Summary
Denna rapport beskriver en mikroflödessystem chip-baserad metod för att ställa in ett enda cellkultur experiment där högeffektiv hopkoppling och mikroskopisk analys av flera enskilda celler kan uppnås.
Abstract
Cell Co-Culture analyser har använts i stor utsträckning för att studera cell-cell interaktioner mellan olika celltyper för att bättre förstå biologi av sjukdomar inklusive cancer. Det är dock utmanande att klargöra den komplexa mekanismen för intercellulära interaktioner i mycket heterogena cellpopulationer med hjälp av konventionella Co-Culture system eftersom heterogenitet av cell subpopulationen är skyms av medelvärdena; de konventionella Co-Culture-systemen kan endast användas för att beskriva befolknings signalen, men är oförmögna att spåra enskilda cellers beteende. Konventionella encellig experimentella metoder har dessutom låg verkningsgrad vid cell manipulation på grund av Poissonfördelningen. Mikrofabricerade enheter är en framväxande teknik för encelliga studier eftersom de kan noggrant manipulera enskilda celler vid hög genomströmning och kan minska prov och reagensförbrukning. Här beskriver vi konceptet och tillämpningen av en mikroflödessystem chip för flera encellig Co-kulturer. Chippet kan effektivt fånga flera typer av enstaka celler i en kultur kammare (~ 46%) och har en tillräcklig kultur utrymme användbar för att studera cellernas beteende (t. ex. migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaktion på encellig nivå. Lymfatiska endotelceller och Oral skivepitelcancer användes för att utföra en encellig Co-Culture experiment på mikroflödessystem plattform för levande flera encellig interaktionsstudier.
Introduction
Effektiv avskiljning av olika typer av enskilda celler och ge tillräckligt kultur utrymme behövs för Single cell Co-kultur experiment av flera typer av enskilda celler1. Begränsande utspädning är den vanligaste metoden för att förbereda de enskilda cellerna för sådana experiment, på grund av den låga kostnaden för utrustning som krävs. Men på grund av Poissonfördelningsbegränsande, är den maximala sannolikheten för enstaka cell förvärv endast 37%, vilket gör försöks operationen mödosam och tidskrävande2. Med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) kan man däremot övervinna Poissondistributionsbegränsande funktionen för att på ett effektivt sätt förbereda enstaka celler3. Men FACS kanske inte är tillgängliga för vissa laboratorier på grund av dyra instrumentering och underhållskostnader. Mikrofabricerade enheter har nyligen utvecklats för Single cell svällning4, Single cell parkoppling5, och Single cellkultur applikationer. Dessa enheter är fördelaktiga baserat på deras förmåga att korrekt manipulera enskilda celler6, utföra hög genomströmning experiment, eller minska prov och reagensförbrukning. Men att utföra encellig Co-Culture experiment med flera celltyper med nuvarande mikroflödessystem enheter är fortfarande utmanande på grund av begränsningen av Poisson fördelning1,7,8, eller oförmåga enheterna att fånga mer än två typer av enskilda celler4,5,6,9,10.
Till exempel rapporterade Yoon et al. en mikroflödessystem enhet för cell-cell interaktion studie11. Den här enheten använder den probabilistiska metoden för att para ihop celler i en kammare. Det kan dock bara uppnå hopkopplingen av två olika celltyper på grund av geometriska begränsningar i enhets strukturen. En annan rapport från Lee et al. demonstrerade en deterministisk metod för att fånga och para ihop enstaka celler12. Den här enheten ökar parnings effektiviteten med den deterministiska metoden men begränsas av den förlängda drifttid som krävs för att para ihop celler. Specifikt kan den andra cell fångsten endast utföras efter att den första fångade cellen är kopplad till ytan efter 24 h. Zhao et al. rapporterade en droplet-baserad mikroflödessystem-enhet för att fånga två typer av en enda cell13. Vi kan grunda att den droplet-baserade mikroflödessystem-enheten fortfarande är begränsad till poissonfördelningen och kan endast användas på icke-anslutna celler, och det är inte möjligt att ändra kultur lösningen under odlingsprocessen.
Tidigare har vi utvecklat en mikroflödessystem "hydrodynamiska shuttling chip" som utnyttjar deterministiska hydrodynamiska krafter för att fånga flera typer av Single-cell i kultur kammaren och kan därefter utföra cell Co-Culture experiment för att analysera individuell cell migration beteende under cell-cell interaktioner14. Det hydrodynamiska shuttling-chippet består av en klädd uppsättning enheter som var och en innehåller en Serpentine by-pass-kanal, en insamlingsplats och en kultur kammare. Genom att använda skillnaden i flödesmotstånd mellan Serpentine by-pass-kanalen och kultur kammaren, och en särskilt utformad drift procedur, kan olika typer av enstaka celler upprepade gånger fångas in i kultur kammaren. I synnerhet kan det rikliga utrymmet i kultur kammaren inte bara hindra cellen från att spolas under cell fångst ut utan också ge tillräckligt med utrymme för cellerna att sprida, förgöra och migrera, vilket möjliggör observation av levande Single-cell interaktioner. I den här artikeln fokuserar vi på produktionen av den här enheten och detaljerade protokoll steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av en wafer mögel av mjuk litografi
Mask mönsterdata finns i vår tidigare publikation14.
- Dehydrera en 4-tums kisel wafer i en 120 ° c ugn i 15 min.
- Spin Coat 4 g SU-8 2 negativ fotoresist på en 4-tums kisel wafer på 1 000 RPM för 30 s för att skapa en 5 μm tjockt lager (Layer #1).
- Mjuk Grädda lager #1 på en 65 ° c kokplatta för 1 min och sedan överföra lager #1 till en 95 ° c kokplatta i 3 min.
- Kyl lager #1 till rumstemperatur, placera den på hållaren för den halvautomatiska mask Aligner, och justera med lagret #1 förkromad photomasken (Capture-site Layer).
- Exponera lager #1 med 365 nm UV-ljus vid en dos på 150 mJ/cm2.
- Ta bort lager #1 från Aligner och efter-baka på en 65 ° c kokplatta för 1 min. överföring skikt #1 till en 95 ° c värmeplatta för 1 min.
- Kyl lager #1 till rumstemperatur. Doppa i en propylenglykol bunden eter Acetat lösning för att tvätta bort uncrosslinked fotoresist för 2 min. torka försiktigt med kvävgas för att avslöja ett lager #1 justeringsmärket.
- Täck lagret #1 justeringsmärket med en tejp, spinnrock 4 g SU-8 10 negativ fotoresist på lagret #1 på 1 230 RPM för 30 s för att skapa en 25 μm tjockt lager #2.
- Ta bort tejpen, mjukt baka lager #2 på en 65 ° c kokplatta i 3 min, och sedan överföra lager #2 till en 95 ° c värmeplatta för 7 min.
- Kyl lager #2 till rumstemperatur, placera lagret #2 på hållaren för den halvautomatiska mask Aligner, och justera lagret #2 förkromad photomasken (bypass Channel Layer) till lagret #1 justeringsmärket.
- Exponera lager #2 med 365 nm UV-ljus vid en dos på 200 mJ/cm2.
- Ta bort lager #2 från Aligner och efter-baka på en 65 ° c kokplatta för 1 min och överföra lager #2 till en 95 ° c värmeplatta för 3 min.
- Kyl lager #2 till rumstemperatur, och täck lagret #1 justeringsmärket med tejp. Spin Coat 4 g SU-8 2050 negativ fotoresist på lager #2 på 1 630 RPM för 30 s för att skapa en 100 μm tjockt lager #3.
- Ta bort bandet, mjukt baka skikt #3 på en 65 ° c kokplatta i 5 min, och sedan överföra lager #3 till en 95 ° c värmeplatta för 20 min.
- Kyl lager #3 till rumstemperatur, placera lagret #3 på hållaren för den halvautomatiska mask Aligner, och justera lagret #3 förkromad photomasken (kultur kammar skikt) till lagret #1 justeringsmärket.
- Exponera lager #3 med 365 nm UV-ljus vid en dos på 240 mJ/cm2.
- Ta bort lager #3 från Aligner och efter-baka på en 65 ° c kokplatta för 5 min. överföring lager #3 till en 95 ° c värmeplatta för 10 min.
- Kyl lager #3 till rumstemperatur. Doppa i en propylenglykol bunden eter Acetat lösning för att tvätta bort uncrosslinked fotoresist för 10 min, och försiktigt torka med kvävgas.
2. PDMS anordning förberedelse för mångfaldig enkel cell ta till fånga
- Placera wafer mögel och vägning skålen som innehåller 100 μL av triklorosilane i en exsickator (endast för silanisering) och tillämpa ett vakuum (-85 kPa) för 15 min.
Obs: Silanize den wafer ytan med triklorosilane att skapa hydrofoba ytan egenskaper innan PDMS Casting så att det enkelt kan skalas bort från wafer PDMS mögel. - Stoppa vakuum, och sedan silanize wafer mögel i exsickatorn (endast för silanisering) vid 37 ° c i minst 1 h.
- Blanda PDMS Base och PDMS härdning agent i ett förhållande av 10:1. Häll totalt 20 g blandade PDMS på wafer mögel i en 15 cm skålen.
- Placera 15 cm skålen i en exsickator och applicera vakuum (-85 kPa) för 1,5 min. Ta sedan bort 15 cm skålen från exsickatorn. Förvaras i 20 minuter vid rumstemperatur. Slutligen, ta bort kvarvarande luftbubblor i PDMS med kvävgas.
- Placera 15 cm skålen i en ugn vid 65 ° c för 2-4 h för att bota PDMS.
- Ta bort PDMS replika från wafer mögel, och sedan Punch ett 1,5 mm inlopp och en 0,5 mm utlopp på PDMS med en 1,5 mm innerdiameter och en 0,5 mm innerdiameter hålslag (figur 1C).
- Rengör PDMS replika och glid ytan med löstagbar tejp och sedan behandla ytan med syre plasma (100 W för 14 s).
- Justera PDMS-replikerna manuellt med bilden och ta dem i kontakt med varandra.
- Placera PDMS Slide i en 65 ° c ugn för 1 dag.
Obs: permanent bindning mellan bilden och PDMS repliken uppnås för att bilda enheten. - Sänk ner PDMS-enheten i en behållare fylld med fosfatbuffrad saltlösning och placera den i en exsickator. Applicera sedan vakuum (-85 kPa) i 15 min för att ta bort luftbubblor.
- Placera PDMS-enheten i en cellkultur huva och sterilisera enheten med UV-ljus (ljus våglängd: 254 nm) i 30 min.
- Ersätt PDMS Device buffert med medium (DMEM-F12 basal medium som innehåller 1% antibiotika och 10% foster bovint serum) och inkubera PDMS-enheten vid 4 ° c under 1 dag. Detta förhindrar att celler fastnar på PDMS-ytan.
3. beredning av en encellig suspension
Obs: cell typer inkluderar mänskliga lymfatiska endotelceller (LECs), mänskliga OSCC TW 2.6 celler uttrycker WNT5B-specifika shRNA (WNT5B sh4) och vektor kontroll (pLKO-GFP) som erhölls från vår tidigare studie15. Se vår tidigare publikation för detaljerade odlings steg.
- Ta bort odlingsmediet när cellerna uppnår 70-80% Confluence. Tvätta sedan försiktigt cellerna med 5 mL steril PBS tre gånger.
- Tillsätt 1 mL DMEM-F12-medium innehållande 1 μM fluorescerande färg i WNT5B sh4 och pLKO-GFP-celler (Använd MV2 medium för LECs) och inkubera sedan cellerna i 30 minuter vid rumstemperatur.
Anmärkning: LECs färgas med grön klorometylfluorescein diacetat (CMFDA) Dye, var WNT5B sh4 celler färgas med blå 7-Amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) Dye och pLKO-GFP celler färgas med röd DIL fluorescerande färgämne. - Tvätta försiktigt cellerna med 5 mL steril PBS tre gånger.
- Ta bort PBS och tillsätt 2 mL 0,25% trypsin-EDTA (0,05% trypsin-EDTA för LECs).
- Inkubera cellerna i 4 min vid rumstemperatur och knacka sedan försiktigt på vävnaden kultur skålen för att främja celler avlossning.
- Tillsätt 4 mL DMEM-F12 medium för att skingra WNT5B sh4 och pLKO-GFP-celler (för LECs Använd 3 mL MV2 medium och 1 mL trypsin neutraliseringslösning). Överför sedan cellerna till en 15 mL tub och centrifugera vid 300 x g i 3 min.
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL DMEM-F12-medium försiktigt. Räkna antalet levande celler i en hemocytometern med hjälp av standard Trypan blå uteslutnings metod16. Förbered 1 mL cellsuspension vid 3 x 105 celler/ml koncentration i DMEM-F12 medium, och sedan hålla celler på is för att förhindra cell aggregering.
Anmärkning: för att förbättra Single-cell Capture effektivitet, noggrann beredning av Single cellsuspensionen med väl dissocierade krävs.
4. flera Single-cell Capture och Triple Single-cellkultur
- Anslut en poly-tetrafluoroethene (PTFE) röret mellan utloppet av enheten och sprutpumpen. Ta bort mediet och tillsätt 1 μL cellsuspension i en koncentration av 3 x 105 celler/ml i inloppet till PDMS-enheten.
- Fyll på cellsuspensionen i enheten med en sprutpump med en flödeshastighet på 0,3 μL/min (figur 2a). Flödesriktningen är från inloppet till utloppet.
Obs: Ladda omedelbart efter tillsats av cellsuspensionen i inloppet för att förhindra cell sedimentation. - Tillsätt 1 μL DMEM-F12-medium i PDMS-enhetens inlopp efter steg 4.2. Ladda DMEM-F12-mediet i enheten med en sprutpump med en flödeshastighet på 0,3 μL/min (figur 2B). Flödesriktningen flödade från inloppet till utloppet.
- Fyll 0,3 μL av DMEM-F12-mediet i enheten med en sprutpump med en flödeshastighet på 10 μL/min (figur 2C). Flödesriktningen flödade från utloppet till inloppet.
- Upprepa steg 4,1 till 4,4 för att läsa in andra celltyper i enheten.
- Efter avslutad cell fångst, använda ett Mikroskop med 4x objektiv för att bilden varje kultur kammare.
Anm.: cellernas fluorescensutsläpp användes för att identifiera och räkna antalet enskilda celler i varje odlingskammare. - Ta bort PTFE-röret och försegla inloppet och utloppet med polyolefin tejp för att skapa ett slutet kultur system.
- Flytta PDMS enheten till en 10 cm kultur skålen och tillsätt 10 mL steril PBS runt PDMS enheten för att undvika avdunstning av mediet från enheten.
- Överför kultur skålen till en inkubator (37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet) för Triple Single-cellkultur.
- Microscopically Observera och fotografera celltillväxt varje 12 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enheten har en tre-lagers struktur som visas av tvärsnitt fotografi av en cut PDMS enhet (figur 1a). Det första skiktet innehåller en infångstplats (6,0 μm i bredd och 4,6 μm i höjd) som förbinder kultur kammaren och by-pass-kanalen. Skillnaden i flödes beständighet mellan kultur kammaren och by-pass-kanalen gör att cellerna rinner in i fångst positionen och fyller ingången till den lilla stigen. Efter att en cell har fångats vid fångst positionen ökas flödesmotståndet för den lilla banan, vilket gör att nästa inkommande cell går mot och genom genomströmnings kanalen till nästa underordnade infångnings plats. Den Serpentine utformningen av by-pass kanal (25,0 μm i bredd och 26,4 μm i höjd) av det andra skiktet används för att öka dess flödes beständighet. Dimensionerna av kultur kammaren i det tredje skiktet (500,3 μm i diameter och 111,3 μm i höjd) är utformade för att ge tillräckligt med utrymme för cellkultur experiment, och för att minska flödet i kammaren för att hålla cellerna från att spolas ut ur kammaren.
De verktyg som krävs för drift förfarandet (figur 2) är vanliga i allmänna laboratorier, inklusive Mikroskop, sprutpump, glasspruta, centrifugeringsrör, slangar och pipett. Enheten är cirka 1/5 av en täckglas med en tjocklek på 2 mm och är lämplig för observation under ett Mikroskop med 4x till 20x lins. Med denna metod, en typ för enskilda celler kan fångas i kulturen kamrarna under 7 min, så den totala operationstiden för Triple Single cells var mindre än 21 min. Den enda cell avskiljning effektivitetsvinsterna av de visade tre cellerna var 70,83% ± 15,42% (LECs), 73,96% ± 14,09% (WNT5B sh4) och 78,13% ± 3,13% (pLKO-GFP), respektive. Den Triple Single cell Capture effektivitet var 47,92% ± 7,86% (figur 3B). Den reflux operation steg används för att frigöra cellerna från fångstplatser samtidigt och flöde cellerna i kulturen kamrarna (figur 2C). Under denna process, om en cell inte släpps från sin Capture-plats, kommer den släppta cellen vid dess nedströms infångnings platsen inte in i kultur kammaren på grund av by-pass kanal med ett lägre flödesmotstånd än kultur kammaren. Detta är den främsta anledningen till att HSC har en Triple Single cell Capture verkningsgrad på endast 47,92 ± 7,86%, vilket fortfarande är betydligt större än sannolikheten för en Poissonfördelning (~ 5%).
Cellkultur resultaten visade att flera encellig Co-kulturer av lymfatiska endotelceller och Skivepitelcancer celler kan utföras för 24 h, och cellernas proliferation och morfologi kan observeras under mikroskop (figur 4, Kompletterande videor 1-3). I närvaro av pLKO-GFP celler, WNT5B sh4 celler och LECs visade bättre proliferativ kapacitet och visade att morfologin närmade lamellipodia. Dessa resultat visar förmågan hos denna enhet att effektivt fånga flera typer av enskilda celler i en kultur kammare och ge ett tillräckligt kultur utrymme användbart för att studera flera Single celltyp interaktioner.
Bild 1: fotografi och mikroskopbilder av hydrodynamiska shuttling chip. A) Mikroskop bild av PDMS-sektionsvyn. (B) en enda cell fångst enhet i förstorade vyn. C) utseendet på chippet som innehåller 48 enheter. Skalstapel: 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: drift procedur för hydrodynamiska shuttling-chip. (A) på grund av den höga hydrodynamiska resistensen i by-pass-kanalen fångas en enda cell in i insamlingsplatsen. (B) efter den första cellen är fångade och har ockluderade fångstplatsen, följande celler flödar mot by-pass kanal på grund av ökad flödes beständighet. Använd medium för att tvätta kvarvarande celler i kanal. (C) återflöde cellen till kultur kammaren. Skalstapel: 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Single cell Capture effektivitet LECs, WNT5B sh4 och pLKO-GFP i hydrodynamiska shuttling chip. A) Mikroskop bild av fångade Triple Single cells i kultur kammaren. (B) de gröna, blåa och röda staplarna representerar de enskilda cellernas fångst effektivitet, och de gula staplarna representerar fångst effektiviteten hos Triple Single-cell. Skalstapel: 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: parning av samodling med en enda cell och trippel Single cell-kultur i det hydrodynamiska shuttling-chippet i 24 timmar. (A) Mikroskop bild av Triple Single cells medkultur för 0, 12 och 24 h. (B) Mikroskop bild av PLKO-GFP och WNT5B sh4 celler medkultur för 0, 12 och 24 h. LECS FÄRGAS med grönt cmfda färgämne, WNT5B sh4 celler FÄRGAS med blå CMAC Dye och pLKO-GFP celler färgas med röd DiI fluorescerande färgämne. Skalstapel: 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: cell inläsning. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande video 2: cell Refluxing. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande video 3: andra celltyp reflux i kultur kammaren. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intercellulära interaktioner mellan olika celler i tumören mikromiljö spela en viktig roll i utvecklingen av tumören17. För att förstå mekanismen för cellcellsinteraktioner används samkultursystem som en gemensam analysmetod. Men, flera celltyper och heterogenitet av cellerna själva har lett till experimentell komplexitet och analytiska svårigheter.
Det hydrodynamiska shuttling-chippet möjliggör flera encellslastning i kultur kammaren med en deterministisk metod, utan att begränsas av poissonfördelningsbegränsningen i utspädnings metoden och mikrobrunn-plattformen. Genom att tillhandahålla en hög verkningsgrad för Triple Single cell Capture (större än 45%, är Poissonfördelningsmetoden 5%) och visar att utrymmet i kultur kammaren är tillräckligt för celltillväxt och spridning (figur 4). På grund av dess förmåga att effektivt utföra flera Single-cell fångar och levande cellkulturer observationer med enkel installation och protokoll, vi föreställa dessa mikroflödessystem enheter som användbara verktyg för ett omfattande utbud av applikationer, inklusive cell-cell interaktioner mellan flera celler18, Drug screening19, och cancerbiologi20. Å andra sidan är enhets strukturen formbar, och strukturen och storleken på fångstplatsen kan ändras och tillämpas på andra områden som mikroorganismer och växtceller. I teorin är vår metod också anpassningsbar för att etablera och spåra mikrobiella Co-kulturer (t. ex. bakterier, jästsvampar, etc.).
Den största begränsningen av detta tillvägagångssätt är att den precisionsnivå som krävs för enhetens tillverkning är hög. Detta beror främst på att flödet motstå den minsta kanalen kan dramatiskt ändras om dess fabricerade dimensioner är något offset. Kontrollera av motstånd av mikrokanaler är avgörande för den högeffektiva Single-cell tillfångatagandet av enheten. Å andra sidan, under cellkulturen, det finns ingen stängning mellan kamrarna. Därför kan parakrin sekretion av celler i kammaren spridas till andra kammare för att påverka andra celler. Slutligen, uppmärksamhet måste ägnas åt städningen av kanalen och slangar under beredningen av anordningen. Odlingsmediet och varje buffert som används i experimentet måste filtreras för att förhindra att partiklar och skräp blockerar kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (105-2628-E-400-001-MY2 nätters), och doktorsexamen program inom vävnadsteknik och regenerativ medicin, National Chung Hsing University och nationella hälso forskningsinstitut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
