Summary
דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.
Abstract
שיתוף התרבות של התא שימש בשימוש נרחב ללימוד אינטראקציות תא תא בין סוגי תאים שונים כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של מחלות כולל סרטן. עם זאת, הוא מאתגר להבהיר את המנגנון המורכב של אינטראקציות בין-סלולריות באוכלוסיות תאים הטרוגניות ביותר באמצעות מערכות שיתוף התרבות המקובלת, מכיוון שטרוגניות של אוכלוסיית המשנה של התא מטושטשת מהערכים הממוצעים; ניתן להשתמש במערכות שיתוף התרבות המקובלות רק כדי לתאר את אות האוכלוסיה, אך אינן מסוגלות לעקוב אחר התנהגות של תאים בודדים. יתרה מזאת, שיטות נסיוניות רגילות של תא יחיד בעלות יעילות נמוכה בטיפול בתאים בגלל התפלגות פואסון. התקנים מיקרו-מפוברק הם טכנולוגיה מתפתחים למחקרים בעלי תאים בודדים, משום שהם יכולים לטפל במדויק בתאים בודדים בתפוקה גבוהה ולהפחית את הצריכה הכימית של המדגם. כאן, אנו מתארים את המושג ואת היישום של שבב מיקרופלואידיג עבור מספר רב של תאים בודדים-שיתוף תרבויות. השבב יכול ביעילות ללכוד סוגים מרובים של תאים בודדים בחדר התרבות (~ 46%) והוא בעל מרחב תרבותי מספיק שימושי לחקר התנהגות התאים (למשל, הגירה, התפשטות וכדומה) תחת אינטראקציה תא תא ברמת התא היחיד. תאים אנדותל הלימפה וקרצינומה של תאים אוראלי קשקש שימשו כדי לבצע ניסוי של תא יחיד שיתוף התרבות על פלטפורמת microfluidic עבור חיים מרובים בודד אינטראקציה מחקרים.
Introduction
לכידה יעילה של סוגים שונים של תאים בודדים ואספקת מרחב תרבותי מספיק נדרשים עבור ניסויים תא יחיד שיתוף התרבות של סוגים מרובים של תאים בודדים1. הגבלת דילול היא השיטה הנפוצה ביותר כדי להכין את התאים היחידים עבור ניסויים כאלה, בשל העלות הנמוכה של ציוד נדרש. עם זאת, בשל מגבלת התפלגות פואסון, ההסתברות המרבית לרכישת תא בודד היא רק 37%, מה שהופך את הפעולה הניסיונית לעמלולגזול זמןרב. לעומת זאת, שימוש במיון תאים המופעל באמצעות הזריחה (FACS) יכול להתגבר על מגבלת התפלגות פואסון כדי להכין תאים בודדים באופן יעיל ברמה3. עם זאת, FACS לא יכול להיות נגיש למעבדות מסוימות בשל עלות מכשור יקר ותחזוקה. התקנים מיקרו-מפוברק פותחו לאחרונה עבור השמנה של תא בודד4, זיווג של תא בודד5ויישומי תרבות תא בודדים. התקנים אלה מבוססים על יכולתם לטפל באופן מדויק בתאים בודדים6, לבצע ניסויים בתפוקה גבוהה, או להפחית את הצריכה הכימית של המדגם. עם זאת, ביצוע ניסויים בשיתוף עם תאים בודדים עם סוגי תאים מרובים עם מכשירים מיקרופלואידים הנוכחיים עדיין מאתגרים בשל הגבלת התפלגות פואסון1,7,8או אי-יכולת של התקנים כדי ללכוד יותר משני סוגים של תאים בודדים4,5,6,9,10.
לדוגמה, יון ואח ' דיווח על מכשיר מיקרופלואידיג למחקר האינטראקציה תא תא11. התקן זה משתמש בשיטה הפרוליסטית כדי לזווג תאים בחדר אחד. עם זאת, הוא יכול להשיג רק את הזיווג של שני סוגי תאים שונים עקב הגבלות גיאומטריות במבנה ההתקן. דו ח נוסף של לי ואח ' הפגין שיטה דטרמיניסטית ללכוד ולזווג תאים בודדים12. התקן זה מגביר את יעילות השיוך בשיטה הדטרמיניסטית, אך הוא מוגבל על-ידי זמן הפעולה הממושך הנדרש לזוג תאים. באופן ספציפי, לכידת התא השני יכול להתבצע רק לאחר שהתא הראשון שנלכד מחובר לפני השטח לאחר 24 שעות. זאו ואח ' דיווח על מכשיר מיקרופלואידיג מבוסס-droplet כדי ללכוד שני סוגים של תא אחד13. אנו יכולים למצוא כי מכשיר מיקרופלואידיג מבוסס-droplet עדיין מוגבל להתפלגות פואסון וניתן להשתמש בו רק בתאים שאינם מחוברים, ואין אפשרות לשנות את פתרון התרבות במהלך תהליך הטיפוח-תרגול.
בעבר, פיתחנו מיקרופלואידים "שבב שחרור הידרודינמי" כי מנצל כוחות הידרודינמיים דטרמיניסטי ללכוד סוגים מרובים של תא יחיד לתוך חדר התרבות, ולאחר מכן ניתן לבצע ניסוי שיתוף התרבות התא כדי לנתח התנהגות בודדת של העברת תאים תחת אינטראקציות תא תא14. שבב המעבר ההידרודינמי כולל מערך מסודר של יחידות, שכל אחד מהם מכיל ערוץ הומה-מעבר, אתר לכידת וחדר תרבות. על-ידי שימוש בשינוי בעמידות הזרימה בין הערוץ המיועד למעבר לבין חדר התרבות, והליך פעולה שתוכנן במיוחד, ניתן ללכוד שוב ושוב לתוך חדר התרבות. בעיקר, המרחב הגדול של חדר התרבות יכול לא רק למנוע את הריקון של התא במהלך לכידת התא, אלא גם לספק מספיק מקום עבור התאים כדי להפיץ, מתרבים ולהגר, ומאפשר התבוננות של לחיות אינטראקציה בין תאים בודד. במאמר זה, אנו מתמקדים בייצור של התקן זה ושלבי פרוטוקול מפורטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור עובש וופל על ידי ליתוגרפיה רכה
הערה: נתוני תבנית המסיכה זמינים בפרסום הקודם שלנו14.
- מייבשים 4-בעובי וופל סיליקון בתנור של 120 ° c במשך 15 דקות.
- ספין מעיל 4 גרם של SU-8 2 שלילי photoresist על 4-inch סיליקון וופל ב 1,000 rpm עבור 30 כדי ליצור 5 יקרומטר שכבה עבה (שכבה #1).
- שכבת אפיה רכה #1 בפלטה של 65 ° c במשך 1 דקות ולאחר מכן העבר שכבה #1 לפלטה של 95 ° c במשך 3 דקות.
- שכבה מגניבה #1 לטמפרטורת החדר, מניחים אותו על המחזיק של המסכה חצי אוטומטית מסכה, ולהתיישר עם השכבה #1 מצופה כרום (שכבת אתר לכידת).
- לחשוף את השכבה #1 עם אור UV 365 ננומטר במינון של 150 mJ/cm2.
- הסרת שכבה #1 מהתנינים ולאחר אופים בפלטה של 65 ° c במשך 1 דקות. שכבת העברה #1 לפלטה של 95 ° c במשך 1 דקות.
- שכבה מגניבה #1 לטמפרטורת החדר. לטבול ב-פרופילן גליקול מונואתיל אתר הפתרון אצטט לשטוף את photoresist uncrosslinked קושרים עבור 2 דקות. יבש בעדינות עם גז חנקן כדי לחשוף שכבה #1 סימון יישור.
- כסו את השכבה #1 סימון יישור על-ידי קלטת דבק, מעיל ספין 4 גרם של SU-8 10 שלילי photoresist אל השכבה #1 ב 1,230 rpm עבור 30 s כדי ליצור 25 יקרומטר שכבה עבה #2.
- הסירו את הקלטת, שכבת אפיה רכה #2 בפלטה של 65 ° c במשך 3 דקות ולאחר מכן העבר שכבה #2 לפלטה של 95 ° c במשך 7 דקות.
- שכבה מגניב #2 לטמפרטורת החדר, שכבת מקום #2 על המחזיק של המסכה חצי אוטומטי מסכה, וליישר את השכבה #2 מצופה כרום (לעקוף את שכבת הערוץ) לסמן #1 יישור השכבה.
- לחשוף את השכבה #2 עם אור UV 365 ננומטר במינון של 200 mJ/cm2.
- הסרת שכבה #2 מהתנינים ולאחר האפייה בפלטת 65 ° c במשך 1 דקות ושכבת העברה #2 לפלטה של 95 ° c במשך 3 דקות.
- שכבה מגניבה #2 לטמפרטורת החדר, ומכסים את השכבה #1 סימון יישור על-ידי דבק. מעיל ספין 4 גרם של SU-8 2050 שלילי photoresist אל שכבה #2 ב 1,630 rpm עבור 30 כדי ליצור שכבה 100 בעובי יקרומטר #3.
- הסירו את הקלטת, שכבת אפיה רכה #3 בפלטה של 65 ° c במשך 5 דקות, ולאחר מכן העבר שכבה #3 לפלטה של 95 ° c במשך 20 דקות.
- שכבה מגניבה מ#3 לטמפרטורת החדר, המקום שכבה #3 על המחזיק של המסכה חצי אוטומטי מסכה, וליישר את השכבה #3 מצופה כרום (שכבת קאמרית התרבות) השכבה #1 סימון יישור.
- לחשוף את השכבה #3 עם אור UV 365 ננומטר במינון של 240 mJ/cm2.
- הסרת שכבה #3 מהתנינים ולאחר האפייה בפלטה של 65 ° c במשך 5 דקות. שכבת העברה #3 לפלטה של 95 ° c במשך 10 דקות.
- שכבה מגניבה #3 לטמפרטורת החדר. לטבול את הפתרון פרופילן גליקול monomethyl כדי ששטף את photoresist בלתי מקושרים עבור 10 דקות, ויבש בעדינות עם גז חנקן.
2. הכנה להתקן PDMS ללכידת תאים בודדים מרובים
- מניחים את העובש וופל ואת הצלחת שקילה המכילה 100 μL של triכלור silane ב desiccator (רק עבור silaniטיזציה) ולהחיל ואקום (-85 kPa) עבור 15 דקות.
הערה: Silanize משטח וופל עם triכלור silane ליצור משטח הידרופובי נכסים לפני PDMS castingso כי זה יכול להיות מאמץ להיות מקולף מן העובש PDMS וופל. - לעצור את הוואקום, ולאחר מכן silanize עובש וופל בdesiccator (רק עבור silanize) ב 37 ° c עבור לפחות 1 h.
- מערבבים בסיס PDMS ו PDMS לריפוי הסוכן ביחס של 10:1. יוצקים סך של 20 גרם של PDMS מעורבת על עובש וופל בצלחת 15 ס מ.
- מניחים את המנה 15 ס מ לתוך desiccator ולהחיל ואקום (-85 kPa) עבור 1.5 דקות. לאחר מכן להסיר את המנה 15 ס מ מdesiccator. . שמרו על 20 דקות בטמפרטורת החדר לבסוף, להסיר בועות אוויר שיורית ב-PDMS עם גז חנקן.
- מניחים את הצלחת 15 ס מ בתנור ב 65 ° c עבור 2-4 h כדי לרפא PDMS.
- הסר את העותק המשוכפל PDMS מן העובש וופל, ולאחר מכן אגרוף 1.5 mm ו שקע 0.5 מ"מ ב-PDMS באמצעות הקוטר הפנימי 1.5 מ"מ ו מנקב בקוטר הפנימי של 0.5 mm (איור 1ג).
- נקה את העותק המשוכפל של PDMS ואת משטח השקופית עם סרט נשלף ולאחר מכן התייחס למשטח עם פלזמה חמצן (100 W עבור 14 s).
- יישר באופן ידני את העותקים המשוכפלים של PDMS עם השקופית והבא אותם במגע זה עם זה.
- הצב את השקופית PDMS בתנור של 65 ° c ליום אחד.
הערה: התחברות קבועה בין השקופית לעותק המשוכפל של PDMS מושגת כדי ליצור את ההתקן. - לטבול את המכשיר PDMS במיכל מלא מלוחים מאגור פוספט ומקום לתוך desiccator. לאחר מכן להחיל ואקום (-85 kPa) עבור 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- מניחים את המכשיר PDMS במכסה של תרבות התא ולעקר את המכשיר עם אור UV (גל קל: 254 ננומטר) עבור 30 דקות.
- החלף את מאגר התקן PDMS עם בינוני (בינונית-F12 הבסיס מכיל 1% אנטיביוטיקה ו 10% סרום העובר העוברי) ו מודדת את המכשיר PDMS ב 4 ° צ' ליום אחד. פעולה זו מונעת מתאים לדבוק במשטח PDMS.
3. הכנת השעיית תא בודד
הערה: סוגי התאים כוללים תאי הלימפה האנושיים האדם (LECs), האדם OSCC TW 2.6 תאים מביע WNT5B הספציפי מרין (WNT5B sh4) ו-וקטור בקרה (pLKO-GFP) אשר התקבלו מן המחקר הקודם שלנו15. עיין בפרסום הקודם שלנו לקבלת צעדי טיפוח מפורטים.
- הסר את אמצעי התרבות כאשר התאים משיגים 70-80% זרימה. ואז לשטוף בעדינות את התאים עם 5 מ ל של PBS סטרילי שלוש פעמים.
- הוסף 1 מ ל של מדיום Dמאמ-F12 המכיל 1 צבע פלורסנט μM לתוך WNT5B sh4 ו pLKO-GFP תאים (להשתמש במדיום MV2 עבור LECs) ולאחר מכן הופך את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: LECs היו מוכתמים עם ירוק כלורמאטילתעין diacetate (CMFDA) לצבוע, תאים WNT5B sh4 היו מוכתמים עם כחול 7-אמינו 4-כלורמורמרין (CMAC) צבען ו pLKO-GFP היו מוכתמים בצבע פלורסנט אדום דיל. - לשטוף בעדינות את התאים עם 5 מ ל של PBS סטרילי שלוש פעמים.
- הסר את ה-PBS והוסף 2 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין-EDTA עבור LECs).
- דגירה את התאים 4 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להקיש בעדינות את הצלחת תרבות הרקמה כדי לקדם את הניתוק התאים.
- הוסף 4 מ ל של מדיום Dמאמ-F12 כדי לפזר WNT5B sh4 ו pLKO-GFP תאים (עבור LECs להשתמש 3 mL של MV2 medium ו 1 מ ל של טריפסין פתרון מנטרל). ואז להעביר את התאים לתוך שפופרת 15 mL, וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות.
- הסר את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של מדיום DMEM-F12 בעדינות. לספור את מספר התאים החיים בתוך הטציטומטר באמצעות שיטת ההדרה הרגילה של טריקון כחול16. הכינו 1 מ ל של השעיית תא ב 3 x 105 תאים/הריכוז ML ב Dמאמ-F12 בינונית, ולאחר מכן לשמור על התאים בקרח כדי למנוע צבירת תאים.
הערה: כדי לשפר את יעילות לכידת התא בודד, הכנה זהירה של השעיית התא היחיד עם הנתק היטב נדרש.
4. לכידת תא בודד ותלת-ממדי של תאים בודדים
- לחבר צינורית פולי-טטרמטאן, בין משקע ההתקן ומשאבת המזרק. הסר את המדיום ולהוסיף 1 μL של השעיית תא בריכוז של 3 x 105 תאים/mL לתוך השקע של התקן pdms.
- טען את ההשעיה התא לתוך המכשיר על ידי משאבת מזרק בקצב הזרימה של 0.3 μL/min (איור 2א). כיוון הזרימה הוא מהים אל השקע.
הערה: טען מיד לאחר הוספת התא הבולם לתוך השקע כדי למנוע משקעי תאים. - הוסף 1 μL של מדיום DMEM-F12 לתוך ההתקן של התקן PDMS לאחר שלב 4.2. לטעון את המדיום DMEM-F12 לתוך המכשיר על ידי משאבת מזרק בקצב הזרימה של 0.3 μL/min (איור 2B). כיוון הזרימה זורם מהים אל השקע.
- טען 0.3 μL של מדיום Dמאמ-F12 לתוך המכשיר על ידי משאבת מזרק בקצב הזרימה של 10 μL/min (איור 2ג). כיוון הזרימה זורם משקע החשמל.
- חזור על שלבים 4.1 כדי 4.4 כדי לטעון סוגי תאים אחרים לתוך ההתקן.
- לאחר השלמת לכידת התא, להשתמש במיקרוסקופ עם עדשת 4x לתמונה כל חדר תרבות.
הערה: פליטת הקרינה הפלואורסצנטית של התאים שימש כדי לזהות ולספור את מספר התאים הבודדים בכל חדר תרבות. - הסירו את מחסום הגוף ואטמו את השקע ואת הפורקן עם הקלטת של פוליופין כדי ליצור מערכת תרבות סגורה.
- להעביר את המכשיר PDMS לצלחת 10 ס מ תרבות ולהוסיף 10 מ ל של PBS סטרילי סביב המכשיר PDMS כדי למנוע אידוי של המדיום מהמכשיר.
- העבר את קערת התרבות לאינקובטור (37 ° C, 5% CO2 ו-95% לחות) לתרבות משולשת של תא בודד.
- להתבונן באופן מיקרוסקואני ולצלם צמיחת תאים כל 12 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההתקן כולל מבנה בן שלוש שכבות, כפי שמוצג על-ידי הצילום החתך של התקן PDMS שנחתך (איור 1א). השכבה הראשונה מכילה אתר לכידת (6.0 יקרומטר ברוחב ו 4.6 יקרומטר בגובה) המחבר את חדר התרבות ואת ערוץ ידי-pass. ההבדל בין התנגדות הזרימה בין חדר התרבות והערוץ של המעבר גורם לתאים לזרום לתנוחת הלכידה ולמלא את הכניסה לנתיב הקטן. לאחר שנלכד תא בתנוחת הלכידה, עמידות הזרימה של הנתיב הקטן מוגברת, וגורמות לתא הנכנס הבא לעבור לכיוון ולאורך ערוץ המעבר אל אתר הלכידה הבא במורד הזרם. העיצוב הסרפנטיין של הערוץ על ידי-pass (25.0 יקרומטר ברוחב ו 26.4 יקרומטר בגובה) של השכבה השנייה משמש כדי להגדיל את עמידות הזרימה שלה. הממדים של חדר התרבות בשכבה השלישית (500.3 יקרומטר בקוטר ו 111.3 יקרומטר בגובה) נועדו לספק מספיק מקום לניסוי של תרבות התא, וכדי להקטין את קצב הזרימה בחדר כדי לשמור על התאים מפני ריקון מתוך החדר.
הכלים הנדרשים להליך המבצע (איור 2) נפוצים במעבדות כלליות, כולל מיקרוסקופ, משאבת מזרק, מזרק זכוכית, צינורית צנטריפוגה, אבובים ופיפטה. המכשיר הוא כ 1/5 של שמיכות עם עובי 2 מ"מ והוא מתאים להתבוננות תחת מיקרוסקופ עם 4x כדי 20x עדשה. בשיטה זו, סוג אחד עבור תאים בודדים יכול להילכד בתאי התרבות תחת 7 דקות, כך שזמן הפעולה הכולל של תאים בודדים משולשת היה פחות מ -21 דקות. תא יחיד לכידת יעילות של שלושה תאים הפגינו היו 70.83% ± 15.42% (LECs), 73.96% ± 14.09% (WNT5B sh4) ו 78.13% ± 3.13% (pLKO-GFP), בהתאמה. היעילות המשולשת לכידת תא אחד היה 47.92% ± 7.86% (איור 3ב). שלב פעולת הריפלוקס משמש לשחרור התאים מאתרי הלכידה בו זמנית ולהזרמת התאים לתאי התרבות (איור 2ג). במהלך תהליך זה, אם תא אינו משתחרר מאתר הלכידה שלו, התא המשוחרר במורד הזרם שלו במורד האתר לא ייכנס לחדר התרבות בשל העברת הערוץ באמצעות התנגדות הזרימה הנמוכה יותר מאשר חדר התרבות. זוהי הסיבה העיקרית מדוע HSC יש ללכוד משולשת תא יחיד היעילות של רק 47.92 ± 7.86%, אשר עדיין גדול באופן משמעותי מאשר ההסתברות של התפלגות פואסון (~ 5%).
התוצאות של תרבות התא הראו כי שיתוף התרבויות מרובות תא בודד של תאים אנדותל הלימפה ותאים סרטניים קשקשיים ניתן לבצע עבור 24 שעות, ואת התפשטות התאים ומורפולוגיה ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ (איור 4, סרטונים משלימים 1-3). בנוכחות של תאים pLKO-GFP, WNT5B sh4 תאים ו-LECs הראה קיבולת ההתרבות טוב יותר והראה כי המבנה התקרב lamellipodia. תוצאות אלה מציגות את היכולת של התקן זה ללכוד ביעילות רבה סוגים מרובים של תאים בודדים בחדר התרבות ולספק שטח תרבותי מספיק שימושי ללימוד אינטראקציות סוג תא בודד מרובות.
איור 1: צילום ומיקרוסקופ תמונות של שבב שובל הידרו דינמי. (א) תמונת מיקרוסקופ של ההשקפה הסקצרית pdms. (ב) יחידת השמנה של תא בודד של תצוגה מוגדלת. (ג) מראה של השבב המכיל 48 יחידות. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שגרת הפעולה של שבב הידרודינמי. (א) בשל ההתנגדות ההידרודינמית הגבוהה של ערוץ המעבר, תא בודד לכוד באתר הלכידה. (ב) לאחר שהתא הראשון לכוד והוא סגר את אתר הלכידה, התאים הבאים זורמים לעבר ערוץ המעבר בעקבות התנגדות הזרימה המוגברת. השתמש במדיום כדי לשטוף את התאים הנותרים בערוץ. (ג) ריפלוקס את התא לתוך חדר התרבות. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יעילות לכידת התא בודד של LECs, WNT5B sh4 ו-pLKO-GFP בשבב שובל הידרו דינמי. (א) מיקרוסקופ דמות של תאים בודדים משולשת בחדר התרבות. (ב) הפסים הירוקים, הכחולים והאדומים מייצגים את יעילות הלכידה של תאים בודדים, בהתאמה והפסים הצהובים מייצגים את יעילות הלכידה של תא בודד משולש. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לזווג שיתוף התרבות התא יחיד ושלוש שיתוף התרבות תא יחיד בשבב ההידרודינמי הידרו עבור 24 שעות. (א) מיקרוסקופ תמונה של משולש בודד תאים שיתוף תרבות עבור 0, 12 ו 24 h. (ב) מיקרוסקופ התמונה של PLKO-gfp ו WNT5B sh4 תאים שיתוף תרבות עבור 0, 12 ו-24 h. lecs היו מוכתמים עם צבען הירוק cmfda, WNT5B תאים SH4 היו מוכתמים cmac צבע כחול ו תאים pLKO-GFP היו מוכתמים עם צבע פלורסנט DiI אדום. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: טעינת תא. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
וידאו משלים 2: Refluxing תא. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
וידאו משלים 3: סוג תא השני ריפלוקס לתוך התא התרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האינטראקציות התרבות של תאים שונים מיקרוסביבה הגידול לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות הגידול17. כדי להבין את המנגנון של אינטראקציות תא תא, מערכות שיתוף התרבות משמשות כשיטה אנליטית נפוצה. עם זאת, סוגי תאים מרובים והטרוגניות של התאים עצמם הובילו למורכבות ניסויית ולקשיים אנליטיים.
השבב ההידרודינמי מאפשר טעינה מרובה של תאים בודדים בחדר התרבות בשיטה דטרמיניסטית, מבלי להיות מוגבל על ידי הגבלת התפלגות הפואסון בשיטת הדילול ופלטפורמת המיקרוגל. על-ידי מתן יעילות גבוהה ללכידת תאים בודדת (גדול מ-45%, שיטת הפצת הפואסון היא 5%) והוכחת כי בחדר התרבות, המרחב מספיק לצמיחת תאים והתפשטות (איור 4). בשל יכולתה לבצע ביעילות מספר תאים בודדים לוכדת ולחיות את התצפיות בתרבות התא עם התקנה פשוטה ופרוטוקול, אנו לדמיין את המכשירים המיקרופלואידים האלה ככלים שימושיים עבור מגוון רחב של יישומים, כולל תא תא אינטראקציה בין מספר תאים18, התרופה ההקרנה19, סרטן הביולוגיה20. מצד שני, מבנה ההתקן הוא מולד, ואת המבנה והגודל של אתר לכידת ניתן לשנות ולהחיל על שדות אחרים כגון מיקרואורגניזמים ותאי צמחים. בתאוריה, השיטה שלנו היא גם הסתגלות להקמת ולמעקב אחר תרבויות מיקרוביאלית (למשל, בקטריה, מיאס וכו ').
המגבלה העיקרית של גישה זו היא כי רמת הדיוק הנדרשת לייצור המכשיר הוא גבוה. זה בעיקר בגלל הזרימה להתנגד של הערוץ הקטן ביותר ניתן לשנות באופן דרמטי אם הממדים שלה מפוברק הם היסט מעט. השליטה בתנוחות המיקרו-ערוצים חיונית ללכידת תא יחיד של המכשיר ביעילות גבוהה. מצד שני, במהלך התרבות התאית, אין סגר בין התאים. לפיכך, הפרשת הפרנית של תאים בחדר עשויה להתפשט לתוך חדרי אחרים כדי להשפיע על תאים אחרים. לבסוף, יש לשלם את תשומת הלב לניקיון הערוץ והאבובים במהלך הכנת המכשיר. המדיום התרבותי וכל מאגר המשמש בניסוי צריך להיות מסונן כדי למנוע מחלקיקים ופסולת לחסום את הערוץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק ממשרד המדע והטכנולוגיה (105-2628-E-400-001-MY2), ואת תוכנית הדוקטורט בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, אוניברסיטת צ'ונג הסינג הלאומית ומכוני מחקר בריאות לאומית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
