60 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान के नीचे पीबीएस के 5 मिलील रखें। ढक्कन के नीचे पर सेल निलंबन के 20 μL (8,000 कोशिकाओं) के ढक्कन और जमा बूंदों उलटा।
3. पीबीएस से भरे नीचे कक्ष पर ढक्कन उलटा और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट इनक्यूबेट और 72 घंटे के लिए 5% सीओ₂ जब तक सेल स्फेरॉइड बनते हैं।
4. 1 x 10⁸ मैक्रोफेज ईवीएस (चरण 1.2.2 से) में 2.2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन मिश्रण (2 मिलीग्राम का गोजातीय कोलेजन प्रकार का I solution [3 मिलीग्राम/mL] 10x न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) और 0.1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड के 500 माइक्रोन) के साथ जोड़ें।
  नोट: नियंत्रण स्थिति कोलेजन मिश्रण में मैक्रोफेज ईवीएस के बिना किया जाता है।
5. सेल स्फेरॉइड एम्बेड करने के लिए 24-अच्छी प्लेट में ईवीएस युक्त कोलेजन मिश्रण वितरित करें।
6. प्रत्येक कुएं के केंद्र में नवगठित सेल स्फेरॉइड को प्रत्यारोपित करें।
7. जेल को जमना करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂ पर 30 मिन के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
8. इसके बाद, प्रत्येक कुएं में कोलेजन मैट्रिक्स पर पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 400 माइक्रोन को ओवरले करें।
9. कुल 6 दिनों के लिए पूरा सिस्टम 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂पर इनक्यूबेट करें ।
  नोट: स्फेरॉइड से बाहर सेल आक्रमण एक 4x/0.10 एनए उद्देश्य का उपयोग कर एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर डिजिटल फोटोग्राफी द्वारा निगरानी की है ।
10. हर दिन प्रत्येक कुएं की छवियां प्राप्त करें।
11. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कोशिका स्फेरॉइड क्षेत्रों की छवियों और मात्रा को संसाधित करें जैसा कि पहले विस्तार^{से वर्णित है 42।}
  नोट: आक्रमण और गोलाकार क्षेत्रों को प्रत्येक दिन के लिए आक्रमण और गोलाकार क्षेत्रों को 0 दिन मापा गया था।

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Representative Results

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) के लिए जैविक प्रभावों को जिम्मेदार ठहराने के लिए मुख्य चुनौतियों में से एक पूरी संस्कृति माध्यम से ईवीएस को अलग करने की क्षमता है। इस रिपोर्ट में, हम अल्ट्रासेंट्रियूगन (यूसी) और आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग करके एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो ईवी मार्कर को मान्य करने और बायोएक्टिव यौगिकों की पहचान करने के लिए प्रोटीन हस्ताक्षरों के बड़े पैमाने पर विश्लेषण के साथ मिलकर होता है। मैक्रोफेज या माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस क्रमशः 24 घंटे या 48 एच संस्कृति(चित्रा 1)के बाद वातानुकूलित माध्यम से अलग-थलग कर दिया गया था।

चित्रा 1: एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल (ईवी) संग्रह और अलगाव रणनीतियां। अपोप्टिक निकायों और सेल मलबे को लगातार केंद्रीकरण चरणों द्वारा माइक्रोग्लिया-या मैक्रोफेज-वातानुकूलित माध्यम से अलग किया गया था। अधिनेता से, ईवीएस अल्ट्रासेंटरिफुगेशन (यूसी) द्वारा अलग-थलग थे। ईवीएस युक्त यूसी पेलेट को कॉलम पर लोड किया गया था और 20 अलग-अलग ल्यूट अंशों में आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) से अलग किया गया था। जैसा कि आगे के चरणों (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण और प्रोटेओमिक विश्लेषण) में पता चला है, एसईसी अंशों को 1F-EV-, 2F-EV + और 3F-EV-में एकत्र और व्यवस्थित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विधि लगातार केंद्रीकरण कदम का पालन किया: कोशिकाओं को हटाने के लिए पहला और दूसरा सेलुलर मलबे और अपोप्टिक निकायों को हटाने के लिए । फिर, सुपरनेटेंट को 90 मिन के लिए 100,000 x ग्राम पर अल्ट्रासेंटरिगुगेशन करने के लिए एक नई ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया था। वेसिकल्स को अंतिम यूसी पैलेट में प्रोटीन एग्रीगेट के साथ एकत्र किया गया था। एक एसईसी कॉलम का उपयोग यौगिकों को उनके आकार के अनुसार अलग करने और एकत्रित(चित्रा 1)को हटाने के लिए किया गया था। ईवीएस के अलगाव की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक एसईसी अंश ने नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण(चित्रा 2A)का पालन किया।

चित्रा 2: एसईसी अंशों का विश्लेषण। (A)एसईसी अंशों का नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) । प्रत्येक एसईसी अंश में कणों की कुल संख्या बार चार्ट के साथ प्रस्तुत की जाती है। ऑरेंज बार चार्ट लगातार तीन EV + अंश (F5-F7) दिखाते हैं। (B, C) एनटीए चैंबर की स्क्रीन कैप्चर एसईसी अंशों के बीच कण प्रवाह में महत्वपूर्ण अंतर दिखाती है। (D)पूरक मालदी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। ईवीएस युक्त एक अन्य यूसी पैलेट से, एसईसी रणनीति के प्रदर्शन को मान्य करने के लिए एसईसी अलगाव से पहले एक मानक नियंत्रण पेप्टाइड सेट जोड़ा गया था। मानक-सकारात्मक अंशों का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक एसईसी अंश का विश्लेषण मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर डिगोरेटन आयनीकरण - उड़ान का समय (मालदी-टीओएफ) के साथ किया गया था। नौ पहले स्पेक्ट्रा (अंश 1 से 9) में, कोई संकेत नहीं देखा गया था। इन मुक्त मानकों का पता लगाना निम्नलिखित अंशों (अंश 10 से 20) में संभव था जो घुलनशील घटकों (F10-F20) से ईवीएस (F5-F7) को अलग करने के लिए एसईसी प्रक्रिया की क्षमता की पुष्टि करता है। (ई)एक EV मार्कर प्रारंभिक विश्लेषण के रूप में एसईसी अंशों का पश्चिमी दाग विश्लेषण। EV + अंश (F5-F7) को एक नमूने (2F-VE+) के रूप में पूल किया गया था जबकि ईवी-अंश (क्रमशः F1-F4 और F8-F20) को 1F-EV- और 3F-EV-नामक दो अन्य नमूनों में पूल किया गया था। परिणामों ने 2F-EV + में हीट-शॉक प्रोटीन 90 (HSP90) (EV पॉजिटिव मार्कर) सिग्नल की उपस्थिति दिखाई, और अन्य अंशों (1F-EV- और 3F-EV-) की तुलना में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेल लाइसेट में भी। (एफ, जी) ईवी पॉजिटिव सैंपल (2F-EV+) का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। लगातार दो आवर्धन के तहत अवलोकन से 100 एनएम (सफेद तीर) और लगभग 400 एनएम (तीरसिर) के आसपास आकार सीमा में ईवीएस की उपस्थिति का पता चला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कण संख्या पिछले (F1-F4) और निम्नलिखित लोगों (F8-F20) की तुलना में 5, 6 और 7 अंशों में काफी अधिक थी। इन अंशों में एक कण प्रवाह देखना संभव था, भले ही निम्नलिखित अंशों(चित्रा 2बी, सी)में कुछ कण देखे गए हों। यह अलगाव इस संभावना को नहीं रोकता है कि F5-F7 के अलावा अन्य अंशों में थोड़ी मात्रा में वेसिकल्स हो सकते हैं, या यहां तक कि ईवी-समृद्ध अंश F5 से F7 में आणविक संदूषक हो सकते हैं। कम से कम यह सुनिश्चित करने के लिए कि F5-F7 अंश सह-eluting अणुओं को दूषित करने से मुक्त हैं, एसईसी प्रक्रिया में विभिन्न यौगिकों के समय-पाठ्यक्रम एल्यूशन का पालन करना आवश्यक था। ऐसा करने के लिए, पेप्टाइड मानकों को नियंत्रित करने के लिए एक समान यूसी गोली के रूप में पहले इस्तेमाल किया गया । इस तैयारी को एसईसी प्रक्रिया का उपयोग करके फिर से अलग कर दिया गया था। फिर, एक मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर अवशोषण आयनीकरण - उड़ान का समय (MALDI) बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण एसईसी अंशों की पहचान करने के लिए किया गया था जिसमें मानकों को कम किया गया था(चित्रा 2D)। मास रेंज के कारण, इस विश्लेषण में पेप्टाइड मानकों से केवल आयनीकृत उत्पादों का पालन किया गया था। परिणामों से पता चला है कि इन उत्पादों के अंशों में पता लगाने योग्य थे 10 से 20, प्रदर्शन है कि किसी भी घुलनशील प्रोटीन EVs (F5-F7) के रूप में एक ही अंशों में नहीं पहुंचाया जा सकता है । इन परिणामों ने गैर-ईवी घटकों से ईवीएस के पृथक्करण में इस दृष्टिकोण के हित की पुष्टि की। यहां तक कि यह मानते हुए कि F8-F20 अंशों में ईवीएस का अवशिष्ट अंश हो सकता है, हमने निम्नलिखित प्रयोगों में ईवी सकारात्मक अंशों (F5-F7) को 2F-EV + नामक एक नमूने में गठबंधन करने का फैसला किया। हमने अन्य एसईसी अंशों को 1F-EV- (F1-F4) और 3F-EV- (F8-F20) नामक दो नमूनों में भी जोड़ा। हम कई कारणों के लिए तीन नमूनों में समूहीकृत । सबसे पहले, एसईसी अंशों की संख्या आणविक विश्लेषण के समय में वृद्धि होगी, लेकिन यह भी विट्रो अध्ययन में कार्यात्मक । EV-पॉजिटिव एसईसी अंश अलग से कम कण संख्या प्रदर्शित करते हैं और आणविक यौगिकों का पता लगाने से भी समझौता करते हैं। इसी तरह, यदि आवश्यक हो तो ध्यान केंद्रित करने के लिए अंश F8-F20 को समूहित करने के लिए अधिक विवेकपूर्ण माना जाता था, अवशिष्ट वेसिकल्स और एचएसएसपी90 के खिलाफ प्रारंभिक पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा उनकी उपस्थिति की जांच करें, एक ईवी मार्कर। दिलचस्प बात यह है कि अंश 2F-EV + में HSP90 के लिए एक सकारात्मक संकेत का पता चला, जो सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेल में भी था, लेकिन 1F-EV-और 3F-EV-नमूनों में नहीं(चित्रा 2E और अनुपूरक चित्रा S1 नियंत्रण के रूप में)। यह विश्लेषण केवल 2F-EV + के हित और पिछले एसईसी अंशों के सही प्रबंधन की पुष्टि करता है। EV अलगाव वाणी करने के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक अतिरिक्त प्रयोग केवल 2F-EV + नमूना का विश्लेषण किया और १०० और ४०० एनएम(चित्रा 2एफ, जी)के बीच एक ठेठ आकृति विज्ञान और आकार विषमता के साथ EVs के अवलोकन की अनुमति दी ।

सत्यापन में एक और महत्वपूर्ण कदम प्रोटेओमिक विश्लेषण(चित्रा 3)था। हमने कई उद्देश्यों के साथ एक संपूर्ण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण विकसित किया: (i) 2F-EV+में ईवी मार्कर की उच्च संख्या का पता लगाने के साथ ईवीएस के अलगाव की पुष्टि करता है, (ii) अंततः ईवी नकारात्मक नमूनों (1F-EV- और 3F-EV-) में संदूषक प्रोटीन की पहचान करता है और (iii) उनकी जैविक गतिविधियों का समर्थन करने वाले ईवीएस की प्रोटीन सामग्री की विशेषता है।

चित्रा 3: EV-पॉजिटिव और EV-नकारात्मक नमूनों का प्रोटेओमिक विश्लेषण। (क)इसी तरह के माइक्रोग्लिया सेल की तैयारी से तीन स्वतंत्र ईवी अलगाव के बाद, नमूने 1F-EV-, 2F-EV + और 3F-EV-सोडियम dodecyl सल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (SDS-PAGE) के लिए लोड किए गए थे और उनके इन-जेल पाचन को महसूस करने के लिए प्रोटीन को केंद्रित करने के लिए स्टैकिंग जेल तक चले गए थे । इसके बाद इसी प्रोटीन की पहचान करने के लिए लिक्विड क्रोमेटोग्राफी टैंडेमिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) द्वारा परिणामी पेप्टाइड्स का विश्लेषण किया गया । (ख)नमूनों के बीच पहचाने गए प्रोटीन की तुलना 1F-EV-और 2F-EV + दोनों अंशों (19) और प्रोटीन विशेष रूप से 2F-EV + अंश (५२२) में पता चला में आम प्रोटीन दिखा । हीटमैप सापेक्ष प्रतिनिधित्व दिखाता है जहां 1F-EV- और 2F-EV + ट्रिपलिकेट्स के बीच सभी सामान्य प्रोटीन 2एफ-ईवी + नमूनों में अधिक प्रतिनिधित्व (लाल) थे। (C)अंश2एफ-ईवी + और 3एफ-ईवी के बीच पहचाने गए प्रोटीन की तुलना- ट्रिपलिकेट्स (113) के बीच आम प्रोटीन दिखाता है और विशेष रूप से प्रोटीन (2एफ-ईवी + में 428 और 3एफ-ईवी-में 11) का प्रतिनिधित्व करता है। हीटमैप दो समूहों में सापेक्ष प्रतिनिधित्व दिखाता है। एक (क्लस्टर ए) 3F-EV-नमूना में 5 से अधिक प्रतिनिधित्व प्रोटीन प्रस्तुत करता है और एक दूसरा (क्लस्टर बी) 2F-EV + में १०८ से अधिक प्रतिनिधित्व प्रोटीन प्रस्तुत करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सेल-वातानुकूलित मीडिया से, यूसी और एसईसी प्रक्रिया ने तीन नमूने 1F-EV-, 2F-EV+ और 3F-EV-का नेतृत्व किया। इसी प्रोटीन को सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा निकाला और केंद्रित किया गया था। स्टैकिंग जेल में एक छोटे प्रवास के बाद, नमूनों को एक बैंड एक्सीशन द्वारा एकत्र किया गया था, जो अलग ट्यूबों में स्थानांतरित होकर जेल में पचा गया था। उत्पादों को ऑनलाइन रिवर्स-फेज क्रोमेटोग्राफी द्वारा सीधे विश्लेषण(चित्रा 3ए)के लिए एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अलग किया गया था।

निम्नलिखित परिणाम, पूरी प्रक्रिया के एक उदाहरण के रूप में, 48 घंटे की संस्कृति के बाद माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित माध्यम से प्राप्त किए गए थे। कच्चे डेटा एक चूहा प्रोटीन डेटाबेस के लिए प्रस्तुत किया गया । पहचाने गए प्रोटीन की तुलना नमूनों 1F-EV-और 2F-EV +(चित्रा 3B)और नमूनों 2F-EV + और 3F-EV-(चित्रा3C)के बीच की गई । पहली तुलना में, वेन आरेख दोनों अंशों में 19 आम प्रोटीन दिखाया और ५२२ प्रोटीन विशेष रूप से 2F-EV + अंश में पता चला । मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण ने आम प्रोटीन के सापेक्ष प्रतिनिधित्व की पहचान की अनुमति दी। परिणामों ने एक हीटमैप दिखाया जहां 1F-EV-और 2F-EV + ट्रिपलिकेट्स के बीच सभी सामान्य प्रोटीन 2F-EV + नमूनों में अधिक प्रतिनिधित्व (लाल) थे । अंश 2F-EV + और 3F-EV-के बीच दूसरी तुलना में, ट्रिपलिकेट्स के बीच ११३ आम प्रोटीन की पहचान की गई । इसके अलावा, 2F-EV + में विशेष रूप से 428 प्रोटीन पाए गए और 3एफ-ईवी-में विशेष रूप से 11 प्रोटीन पाए गए। मात्रात्मक विश्लेषण के बाद, ११३ आम प्रोटीन के हीटमैप प्रतिनिधित्व ने दो समूहों पर प्रकाश डाला जहां क्लस्टर ए ने 3F-EV-नमूना में पांच से अधिक प्रतिनिधित्व वाले प्रोटीन प्रस्तुत किए और क्लस्टर बी ने 2F-EV + में १०८ से अधिक प्रतिनिधित्व वाले प्रोटीन प्रस्तुत किए ।

428 प्रोटीन विशेष रूप से प्रतिनिधित्व किया और 108 प्रोटीन 2F-EV + में अधिक प्रतिनिधित्व करने के लिए Exocarta ओपन एक्सेस डाटाबेस के लिए प्रस्तुत किया गया ताकि EV से जुड़े अणुओं का पता लगाने के लिए। एक्सोकार्टा में शीर्ष 100 ईवी मार्कर के विश्लेषण में 2F-EV +(चित्रा 4A)में 86 ईवी से जुड़े प्रोटीन की उपस्थिति पर प्रकाश डाला गया।

चित्रा 4: 2F-EV + नमूने से प्रोटीन का विश्लेषण। (A)ईवी से जुड़े अणुओं का पता लगाने के लिए एक्सोकार्टा डाटाबेस में ५३६ प्रोटीन (४२८ अनन्य और १०८ से अधिक प्रतिनिधित्व वाले प्रोटीन) का एक पूल प्रस्तुत किया गया था । एक्सोकार्टा डेटाबेस से शीर्ष 100 ईवी मार्कर में पाए गए 86 ईवी-संबद्ध प्रोटीन के अणु प्रतीक। (ख)प्रोटीन इंटरैक्शन की भविष्यवाणी और चयनित जैविक प्रक्रियाओं के लिए उनके सहयोग ने 2F-EV + नमूने में प्रतिरक्षा और न्यूरोप्रोटेक्टिव रास्ते दिखाए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दिलचस्प बात यह है कि क्लस्टर ए में 5 सामान्य प्रोटीन और विशेष रूप से 3F-EV में प्रतिनिधित्व किए गए 11 प्रोटीन का विश्लेषण किसी ईवी मार्कर (डेटा नहीं दिखाया गया) से जुड़ा हुआ था। अंत में, प्रोटीन इंटरैक्शन की भविष्यवाणी और चयनित जैविक प्रक्रियाओं के साथ उनके सहयोग ने प्रतिरक्षा मध्यस्थों (21%) कभी-कभी भड़काऊ प्रतिक्रिया (4.1%) के नियंत्रण में शामिल (चित्र4B)। 2F-EV + में EV सामग्री भी न्यूरोनल विकास (16.8%), न्यूरॉन भेदभाव (5%) और न्यूरोनल मौत का नियंत्रण (3.8%) जो निम्नलिखित न्यूराइट आउटग्रोथ परख के अनुसार होता है।

इस प्रकार, हमने जिन रणनीति का चयन किया है, वह सभी डेटा की पहुंच को संभव बनाती है और जैविक परख ों से पहले ईवी-मध्यस्थता कार्यों की भविष्यवाणी की अनुमति देती है जो हमने तब प्रदर्शन किया था(चित्रा 5)।

चित्रा 5: EV-निर्भर एफ unctional asकहते हैं । माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभावों का मूल्यांकन न्यूराइट आउटग्रोथ (ऊपरी फ्रेम) पर किया गया था और मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभावों का मूल्यांकन ग्लियोमा सेल आक्रमण (निचले फ्रेम) पर किया गया था। (ए, बी) न्यूराइट की लंबाई पीसी-12 कोशिकाओं पर मापी गई थी (पैनल ए को अनुमति के साथ राजो-रोमेरो एट अल¹⁶ से संशोधित किया गया था) या चूहा प्राथमिक न्यूरॉन्स (बी)। परिणामों ने नियंत्रण (सीटीआरएल) की तुलना में ईवीएस (+ ईवीएस) के तहत महत्वपूर्ण वृद्धि देखी। स्केल बार = 20 माइक्रोन (सी, डी)सी 6 ग्लियोमा स्फेरॉइड आक्रमण का समय पाठ्यक्रम चूहा प्राथमिक मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस (C6 + EVs) या वाहन (C6 नियंत्रण) की उपस्थिति में कोलेजन में। कोलेजन में C6 स्फेरॉइड 3 डी आक्रमण पर नजर रखी गई और 6 दिनों तक की मात्रा निर्धारित की गई। ट्यूमर सेल आक्रमण की मात्रा 1, 2, 3 या 6 दिनों (सी) पर दिखाया गया है जैसा कि प्रतिनिधि छवियों (डी) पर मनाया जाता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। न्यूराइट आउटग्रोथ परख के लिए, इसमहत्व की गणना अपेयर छात्र की टी-टेस्ट(* पी एंड एलटी; ०.०५, ** पी एंड एलटी; ०.०१ और *** पी एंड एलटी; ०.००१) द्वारा की गई थी । आक्रमण परख के लिए, महत्व की गणना एक तरह से ANOVA द्वारा की गई थी जिसके बाद तुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण थे। त्रुटि सलाखों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों के सापेक्ष मानक त्रुटि का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस तरह पीसी-12 सेल लाइन और चूहा प्राइमरी न्यूरॉन्स पर माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस के न्यूरोट्रोफिक कार्यों का अध्ययन किया गया। परिणामों ने न्यूराइट आउटग्रोथ(चित्रा 5ए, बी)पर सकारात्मक प्रभाव दिखाया। ईवीएस की उपस्थिति क्रमशः लगभग 6 और 1.5 गुना न्यूराइट नेटवर्क को लंबाई में और/या पीसी-12 और प्राथमिक न्यूरॉन्स में नियंत्रण स्थिति की तुलना में संख्या में बढ़ी। एक अन्य संदर्भ में, हमने ब्रेन ट्यूमर आक्रमण(चित्रा 5सी, डी)पर मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभावों का भी अध्ययन किया। यह कोलेजन के मैट्रिक्स में एम्बेडेड 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। C6 चूहा ग्लियोमा कोशिकाओं के साथ उत्पन्न स्फेरॉइड को चूहे मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम से शुद्ध (या युक्त नहीं) ईवीएस युक्त कोलेजन मैट्रिक्स में 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। कोलेजन मैट्रिक्स एक संरचना प्रदान करता है जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं गोलाकार से आक्रमण और फैल सकती हैं। मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस ने ग्लियोमा स्फेरॉइड के विकास और आक्रमण को बिगड़ा दिया। 6 दिन की संस्कृति के बाद, नियंत्रण की तुलना में ईवी-इलाज स्फेरॉइड में आक्रमण की 50% कमी देखी गई। इस परिणाम से पता चला है कि मैक्रोफेज एंटी-ट्यूमरल और/या एंटी-इनवेसिव कारकों के साथ ईवी का उत्पादन कर सकते हैं जो ग्लियोमा विकास को प्रभावित करते हैं ।

Supplementary Figure S1
अनुपूरक चित्र S1: पश्चिमी-ब्लॉटिंग प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली झिल्ली की छवियां। (ए) चित्रा 2E (HSP90 EV मार्कर के खिलाफ) से पश्चिमी दाग की मूल छवि। (ख)उसी झिल्ली की पोंसाऊ धुंधला छवि जिसमें 1एफ-ईवी-, 2एफ-ईवी + और 3एफ-ईवी-नमूनों से प्रोटीन अर्क की सही लोडिंग दिखाई गई है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक जटिल ऊतक है जिसमें सेल-टू-सेल संचार होमोस्तासिस³⁰के लिए आवश्यक सामान्य न्यूरोनल कार्यों को नियंत्रित करता है। ईवीएस अब व्यापक रूप से अध्ययन कर रहे है और सेल के लिए सेल संचार³¹के लिए महत्वपूर्ण आणविक कार्गो के रूप में वर्णित है । वे विशेष रूप से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को मध्यस्थों का कॉकटेल प्रदान करते हैं जिससे उनके कार्य स्वस्थ और रोग स्थितियों^{में 32}प्रभावित होते हैं । हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि ईवीएस सीएनएस²⁴^,³³^,³⁴ और विशेष रूप से मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं³⁵^,³⁶में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . समर्थक और विरोधी भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बीच संतुलन महत्वपूर्ण है और सिनैप्टिक विकास और जीवन भर न्यूरोनल गतिविधियों के दौरान मस्तिष्क अखंडता को बनाए रखने की अनुमति देता है। इस अध्ययन में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की दो अलग-अलग स्थितियों पर चर्चा की गई: माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स के बीच संबंध (i) और (ii) मैक्रोफेज और ग्लियोमा कोशिकाओं में घुसपैठ के बीच। सबसे पहले, माइक्रोग्लिया मस्तिष्क के ऊतकों में निवासी मैक्रोफेज हैं जहां वे न्यूरोनल गतिविधियों को सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोएनवायरमेंट परिवर्तन के प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा भूमिका निभाते हैं। लेकिन अत्यधिक भड़काऊ तंत्र को अधिक सक्रिय माइक्रोग्लिया द्वारा समर्थित किया जा सकता है और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों को जन्म दिया जा सकता है³⁷^,³⁸। इसके विपरीत, उच्च ग्रेड ग्लियोमास को एंटी-भड़काऊ प्रोफाइल की आवश्यकता होती है और ट्यूमर साइट में भर्ती ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टीएएमएस) को शामिल किया जाता है। बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) ग्लियोमा कोशिकाओं के साथ घनिष्ठ संबंध में इन टीएएमएस की एक बड़ी आबादी का प्रतिनिधित्व करता है। ट्यूमर के प्रभाव में, BMDMs वीवो विरोधी भड़काऊ और समर्थक ट्यूमर प्रोफाइल^३९में प्रदर्शन । कैसे इन BMDMs में विट्रो ट्यूमर सेल आक्रमण को नियंत्रित कर सकता है इस रिपोर्ट में एक महत्वपूर्ण सवाल है । यही कारण है कि, मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग ग्लियोमा स्फेरॉइड आक्रमण परख में अकेले किया जाता था। सह-संस्कृति में, ग्लियोमा कोशिकाओं ने एंटी-भड़काऊ प्रोफाइल के साथ अन्य ईवी आबादी का उत्पादन करने के लिए मैक्रोफेज को प्रभावित किया होगा। प्रतिरक्षा ईवीएस का सीधा उपयोग एंटी-ट्यूमर एजेंट के रूप में बहुत बेहतर हो सकता है। नतीजतन, प्रतिरक्षा कोशिकाएं विशिष्ट सूक्ष्म वातावरण में सेल-टू-सेल संचार बनाए रखती हैं जहां भड़काऊ संतुलन बाहरी संकेतों^40,^,⁴¹से दृढ़ता से प्रभावित होता है। ईवी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की समझ कई विकारों के रोगजनकता को सीमित करने के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करती है। जैविक रूप से सक्रिय ईवी सामग्री की पहचान डिस्विनियमित भड़काऊ प्रक्रियाओं को समझने और⁴²^,⁴³नई चिकित्सीय रणनीतियों का प्रस्ताव करने की एक कुंजी है .

इस अध्ययन में हम कोशिका मलबे, अपोप्टोटिक निकायों और घुलनशील अणुओं को खत्म करने के लिए पहले कदम के रूप में एक अंतर अल्ट्रासेंटिफ्यूजेशन प्रक्रिया में शामिल एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं, जो आणविक समुच्चय से ईवीएस को अलग करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी के साथ संयुक्त है। जब ईवी आबादी जैविक परखमें मूल्यांकन कर रहे हैं, यह अंय सह अलग सामग्री से EV सामग्री भेदभाव करने के लिए महत्वपूर्ण है । यही कारण है कि हमने गैर-EV-संबद्ध यौगिकों से EV को अलग करने के लिए अलगाव में सुधार किया। एसईसी प्रक्रिया में प्रस्तुत नियंत्रण नमूनों में मानक प्रोटीन जोड़कर, हम तब मालदी-TOF द्वारा अपने एल्यूशन अंशों को स्थानीयकृत करने में सक्षम थे। क्योंकि मानक मुक्त अणु हैं, वे विश्व स्तर पर गैर EV सामग्री से संबंधित नमूना-संबद्ध आणविक समुचेय के साथ सह-elute । इस प्रकार, प्रयोगात्मक नमूनों से ईवी अंशों को एक विश्वसनीय अलगाव प्रक्रिया में मान्य किया गया था। इसके अलावा, हमने एक डबल प्रोटेओमिक विश्लेषण रणनीति विकसित की। एक EV मार्कर प्रारंभिक पता लगाने के रूप में पश्चिमी दाग द्वारा विरोधी HSP90 एंटीबॉडी के उपयोग को छोड़कर, हम EV से जुड़े प्रोटीन हस्ताक्षर का एक गैर लक्षित पता लगाने के द्वारा सही EV अंशीकरण मांय करने का फैसला किया । दरअसल, वर्तमान दृष्टिकोण जानबूझकर अपर्याप्त विशिष्टता और कुछ एंटीबॉडी की संवेदनशीलता के कारण कई ज्ञात EV मार्कर का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित नहीं किया गया था । परिवर्तनशीलता और EV उपआबादी की सतह पर कुछ EV मार्कर की बहुतायत अभी भी अलगाव प्रक्रियाओं में विवादास्पद हैं । इसके अलावा, एक एंटीबॉडी आधारित पद्धति वाणिज्यिक एंटीबॉडी की कमी के कारण जीवों की एक उच्च संख्या में एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकती है जबकि ईवी अध्ययन अब जीव विज्ञान में एक गर्म विषय हैं। इस गैर-लक्षित विश्लेषण ने उच्च संख्या में अणुओं की पहचान की अनुमति दी जो पहले से ही ईवी मार्कर (एक्सोकार्टा डेटाबेस से शीर्ष 100 ईवी मार्कर में 86 प्रोटीन) के रूप में वर्णित हैं। अंत में, यह दृष्टिकोण वास्तव में खराब वर्णित जीवों से ईवी अलगाव को मान्य करने के लिए उपयोगी हो सकता है बशर्ते कि पता चला प्रोटीन ज्ञात EV मार्कर के लिए महत्वपूर्ण समरूपता पेश कर सकता है। जैसा कि हाल ही में वर्णित है, एक बड़े पैमाने पर प्रोटेओमिक विश्लेषण केवल कुछ मनमाने ढंग से मार्कर⁴³का उपयोग करने का विकल्प हो सकता है। इससे ईवी + अंशों के भेदभाव में सुधार होगा और जैविक परखों में उपयोग करने से पहले उनकी सक्रिय सामग्री की पहचान होगी।

दरअसल, जैविक परखों में देखे गए प्रभावों के लिए ईवी सामग्री के लक्षण वर्णन को जोड़ना आवश्यक है। दरअसल, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के लिए ईवीएस के जैविक प्रभाव से पता चलता है कि वेसिकुलर मध्यस्थ या प्रभावक शामिल होंगे। फिर, वही गैर लक्षित विश्लेषण जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की पहचान की अनुमति देता है । इस विश्लेषण में एक संभावित अनुकूलन अणुओं के प्रकार ों की पहचान करने से संबंधित है। हमारी रणनीति प्रोटीन हस्ताक्षर के बड़े पैमाने पर विश्लेषण पर आधारित थी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और न्यूरॉन अस्तित्व से जुड़े भविष्य कहनेवाला जैविक रास्ते के लिए नेतृत्व किया । उदाहरण के लिए लिपिड्स, एमआरएनए और माइक्रोआरएनए सहित अन्य अणु परिवारों पर विचार करना आवश्यक है। हमारे वर्तमान अध्ययन इस EV-निर्भर संचार का वैश्विक ज्ञान प्राप्त करने के लिए प्रोटीन हस्ताक्षर करने के लिए इन अतिरिक्त पहचानों को संबद्ध करते हैं।

आने वाले वर्षों में कई चिकित्सीय दृष्टिकोणों की परिकल्पना की गई है । यह देखते हुए कि ईवीएस आसानी से रक्त मस्तिष्क बाधा को पार करने और रोग ऊतकों तक पहुंचने में सक्षम हैं, इन आणविक कार्गो का उपयोग विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है। हालांकि इस अध्ययन EV सतह अणुओं पर प्रकाश डाला नहीं था, उनकी पहचान अभी भी आवश्यक है ताकि बेहतर लक्ष्य कोशिकाओं और ऊतकों की दिशा में संबोधित प्रक्रिया को समझने के लिए । हमारी कार्यप्रणाली में प्रोटेओमिक विश्लेषण इन आंकड़ों तक पहुंच प्रदान करता है। अन्यथा, इस रिपोर्ट में, हमने ईवीएस के इन विट्रो उत्पादन को लाभकारी कॉकटेल के रूप में प्रस्तुत किया । हमने प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पहले से ही प्राइम या सक्रिय करने के लिए सर्वोत्तम स्थितियों का अनुकूलन नहीं किया। यह बिंदु महत्वपूर्ण है क्योंकि ऊतकों में, सूक्ष्मवातावरण का प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर सीधा प्रभाव पड़ता है और अंततः उनके ईवीएस के बायोजेनेसिस को आकार देने में योगदान देता है। उदाहरण के लिए ग्लियोब्लास्टोमा के मामले में, यह पाया गया है कि कैंसर कोशिकाएं अपने स्वयं के ईवीएस का उत्पादन करती हैं, इस प्रकार पड़ोसी टीएएमएस को विरोधी भड़काऊ प्रोफाइल और उनके स्थानीय इम्यूनोसप्रेसियन^44,^,⁴⁵की ओर उन्मुख करने में योगदान देती हैं। यही कारण है कि ग्लियोमा वातावरण में मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस एकल मैक्रोफेज संस्कृति में उत्पादित लोगों से अलग हैं। इस प्रकार, हमने ग्लियोमा स्फेरॉइड आक्रमण को नियंत्रित करने के लिए एक मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का सीधे उपयोग किया, क्योंकि ग्लियोमा स्फेरॉइड आक्रमण को नियंत्रित करने के लिए हमने सीधे मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग किया क्योंकि ट्यूमर के विकास पर मैक्रोफेज-ग्लियोमा सह-संस्कृति का कोई नियंत्रण नहीं है। इसके अलावा चिकित्सीय रणनीतियों सक्रिय मैक्रोफेज से विट्रो में उत्पादित समर्थक भड़काऊ और एंटी-ट्यूमरल ईवीएस का उपयोग करके वीवो इम्यूनोसप्रेसन में इसे रोक सकती है। इसी तरह की रणनीति माइक्रोग्लिया से प्राप्त ईवीएस के उपयोग के माध्यम से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के संदर्भ में उपयोग किया जा सकता है ठीक से न्यूरोसुरक्षात्मक और एंटी-भड़काऊ प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए न्यूरोसुरक्षात्मक और एंटी-भड़काऊ प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए सतर्क किया गया है। निष्कर्ष में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और वीवो माइक्रोएनवायरमेंट के बीच ईवी-मध्यस्थता संचार के अध्ययन रोगजनकों की बेहतर समझ और अभिनव चिकित्सीय दृष्टिकोणों को डिजाइन करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्रस्तुत कार्य को मिनेस्टेयर डी एल'एजुकेशन नेशनल, डी एल'एनसेग्नेमेंट सुपेरियर एट डी ला रेचे चेचे और आईएनसेआरएम द्वारा समर्थित किया गया था। हम कृतज्ञता से उपकरणों और तकनीकी सलाह के लिए उपयोग के लिए BICeL-परिसर वैज्ञानिक शहर सुविधा स्वीकार करते हैं । हम कृतज्ञता से जीन पास्कल गिमेनो, Soulaimane Aboulouard और इसाबेल फोरनियर मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहायता के लिए स्वीकार करते हैं । हम कृतज्ञता से तनीना अरब, क्रिस्टेले वैन शिविर, फ्रेंकोइस ले Marrec-Croq, Jacopo Vizioli और पियरे एरिक Sautière वैज्ञानिक और तकनीकी विकास के लिए उनके मजबूत योगदान के लिए स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-rad	4561045EDU
Acetonitrile	Fisher Chemicals	A955-1
Amicon 50 kDa centrifugal filter	Merck	UFC505024
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
B27 Plus supplement	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 Vortex Mixer	Benchmark Scientific	BV1003
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096
C6 rat glioma cell	ATCC	ATCC CCL-107
Canonical tubes	Sarstedt	62.554.002
Centrifuge	Eppendorf	5804000010
CO₂ Incubator	ThermoFisher
Confocal microscope LSM880	Carl Zeiss	LSM880
Cover glass	Marienfeld	111580
Culture Dish (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph	ThermoFisher
Electron microscope JEM-2100	JEOL
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)			http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum	Gibco	16140071
Fetal Horse Serum	Biowest	S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	Brucker
Fluorescence mounting medium	Agilent	S3023
Formic Acid	Sigma-Aldrich	695076
Formvar-carbon coated copper grids	Agar scientific Ltd	AGS162-3
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
Idoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Invert light microscope CKX53	Olympus
L-glutamine	Gibco	25030-024
LabTek II 8 wells	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
MaxQuant software (proteins identification software)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell	Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385-100G
MiliQ water	Merck Millipore
Milk	Regilait	REGILAIT300
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC
MonoP FPLC column	GE Healthcare		no longer available
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	NS300
NanoSight NTA software v3.2	Malvern Panalytical
NanoSight syringe pump	Malvern Panalytical
Neurobasal	Gibco	21103-049
Nitrocellulose membrane	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multidish 24 wells	ThermoFisher	82.1473
Paraformaldehyde	Electro microscopy Science	15713
PC-12 cell line	ATCC	ATCC CRL-1721
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peptide calibration mix	LaserBio Labs	C101
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Perseus software (Processing of identified proteins)			https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate	Santa-cruz	sc-362065
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	78830
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190094	no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm	pluriSelect	43-50060
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	355651
Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
PureCol	Cell Systems	5005
Q-Exactive mass spectrometer	ThermoFisher
rapifleX mass spectrometer	Brucker
Rat cortical neurons	Cell Applications	R882N-20	Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium	Cell Applications	R620K-100	Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages	Cell Applications	R8818-10a
Rat primary microglia	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Slide	Dustsher	100204
Sodium Chloride	Scharlau	SO0227
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Sodium hydroxide	Scharlab	SO0420005P
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac Vacuum Concentrator	ThermoFisher
String software (functional protein association networks)			https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate	ThermoFisher	34075
Syringe 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell	Bio-Rad	1703940
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glycine	Euromedex	EU0550
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95765
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Uranyl acetate	Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Whatman filter paper	Sigma-Aldrich	WHA10347510
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	C2020-25G

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Neuroscience

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

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