Summary
Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.
Abstract
I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l'eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l'applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l'interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.
Introduction
L'acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole1. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l'operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo2. Al contrario, l'utilizzo dello smistamento delle celle attivate a fluorescenza (FACS) può superare la limitazione della distribuzione di Poisson per preparare in modo elevato le singole celle3. Tuttavia, FACS potrebbe non essere accessibile ad alcuni laboratori a causa di costosi costi di strumentazione e manutenzione. I dispositivi microfabbricati sono stati recentemente sviluppati per l'intrappolamento a cella singoladi 4, l'abbinamento a cella singola5e le applicazioni di coltura a cella singola. Questi dispositivi sono vantaggiosi in base alla loro capacità di manipolare con precisione singole celle6, eseguire esperimenti ad alto rendimento o ridurre il consumo di campioni e reagenti. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti di cocoltura a cella singola con più tipi di cellule con gli attuali dispositivi microfluidici è ancora difficile a causa della limitazione della distribuzione di Poisson1,7,8, o l'incapacità di i dispositivi per catturare più di due tipi di celle singole4,5,6,9,10.
Per esempio, Yoon et al. ha segnalato un dispositivo microfluidico per lo studio di interazione cellulare-cellula11. Questo dispositivo utilizza il metodo probabilistico per accoppiare le celle in una camera. Tuttavia, può ottenere solo l'associazione di due diversi tipi di cella a causa di restrizioni geometriche nella struttura del dispositivo. Un altro rapporto di Lee et al. ha dimostrato un metodo deterministico per catturare e accoppiare singole celle12. Questo dispositivo aumenta l'efficienza di accoppiamento con il metodo deterministico, ma è limitato dal tempo di funzionamento prolungato richiesto per accoppiare le celle. In particolare, l'acquisizione della seconda cella può essere eseguita solo dopo che la prima cella catturata è stata attaccata alla superficie dopo che24 h. Possiamo riscontrare che il dispositivo microfluidico a base di gocciolamento è ancora limitato alla distribuzione di Poisson e può essere utilizzato solo su cellule non collegate, e non è possibile modificare la soluzione di coltura durante il processo di coltivazione.
In precedenza, abbiamo sviluppato un "chip di chiusura idrodinamico" microfluidico che utilizza forze idrodinamiche deterministiche per catturare più tipi di cellule singole nella camera di coltura e successivamente può eseguire esperimenti di cocoltura cellulare per analizzare comportamento di migrazione delle singole cellule nelle interazioni cellula-cellula14. Il chip di chiusura idrodinamico comprende un array di unità che contengono ciascuno un canale di passaggio serpentino, un sito di cattura e una camera di coltura. Utilizzando la differenza di resistenza al flusso tra il canale di passaggio serpentino e la camera di coltura, e una procedura operativa appositamente progettata, diversi tipi di singole cellule possono essere ripetutamente catturati nella camera di coltura. In particolare, l'ampio spazio della camera di coltura può non solo impedire che la cellula venga arrossata durante la cattura delle cellule, ma anche fornire spazio sufficiente per le cellule per diffondersi, proliferare e migrare, consentendo l'osservazione di interazioni vive a singola cellula. In questo articolo, ci concentriamo sulla produzione di questo dispositivo e passaggi di protocollo dettagliati.
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Protocol
1. Fabbricazione di uno stampo di wafer mediante litografia morbida
NOTA: i dati del modello maschera sono disponibili nella pubblicazione precedente14.
- Disidratare un wafer di silicio da 4 pollici in un forno a 120 gradi per 15 min.
- Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2 fotoresist negativo su un wafer di silicio da 4 pollici a 1.000 giri/m per 30 s per creare uno strato di 5 m di spessore (strato #1).
- Cuocere lo strato morbido #1 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e poi trasferire lo strato #1 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.
- Strato freddo #1 a temperatura ambiente, posizionarlo sul supporto dell'allineatore maschera semi-automatico e allineare con il livello #1 fotomaschera cromata (strato di sito di cattura).
- Esponi lo strato #1 con una luce UV a 365 nm a una dose di 150 mJ/cm2.
- Togliere lo strato #1 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min #1.
- Strato fresco #1 a temperatura ambiente. Immergere in una soluzione di eteato monomeil del glicole propilene per lavare via il fotoresist non collegato per 2 min #1.
- Coprire lo strato #1 segno di allineamento con un nastro adesivo, ruotare il cappotto 4 g di SU-8 10 fotoresist negativo sullo strato #1 a 1.230 giri per 30 s per creare uno strato di 25 m di spessore #2.
- Togliere il nastro, strato di cuocere morbido #2 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 3 min, quindi trasferire lo strato #2 a una piastra calda di 95 gradi per 7 min.
- Strato freddo #2 alla temperatura ambiente, posizionate il livello #2 sul supporto dell'allineatore semiautomatico della maschera e allineate il livello #2 fotomaschera placcata in cromo (strato di canale di bypass) al livello #1 segno di allineamento.
- Esponi lo strato #2 con una luce UV a 365 nm a una dose di 200 mJ/cm2.
- Togliere lo strato #2 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e trasferire lo strato #2 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.
- Strato fresco #2 a temperatura ambiente e coprire lo strato #1 segno di allineamento con nastro adesivo. Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2050 fotoresist negativo su #2 a 1.630 rpm per 30 s per creare uno strato di 100 m di spessore #3.
- Togliere il nastro, strato di cuocere morbido #3 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 5 min, quindi trasferire lo strato #3 a una piastra calda di 95 gradi per 20 min.
- Strato freddo #3 alla temperatura ambiente, posizionate il livello #3 sul supporto dell'allineatore semiautomatico della maschera e allineate il livello #3 fotomaschera placcata in cromo (strato della camera di coltura) al livello #1 segno di allineamento.
- Esporre i #3 di strati con luce UV a 365 nm a una dose di 240 mJ/cm2.
- Togliere lo strato #3 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 5 min #3.
- Strato fresco #3 a temperatura ambiente. Immergere in una soluzione di eteato monomeil di glicole propilene per lavare via il fotoresist non collegato per 10 minuti e asciugare delicatamente con gas di azoto.
2. Preparazione del dispositivo PDMS per l'acquisizione di più celle
- Mettere lo stampo del wafer e la teglia contenente 100 -L di triclorosilalla in un desiccatore (solo per insilanizzazione) e applicare un vuoto (-85 kPa) per 15 min.
NOTA: Silanizzare la superficie del wafer con trichlorosilane per creare proprietà di superficie idrofobiche prima della colata PDMS in modo che possa essere staccata senza sforzo dallo stampo wafer PDMS. - Fermare il vuoto, quindi insidiare lo stampo del wafer nel desiccatore (solo per la silanizzazione) a 37 gradi centigradi per almeno 1 h.
- Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerità PDMS in un rapporto di 10:1. Versare un totale di 20 g di PDMS mista sullo stampo del wafer in un piatto di 15 cm.
- Mettere il piatto di 15 cm in un desiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 1,5 min. Quindi rimuovere il piatto di 15 cm dal desiccatore. Conservare per 20 min a temperatura ambiente. Infine, rimuovere le bolle d'aria residue nel PDMS con gas di azoto.
- Mettere il piatto di 15 cm in forno a 65 gradi centigradi per 2-4 h per curare la PDMS.
- Rimuovere la replica PDMS dallo stampo del wafer, quindi eseguire un'uscita da 1,5 mm e una presa di 0,5 mm sul PDMS utilizzando un diametro interno di 1,5 mm e un perforatore di diametro interno di 0,5 mm (Figura 1C).
- Pulire la replica PDMS e la superficie di scorrimento con nastro rimovibile e quindi trattare la superficie con plasma di ossigeno (100 W per 14 s).
- Allineare manualmente le repliche PDMS con la diapositiva e metterle in contatto tra loro.
- Mettere la vetritta PDMS in un forno a 65 gradi centigradi per 1 giorno.
NOTA: L'incollaggio permanente tra la diapositiva e la replica PDMS si ottiene per formare il dispositivo. - Immergere il dispositivo PDMS in un contenitore pieno di fosfato tampone salina e metterlo in un desiccatore. Quindi applicare il vuoto (-85 kPa) per 15 min per rimuovere le bolle d'aria.
- Posizionare il dispositivo PDMS in una cappa di coltura cellulare e sterilizzare il dispositivo con luce UV (lunghezza d'onda luminosa: 254 nm) per 30 min.
- Sostituire il buffer del dispositivo PDMS con un supporto medio (supporto basale DMEM-F12 contenente 1% di antibiotici e 10% siero bovino fetale) e incubare il dispositivo PDMS a 4 gradi centigradi per 1 giorno. Ciò impedisce alle cellule di aderire alla superficie PDMS.
3. Preparazione di una sospensione a cella singola
NOTA: I tipi di cellule cellulari includono cellule endotiliali linfatiche umane (LEC), cellule OSCC TW2.6 umane che esprimono shRNA specifico wnT5B (WNT5B sh4) e controllo vettoriale (pLKO-GFP) che sono state ottenute dal nostro studio precedente15. Si prega di fare riferimento alla nostra pubblicazione precedente per le fasi di coltivazione dettagliate.
- Rimuovere il mezzo di coltura quando le cellule raggiungono 70-80% confluenza. Quindi lavare delicatamente le cellule con 5 mL di PBS sterile tre volte.
- Aggiungere 1 mL di mezzo DMEM-F12 contenente 1 colorante fluorescente in celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP (utilizzare il mezzo MV2 per i LEC) e quindi incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: le cellule leC sono state macchiate con colorana diaceta cloromemetilofluoresceina verde (CMFDA), le cellule sh4 WNT5B sono state macchiate con colorante fluorescente blu 7-amino-4-chloromethylcouin (CMAC) e cellule pLKO-GFP sono state macchiate con colorante fluorescente Dil rosso. - Lavare delicatamente le celle con 5 mL di PBS sterile tre volte.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA per LEC).
- Incubare le cellule per 4 min a temperatura ambiente e quindi toccare delicatamente il piatto di coltura del tessuto per promuovere il distacco delle cellule.
- Aggiungere 4 mL di cellule medie DMEM-F12 per disperdere le celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP (per i LEC utilizzare 3 mL di MV2 medio e 1 mL di soluzione di ritorizzante). Quindi trasferire le cellule in un tubo da 15 mL, e centrifugare a 300 x g per 3 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di Mezzo DMEM-F12. Contare il numero di celle vive in un emocitometro utilizzando il metodo di esclusione Trypan Blue standard16. Preparare 1 mL di sospensione cellulare a 3 x 105 celle/mL di concentrazione nel mezzo DMEM-F12, quindi mantenere le celle sul ghiaccio per impedire l'aggregazione delle cellule.
NOTA: Per migliorare l'efficienza di acquisizione a una singola cella, è necessaria un'attenta preparazione della sospensione a cella singola con una sospensione ben dissociata.
4. Cattura multipla a cella singola e tripla coltura a cella singola
- Collegare un tubo poli-tetrafluoroethene (PTFE) tra la presa del dispositivo e la pompa della siringa. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 lofde di sospensione cellulare ad una concentrazione di 3 x 105 celle/mL nell'ingresso del dispositivo PDMS.
- Caricare la sospensione cellulare nel dispositivo con una pompa di siringa ad una velocità di flusso di 0,3 l/min (Figura 2A). La direzione del flusso va dall'ingresso alla presa.
NOTA: Caricare immediatamente dopo aver aggiunto la sospensione cellulare nell'ingresso per evitare la sedimentazione cellulare. - Aggiungete 1 -L di Mezzo DMEM-F12 nell'ingresso del dispositivo PDMS dopo il passaggio 4.2.Caricare il supporto DMEM-F12 nel dispositivo con una pompa di siringa a una velocità di flusso di 0,3 l/min (Figura 2B). La direzione del flusso scorreva dall'ingresso alla presa.
- Caricare 0,3 L di DMEM-F12 medio nel dispositivo da una pompa di siringa ad una velocità di flusso di 10 L/min (Figura 2C). La direzione di flusso scorreva dalla presa all'ingresso.
- Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.4 per caricare altri tipi di cella nel dispositivo.
- Dopo aver completato la cattura cellulare, utilizzare un microscopio con lente 4x per visualizzare ogni camera di coltura.
NOTA: Le emissioni di fluorescenza delle cellule sono state utilizzate per identificare e contare il numero di singole cellule in ogni camera di coltura. - Rimuovere il tubo PTFE e sigillare l'uscita e la presa con nastro adesivo per creare un sistema di coltura chiuso.
- Spostare il dispositivo PDMS in un piatto di coltura di 10 cm e aggiungere 10 mL di PBS sterile intorno al dispositivo PDMS per evitare l'evaporazione del mezzo dal dispositivo.
- Trasferire il piatto di coltura in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% di CO2 e 95% di umidità) per una coltura a tripla cellula.
- Osservare e fotografare la crescita delle cellule ogni 12 ore.
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Representative Results
Il dispositivo ha una struttura a tre strati come mostrato dalla fotografia trasversale di un dispositivo PDMS tagliato (Figura 1A). Il primo strato contiene un sito di cattura (6,0 m di larghezza e 4,6 m di altezza) che collega la camera di coltura e il canale di passaggio. La differenza di resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale by-pass fa sì che le cellule scorra nella posizione di cattura e riempiono l'ingresso del piccolo percorso. Dopo che una cella viene catturata nella posizione di acquisizione, la resistenza al flusso del piccolo percorso viene aumentata, causando la successiva cella in ingresso per andare verso e attraverso il canale by-pass al successivo sito di cattura a valle. Per aumentare la resistenza al flusso viene utilizzato il design serpentino del canale di passaggio (25,0 m di larghezza e 26,4 m di altezza) del secondo strato. Le dimensioni della camera di coltura nel terzo strato (500,3 m di diametro e 111,3 m di altezza) sono progettate per fornire spazio sufficiente per l'esperimento di coltura cellulare e per ridurre la portata nella camera per evitare che le cellule vengano scaricate dalla camera.
Gli strumenti necessari per la procedura operativa (Figura 2) sono comuni nei laboratori generali, tra cui microscopio, pompa di siringa, siringa di vetro, tubo centrifuga, tubi e pipetta. Il dispositivo è di circa 1/5 di un coverslip con uno spessore di 2 mm ed è adatto per l'osservazione al microscopio con lente da 4x a 20x. Con questo metodo, un tipo per le singole celle può essere acquisito nelle camere di coltura sotto i 7 min, quindi il tempo totale di funzionamento per le singole celle era inferiore a 21 min. L'efficienza di acquisizione a singola cella delle tre celle dimostrate è stata del 70,83% - 15,42% (LEC), 73,96% x 14,09% (WNT5B sh4) e 78,13% - 3,13% (pLKO-GFP), rispettivamente. L'efficienza di acquisizione a tripla cella è stata del 47,92% - 7,86%(Figura 3B). Il passaggio dell'operazione di reflusso viene utilizzato per rilasciare le celle dai siti di acquisizione contemporaneamente e far scorrere le celle nelle camere dicoltura( Figura 2C). Durante questo processo, se una cella non viene rilasciata dal suo sito di cattura, la cella rilasciata nel suo sito di cattura a valle non entrerà nella camera di coltura a causa del canale by-pass che ha una resistenza al flusso inferiore rispetto alla camera di coltura. Questo è il motivo principale per cui l'HSC ha una tripla efficienza di cattura a cella singola di solo 47,92 x 7,86%, che è ancora significativamente maggiore della probabilità di una distribuzione di Poisson (5%).
I risultati della coltura cellulare hanno mostrato che più cocolture unicellulari di cellule endoteliche linfoche e cellule tumorali squamose possono essere eseguite per 24 h, e la proliferazione e la morfologia delle cellule possono essere osservate al microscopio (Figura 4, Video supplementari 1-3). In presenza di cellule pLKO-GFP, le cellule sh4 e i LEC WNT5B hanno mostrato una migliore capacità proliferale e hanno dimostrato che la morfologia si avvicinava alla lamellipodia. Questi risultati dimostrano la capacità di questo dispositivo di acquisire in modo efficiente più efficienti più tipi di singole celle in una camera di coltura e forniscono uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare più interazioni con tipo di cella singola.
Figura 1: Fotografia e microscopio Immagini di chip di chiusura idrodinamico. (A) Immagine del microscopio della vista sezionale PDMS. (B) Un'unità di trapping a cella singola di vista ingrandita. (C) Aspetto del chip contenente 48 unità. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: procedura di funzionamento del chip di chiusura idrodinamica. (A) A causa dell'elevata resistenza idrodinamica del canale di by-pass, una singola cella è intrappolata nel sito di cattura. (B) Dopo che la prima cellula è intrappolata e ha occluso il sito di cattura, le seguenti cellule scorrono verso il canale di passaggio a causa dell'aumento della resistenza al flusso. Utilizzare il mezzo per lavare le cellule rimanenti nel canale. (C) Reflusso della cella in camera di coltura. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Efficienza di acquisizione a cella singola di LEC, SHT5B sh4 e pLKO-GFP nel chip di chiusura idrodinamico. (A) Immagine al microscopio di tre celle singole catturate nella camera di coltura. (B) Le barre verdi, blu e rosse rappresentano rispettivamente l'efficienza di acquisizione delle singole celle e le barre gialle rappresentano l'efficienza di acquisizione della tripla cella singola. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cocoltura a cella singola accoppiata e co-coltura a tripla cellula nel chip di chiusura idrodinamico per 24 h. (A) Immagine al microscopio della cocoltura a celle singole triple per 0, 12 e 24 h. (B) Immagine al microscopio della co-coltura delle cellule pLKO-GFP e WNT5B sh4 per 0, 12 e 24 h. I LEC sono stati macchiati con macchie CMFDA verdi, le cellule WNT5B sh4 sono state macchiate con cMAC Dye blu e Le cellule pLKO-GFP sono state macchiate di colorante fluorescente di DiI rosso. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Caricamento cellulare. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Video supplementare 2: Reflusso cellulare. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Video supplementare 3: Reflusso di secondo tipo di cellula nella camera di coltura. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore17. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l'eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.
Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di più celle singole nella camera di coltura con un metodo deterministico, senza essere limitato dalla limitazione di distribuzione di Poisson nel metodo di diluizione e nella piattaforma di microwell. Fornendo un'elevata efficienza di acquisizione a tripla cella singola (superiore al 45%, il metodo di distribuzione di Poisson è 5%) e dimostrando che nella camera di coltura, lo spazio è sufficiente per la crescita e la proliferazione cellulare (Figura 4). Grazie alla sua capacità di eseguire in modo efficiente più acquisizioni a cella singola e osservazioni di coltura di cellule vive con semplice configurazione e protocollo, immaginiamo questi dispositivi microfluidici come strumenti utili per una vasta gamma di applicazioni, tra cui cellule cellulari interazioni tra più cellule18, screening farmacologico19e biologia del cancro20. D'altra parte, la struttura del dispositivo è modellabile e la struttura e le dimensioni del sito di cattura possono essere modificate e applicate ad altri campi come microrganismi e cellule vegetali. In teoria, il nostro metodo è anche adattabile per stabilire e monitorare le co-culture microbiche (ad esempio, batteri, lieviti, ecc.).
La limitazione principale di questo approccio è che il livello di precisione richiesto per la fabbricazione del dispositivo è elevato. Ciò è dovuto principalmente al fatto che la resistenza al flusso del canale più piccolo può essere drasticamente modificata se le sue dimensioni fabbricate sono leggermente sfalsate. Il controllo delle resistenze dei microcanali è fondamentale per la cattura unicellulare ad alta efficienza del dispositivo. D'altra parte, durante la coltura cellulare, non c'è chiusura tra le camere. Pertanto, la secrezione paracrina delle cellule nella camera può diffondersi in altre camere per influenzare altre cellule. Infine, l'attenzione deve essere prestata alla pulizia del canale e tubi durante la preparazione del dispositivo. Il mezzo di coltura e qualsiasi buffer utilizzato nell'esperimento devono essere filtrati per evitare che particelle e detriti blocchino il canale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Scienza e della Tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e dal Ph.D. Program in Ingegneria dei Tessuti e Medicina Rigenerativa, dalla National Chung Hsing University e dagli Istituti nazionali di ricerca sulla salute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
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