Summary
Denne rapporten beskriver en mikrovæskebasert chip-basert metode for å sette opp et enkelt cellekultur eksperiment der høy effektivitet sammenkobling og mikroskopisk analyse av flere enkeltceller kan oppnås.
Abstract
Cell co-kultur analysene har vært mye brukt for å studere celle-celle interaksjoner mellom ulike celletyper for å bedre forstå biologi av sykdommer, inkludert kreft. Det er imidlertid utfordrende å klargjøre den komplekse mekanismen for intercellulære interaksjoner i svært heterogene celle populasjoner ved hjelp av konvensjonelle co-kultur systemer fordi heterogenitet av celle pasientpopulasjonen er skjult av de gjennomsnittlige verdiene; den konvensjonelle co-kultur systemer kan bare brukes til å beskrive befolkningen signalet, men er ute av stand til å spore individuelle celler atferd. Videre har konvensjonelle eksperimentelle metoder lav virkningsgrad i celle manipulering på grunn av Poisson-fordelingen. Microfabricated enheter er en ny teknologi for enkelt celle studier fordi de kan manipulere enkeltceller med høy gjennomstrømming og kan redusere prøve-og reagens forbruket. Her beskriver vi konseptet og anvendelsen av en mikrovæskebasert chip for flere single-Cell co-kulturer. Brikken kan effektivt fange opp flere typer enkeltceller i et kultur kammer (~ 46%) og har en tilstrekkelig kultur plass nyttig å studere cellene atferd (f. eks migrasjon, spredning, etc.) under celle-celle interaksjon på single-cellenivå. Lymfatisk endothelial celler og muntlig plateepitel celle kreft ble brukt til å utføre en enkelt celle co-kultur eksperiment på mikrovæskebasert plattform for Live flere single-celle interaksjonsstudier.
Introduction
Effektiv fangst av ulike typer enkeltceller og gi tilstrekkelig kultur plass er nødvendig for én celle co-kultur eksperimenter av flere typer enkeltceller1. Begrense fortynning er den mest brukte metoden for å forberede enkeltceller for slike eksperimenter, på grunn av den lave kostnaden av utstyr som kreves. På grunn av begrensningen for Poisson-fordelingen er den maksimale sannsynligheten for enkelt celle anskaffelse bare 37%, noe som gjør den eksperimentelle operasjonen arbeidskrevende og tidkrevende2. Hvis du derimot bruker fluorescens aktivert celle sortering (FACS), kan det komme til å overkomme Poisson-fordelingen for å forberede enkeltceller3på en effektiv måte. Imidlertid kan FACS ikke være tilgjengelig for noen laboratorier på grunn av dyre instrumentering og vedlikeholdskostnader. Microfabricated enheter har nylig blitt utviklet for enkelt celle overlapping4, enkelt celle sammenkobling5og enkelt cellekultur applikasjoner. Disse enhetene er fordelaktige basert på deres evne til å manipulere enkeltceller6, utføre eksperimenter med høy gjennomstrømming, eller redusere prøve-og reagens forbruket. Men å utføre enkelt celle co-kultur eksperimenter med flere celletyper med gjeldende mikrovæskebasert enheter er fortsatt utfordrende på grunn av begrensning av Poisson-fordelingen1,7,8eller manglende evne til enhetene for å fange mer enn to typer enkeltceller4,5,6,9,10.
For eksempel Yoon et al. rapporterte en mikrovæskebasert enhet for celle-celle interaksjonsstudie11. Denne enheten bruker sannsynlighetsbasert-metoden til å sammenkoble celler i ett kammer. Det kan imidlertid bare oppnå sammenkobling av to forskjellige celletyper på grunn av geometriske begrensninger i enhets strukturen. En annen rapport fra Lee et al. demonstrerte en deterministisk metode for å fange og sammenkoble enkeltceller12. Denne enheten øker paring effektiviteten ved deterministisk metoden, men det er begrenset av den langvarige operasjonstiden som kreves for å pare celler. Nærmere bestemt kan den andre celle fangst bare utføres etter at den første fanget cellen er festet til overflaten etter 24 h. Zhao et al. rapporterte en dråpe-basert mikrovæskebasert enhet for å fange to typer av en enkelt celle13. Vi kan finne at dråpe BAS ert mikrovæskebasert enheten fortsatt er begrenset til Poisson-fordelingen og kan bare brukes på ikke-tilknyttede celler, og det er ikke mulig å endre kultur løsningen under dyrking prosessen.
Tidligere har vi utviklet en mikrovæskebasert "hydrodynamisk skytteltrafikk chip" som utnytter deterministisk hydrodynamisk styrker til å fange flere typer enkelt celle inn i kultur kammeret og kan deretter utføre celle co-kultur eksperiment for å analysere individuell celle migrasjon atferd under celle-celle interaksjoner14. Den hydrodynamisk skytteltrafikk chip består av en plassert sett av enheter som hver inneholder en Serpentine by-pass kanal, en fangst-området, og et kultur kammer. Ved å bruke forskjellen i strømningsmotstand mellom Serpentine by-pass kanal og kultur kammer, og en spesialdesignet operasjon prosedyre, ulike typer enkeltceller kan gjentatte ganger tatt inn i kultur kammeret. Spesielt, den store plassen i kultur kammeret kan ikke bare hindre at cellen blir spyles under celle fangst ut, men også gi tilstrekkelig plass for cellene til å spre seg, spre og migrere, slik at for å observere av Live enkelt celle interaksjoner. I denne artikkelen fokuserer vi på produksjonen av denne enheten og detaljerte protokoll trinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av en wafer mold av myke Litografi
Merk: maske mønster data er tilgjengelig i forrige publikasjon14.
- Tørke en 4-tommers silisium wafer i en 120 ° c ovnen i 15 min.
- Spin coat 4 g av SU-8 2 negative photoresist på en 4-tommers silisium wafer på 1 000 RPM for 30 s for å skape en 5 μm tykt lag (lag #1).
- Soft bake lag #1 på en 65 ° c kokeplate i 1 min og deretter overføre lag #1 til en 95 ° c kokeplate i 3 minutter.
- Cool lag #1 til romtemperatur, plassere den på innehaveren av semi-automatisk maske aligner, og justere med laget #1 forkrommet photomask (Capture-site lag).
- Utsett lag #1 med 365 NM UV-lys i en dose på 150 mJ/cm2.
- Fjern lag #1 fra aligner og post-bake på en 65 ° c kokeplate i 1 min. Overfør lag #1 til en 95 ° c kokeplate i 1 min.
- Kult lag #1 til romtemperatur. Dypp i en propylenglykol dipropylenglykolmetyleter Eter acetate løsning å vaske bort uncrosslinked photoresist i 2 min. Tørk forsiktig med nitrogen gass for å avdekke et lag #1 justerings merke.
- Dekk laget #1 innretting merke av en selvklebende tape, spin coat 4 g av SU-8 10 negative photoresist på laget #1 på 1 230 RPM for 30 s for å skape en 25 μm tykt lag #2.
- Fjern tapen, myke bake lag #2 på en 65 ° c kokeplate i 3 min, og deretter overføre lag #2 til en 95 ° c kokeplate i 7 min.
- Cool lag #2 til romtemperatur, plassere lag #2 på innehaveren av semi-automatiske masken aligner, og justere laget #2 forkrommet photomask (bypass kanal lag) til laget #1 justering merke.
- Utsett lag #2 med 365 NM UV-lys i en dose på 200 mJ/cm2.
- Fjern lag #2 fra aligner og etter bake stek på en 65 ° c kokeplate i 1 min og Overfør lag #2 til en 95 ° c kokeplate i 3 minutter.
- Cool lag #2 til romtemperatur, og dekker laget #1 justering merket med teip. Spin coat 4 g av SU-8 2050 negative photoresist på lag #2 på 1 630 RPM for 30 s for å lage en 100 μm tykt lag #3.
- Fjern tapen, myke bake lag #3 på en 65 ° c kokeplate i 5 min, og deretter overføre lag #3 til en 95 ° c kokeplate i 20 min.
- Cool lag #3 til romtemperatur, plassere lag #3 på innehaveren av semi-automatiske masken aligner, og justere laget #3 forkrommet photomask (kultur kammer lag) til laget #1 justering merke.
- Utsett lag #3 med 365 NM UV-lys i en dose på 240 mJ/cm2.
- Fjern lag #3 fra aligner og post-bake på en 65 ° c kokeplate i 5 min. Overfør lag #3 til en 95 ° c kokeplate i 10 minutter.
- Kult lag #3 til romtemperatur. Dypp i en propylenglykol dipropylenglykolmetyleter Eter acetate løsning å vasket bort uncrosslinked photoresist i 10 min, og forsiktig tørr med nitrogen gass.
2. PDMS enhet forberedelse for flere enkelt celle fangst
- Plasser wafer mold og veie parabolen som inneholder 100 μL av trichlorosilane i en desikator (kun for silanisering) og Påfør et vakuum (-85 kPa) i 15 min.
Merk: Silanize på wafer-overflaten med trichlorosilane for å skape hydrofobe overflateegenskaper før PDMS castingso at den enkelt kan skrelles av fra wafer PDMS mold. - Stopp vakuumet, og silanize deretter wafer-formen i desikator (kun for silanisering) ved 37 ° c i minst 1 time.
- Bland PDMS base og PDMS herding agent i et forhold på 10:1. Hell totalt 20 g blandet PDMS på wafer mold i en 15 cm parabolen.
- Plasser 15 cm rett i en desikator og påfør vakuum (-85 kPa) i 1,5 min. Fjern deretter 15 cm rett fra desikator. Oppbevares i 20 minutter ved romtemperatur. Til slutt fjerner du rester av luftbobler i PDMS med nitrogen gass.
- Plasser 15 cm rett i en ovn ved 65 ° c for 2-4 h for å kurere PDMS.
- Fjern PDMS kopi fra wafer mold, og deretter punch en 1,5 mm innløp og en 0,5 mm utløp på PDMS med en 1,5 mm indre diameter og en 0,5 mm indre diameter puncher (figur 1C).
- Rengjør PDMS kopi og raset overflaten med flyttbare tape og deretter behandle overflaten med oksygen plasma (100 W for 14 s).
- Juster PDMS-replikaene manuelt med lysbildet, og ta dem med i kontakt med hverandre.
- Plasser PDMS-lysbildet i en 65 ° c-ovn i 1 dag.
Merk: permanent binding mellom lysbildet og PDMS-replikaen oppnås for å danne enheten. - Dypp PDMS-enheten i en beholder fylt med fosfat-bufret saltvann og plasser den i en desikator. Påfør deretter vakuum (-85 kPa) i 15 min for å fjerne luftbobler.
- Plasser PDMS-enheten i en cellekultur hette og sterilisere enheten med UV-lys (lysbølgelengde: 254 NM) i 30 minutter.
- Erstatt PDMS enhets buffer med middels (DMEM-F12 basal medium som inneholder 1% antibiotika og 10% Foster storfe serum) og ruge PDMS enheten ved 4 ° c for 1 dag. Dette hindrer at celler kan følge PDMS overflate.
3. utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon
Merk: celletyper inkluderer humant lymfatisk endothelial celler (LECs), menneskelige OSCC TW 2.6 celler uttrykker WNT5B-spesifikke shRNA (WNT5B sh4) og vektor kontroll (pLKO-GFP) som ble innhentet fra vår forrige studie15. Vennligst referer til vår tidligere utgivelse for detaljerte dyrking trinn.
- Fjern kultur mediet når cellene oppnår 70-80% samløpet. Deretter forsiktig vaske cellene med 5 mL steril PBS tre ganger.
- Tilsett 1 mL DMEM-F12 medium inneholdende 1 μM fluorescerende fargestoff til WNT5B sh4 og pLKO-GFP celler (bruk MV2 medium for LECs) og deretter ruge cellene i 30 min ved romtemperatur.
Merk: LECs ble farget med grønn chloromethylfluorescein diacetate (CMFDA) fargestoff, WNT5B sh4 celler ble farget med blå 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) fargestoff og pLKO-GFP celler ble farget med rød Dil fluorescerende fargestoff. - Vask cellene forsiktig med 5 mL steril PBS tre ganger.
- Fjern PBS og tilsett 2 mL 0,25% Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin-EDTA for LECs).
- Ruge cellene i 4 min ved romtemperatur og deretter forsiktig trykke vevet kultur parabolen å fremme celler avløsning.
- Tilsett 4 mL DMEM-F12 medium for å spre WNT5B sh4 og pLKO-GFP celler (for LECs bruk 3 mL MV2 medium og 1 mL Trypsin Neutralizer løsning). Deretter overføre cellene til en 15 mL tube, og sentrifuger på 300 x g i 3 min.
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL DMEM-F12 medium forsiktig. Telle antall aktive celler i en hemocytometer ved hjelp av standard Trypan blå ekskluderings metode16. Forbered 1 mL celle suspensjon ved 3 x 105 celler/ml konsentrasjon i DMEM-F12 medium, og deretter holde cellene på isen for å hindre celle aggregering.
Merk: for å forbedre enkelt celle fangst effektivitet, er nøye utarbeidelse av enkelt celle suspensjon med godt dissosiert nødvendig.
4. flere enkelt celle fangst og trippel enkelt cellekultur
- Koble en Poly-tetrafluoroethene (PTFE) rør mellom utløpet av enheten og sprøyte pumpen. Fjern mediet og tilsett 1 μL av celle fjæring ved en konsentrasjon på 3 x 105 celler/ml i INNLØPET til PDMS-enheten.
- Legg celle fjæringen i enheten med en sprøyte pumpe ved en strømningshastighet på 0,3 μL/min (figur 2a). Strømningsretningen er fra innløpet til uttaket.
Merk: Legg inn umiddelbart etter at du har lagt celle fjæringen i innløpet for å hindre at celle sedimentering. - Tilsett 1 μL av DMEM-F12-medium i innløpet til PDMS-enheten etter trinn 4.2. Legg DMEM-F12-mediet inn i apparatet med en sprøyte pumpe ved en strømningshastighet på 0,3 μL/min (figur 2B). Strømningsretningen strømmet fra innløpet til uttaket.
- Load 0,3 μL av DMEM-F12-medium inn i enheten med en sprøyte pumpe ved en strømningshastighet på 10 μL/min (figur 2C). Strømningsretningen strømmet fra utløpet til innløpet.
- Gjenta trinn 4,1 til 4,4 for å laste inn andre celletyper i enheten.
- Etter å ha fullført celle fangst, bruke et mikroskop med 4X linse til bilde hver kultur kammer.
Merk: de fluorescens utslippene av cellene ble brukt til å identifisere og telle antall individuelle celler i hvert kultur kammer. - Fjern PTFE-røret og forsegle innløpet og utløpet med polyolefin tape for å skape et lukket kultur system.
- Flytt PDMS enheten til en 10 cm kultur rett og tilsett 10 mL sterilt PBS rundt PDMS enheten for å unngå fordampning av mediet fra enheten.
- Overfør kultur parabolen til en inkubator (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet) for trippel enkelt cellekultur.
- Mikroskopisk observere og fotografere cellevekst hver 12 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enheten har en tre-lags struktur som vist ved tverrsnitt fotografi av et kutt PDMS enhet (figur 1a). Det første laget inneholder en fangst-site (6,0 μm i bredde og 4,6 μm i høyde) som forbinder kultur kammeret og by-pass kanal. Forskjellen i strømningsmotstand mellom kultur kammeret og by-pass-kanalen får cellene til å strømme inn i fangst posisjonen og fylle inngangen til den lille stien. Når en celle er fanget i opptaks posisjonen, økes strømningsmotstanden til den lille banen, noe som fører til at den neste innkommende cellen går mot og gjennom by-pass-kanalen til neste fangst område. Den Serpentine utformingen av by-pass kanalen (25,0 μm i bredde og 26,4 μm i høyde) av det andre laget brukes til å øke sin strømningsmotstand. Dimensjonene av kultur kammeret i det tredje laget (500,3 μm i diameter og 111,3 μm i høyde) er utformet for å gi tilstrekkelig plass for cellekultur eksperiment, og for å redusere strømningshastigheten i kammeret for å holde cellene blir spyles ut av kammeret.
Verktøyene som kreves for drifts prosedyren (figur 2) er vanlig i generelle laboratorier, inkludert mikroskop, sprøyte pumpe, glass sprøyte, sentrifugerør, slange og pipette. Enheten er ca 1/5 av en dekkglass med en 2 mm tykkelse og er egnet for å observere under et mikroskop med 4X til 20x objektiv. Med denne metoden kan en type for enkeltceller fanges i kultur kamrene under 7 min, slik at den totale operasjonstiden for trippel enkeltceller var mindre enn 21 min. Den enkelt celle fangst effektiviteten av de viste tre cellene var 70,83% ± 15,42% (LECs), 73,96% ± 14,09% (WNT5B sh4) og 78,13% ± 3,13% (pLKO-GFP), henholdsvis. Den trippel enkelt celle fangst effektiviteten var 47,92% ± 7,86% (Figur 3B). The reflux operasjonen trinnet brukes til å løslate cellene fra fangst steder samtidig og flyte cellene inn i kulturen kamre (figur 2C). I løpet av denne prosessen, hvis en celle ikke er frigitt fra fangst-området, vil den frigitte cellen ved dens nedstrøms fangst-site ikke gå inn i kultur kammeret på grunn av-pass kanal som har en lavere strømningsmotstand enn kultur kammeret. Dette er den viktigste grunnen til at HSC har en trippel enkelt celle fangst effektiviteten av bare 47,92 ± 7,86%, som fortsatt er betydelig større enn sannsynligheten for en Poisson-fordelingen (~ 5%).
Celle kulturen resultatene viste at flere single-celle co-kulturer av lymfatisk endothelial celler og plateepitelkreft celler kan utføres for 24 h, og cellenes spredning og morfologi kan observeres under mikroskop (Figur 4, Supplerende videoer 1-3). I nærvær av pLKO-GFP celler, WNT5B sh4 celler og LECs viste bedre proliferativ kapasitet og viste at morfologi nærmet lamellipodia. Disse resultatene viser evnen til denne enheten til å effektivt fange flere typer enkeltceller i et kultur kammer og gi en tilstrekkelig kultur plass nyttig for å studere flere enkelt celle type interaksjoner.
Figur 1: Foto og mikroskop bilder av hydrodynamisk skytteltrafikk chip. (A) mikroskop bilde av PDMS Seksjons visning. (B) en enkelt celle overlapping enhet av forstørret visning. (C) utseendet på brikken som inneholder 48 enheter. Scale bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: hydrodynamisk skytteltrafikk chip drift prosedyre. (A) på grunn av den høye hydrodynamisk motstanden av by-pass kanal, en enkelt celle er fanget i fangst-området. (B) etter at den første cellen er fanget og har okkludert fangst-området, følgende celler flyte mot by-pass kanal på grunn av økt strømningsmotstand. Bruk medium for å vaske de resterende cellene i kanalen. (C) reflux cellen i kultur kammeret. Scale bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: enkelt celle fangst effektivitet av LECs, WNT5B sh4 og pLKO-GFP i hydrodynamisk skytteltrafikk chip. (A) mikroskop bilde av fanget trippel enkeltceller i kultur kammer. (B) de grønne, blå og røde linjene representerer fangst effektiviteten til enkeltceller, henholdsvis, og de gule stolpene representerer fangst effektiviteten til trippel enkelt celle. Scale bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenkoblet enkelt celle co-kultur og trippel enkelt celle co-kultur i hydrodynamisk skytteltrafikk chip for 24 h. (A) mikroskop bilde av trippel enkeltceller co-kultur for 0, 12 og 24 h. (B) mikroskop bilde av PLKO-GFP og WNT5B sh4 celler co-kultur for 0, 12 og 24 h. LECs ble farget med grønne CMFDA Dye, WNT5B sh4 celler ble farget med blå CMAC Dye og pLKO-GFP celler ble farget med røde DiI fluorescerende fargestoff. Scale bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs video 1: celle innlasting. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggs video 2: Cell Refluxing. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Supplerende video 3: andre celle type reflux i kultur kammeret. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intercellulære interaksjoner av ulike celler i tumor mikromiljøet spille en viktig rolle i progresjon av svulsten17. For å forstå mekanismen av celle-celle interaksjoner, co-kultur systemer brukes som en felles analytisk metode. Imidlertid har flere celletyper og heterogenitet av cellene selv ført til eksperimentell kompleksitet og analytiske vanskeligheter.
Den hydrodynamisk skytteltrafikk-brikken tillater flere enkelt celle lasting i kultur kammeret med en deterministisk metode, uten å være begrenset av Poisson-fordelingen i fortynnings metoden og den mikrotiterplateleser plattformen. Ved å gi en høy trippel enkelt celle fangst effektivitet (større enn 45%, er Poisson-fordelingen metoden 5%) og viser at i kultur kammeret, er plass tilstrekkelig for cellevekst og spredning (Figur 4). På grunn av sin evne til å effektivt utføre flere enkelt celle opptak og levende cellekultur observasjoner med enkelt oppsett og protokoll, ser vi for oss disse mikrovæskebasert enhetene som nyttige verktøy for et omfattende utvalg av applikasjoner, inkludert celle-celle interaksjoner mellom flere celler18, Drug screening19, og kreft biologi20. På den annen side, enheten strukturen er formbar, og strukturen og størrelsen på fangst-området kan endres og brukes på andre felt som mikroorganismer og planteceller. I teorien er vår metode også tilpasningsdyktig til å etablere og spore mikrobielle co-kulturer (f. eks, bakterier, gjær, etc.).
Den viktigste begrensningen av denne tilnærmingen er at presisjonsnivået som kreves for at enheten fabrikasjon er høy. Dette er hovedsakelig fordi flyten motstå den minste kanalen kan bli dramatisk forandret hvis dens fabrikkert dimensjoner er litt forskjøvet. Kontroll av motstander av microchannels er avgjørende for høy effektivitet enkelt celle fangst av enheten. På den annen side, under cellekultur, er det ingen nedleggelse mellom kamrene. Derfor kan paracrine sekresjon av celler i kammeret spres inn i andre kamre for å påvirke andre celler. Til slutt må oppmerksomheten rettes mot renslighet av kanalen og slangen under utarbeidelsen av enheten. Kultur mediet og eventuell buffer som brukes i eksperimentet, må filtreres for å hindre at partikler og rusk blokkerer kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra departementet for vitenskap og teknologi (105-2628-E-400-001-MY2), og Ph.D. program i vev engineering og regenererende medisin, National Chung Hsing University og National Health Research Institutes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
