Summary
Ce modèle animal permet aux chercheurs d'induire un lymphœdème secondaire statistiquement significatif dans le membre postérieur des souris, d'une durée d'au moins 8 semaines. Le modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie du lymphœdème et pour étudier de nouvelles options de traitement.
Abstract
Les modèles animaux sont d'une importance primordiale dans la recherche sur le lymphœdème afin de comprendre la physiopathologie de la maladie, mais aussi d'explorer les options de traitement potentielles. Ce modèle de souris permet aux chercheurs d'induire un lymphœdème significatif d'une durée d'au moins 8 semaines. Le lymphœdème est induit à l'aide d'une combinaison de radiothérapie fractionnée et d'ablation chirurgicale des lymphatiques. Ce modèle exige que les souris reçoivent une dose de 10 rayonnements gris (Gy) avant et après la chirurgie. La partie chirurgicale du modèle implique la ligature de trois vaisseaux lymphatiques et l'extraction de deux ganglions lymphatiques de l'arrière-pays de la souris. Avoir accès à des outils microchirurgicaux et un microscope est essentiel, en raison des petites structures anatomiques des souris. L'avantage de ce modèle est qu'il se traduit par un lymphœdème statistiquement significatif, qui fournit une bonne base pour évaluer différentes options de traitement. C'est également une option grande et facilement disponible pour la formation microchirurgicale. La limitation de ce modèle est que la procédure peut prendre du temps, surtout si elle n'est pas pratiquée à l'avance. Le modèle donne lieu à un lymphœdème quantifiable objectif chez la souris, sans causer de morbidité sévère et a été testé dans trois projets distincts.
Introduction
Le lymphœdème est caractérisé par une accumulation de liquide lymphatique qui conduit à un gonflement des tissus localisés, qui se produit principalement en raison d'une altération ou perturbé le flux lymphatique dans les vaisseaux lymphatiques1. Le flux lymphatique peut être altéré ou perturbé par une infection, une obstruction, une blessure ou des malformations congénitales dans le système lymphatique2. Ces étiologies ont comme conséquence l'accumulation du fluide lymphatique, qui mène à un état chronique d'inflammation, ayant pour résultat la fibrose suivante, aussi bien que le dépôt du tissu adipeux3. Le lymphœdème peut être classé comme lymphoedème primaire ou secondaire. Le lymphœdème primaire est causé par des anomalies du développement ou une mutation génétique2,4. Le lymphœdème secondaire se produit en raison d'une maladie systémique sous-jacente, d'une chirurgie oud'untraumatisme2,4. Le lymphœdème secondaire est la forme la plus commune de lymphœdème dans le monde2. Dans les pays développés, la cause la plus fréquente de lymphœdème secondaire est la thérapie oncologique comme la radiothérapie adjuvante et la dissection des ganglions lymphatiques5. Le lymphœdème est plus fréquent chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, mais peut également se développer chez les patients atteints de cancer gynécologique, mélanome, génito-urinaire ou cervical6. Il a été suggéré que de toutes les femmes diagnostiquées avec le cancer du sein, 21% développeront le lymphœdème7.
Le lymphœdème peut être stressant pour le patient à la fois physiquement et psychologiquement. Les patients atteints de lymphœdème ont un risque accru d'infection5,8,9, mauvaise qualité de vie et peut développer une anxiété sociale et des symptômes de dépression10. Les complications du lymphœdème chronique conduisent au coût élevé des soins et à une charge accrue de la maladie9,11. Les résultats ont également suggéré que le lymphœdème pourrait être associé à un risque accru de décès après le traitement du cancer du sein12. La gestion conservatrice telle que la compression de la zone affectée, le drainage lymphatique manuel et les soins de la peau généraux demeurent l'approche de première ligne. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif6. Bien que des progrès aient été réalisés dans le domaine de la thérapie chirurgicale et médicale, il y a encore place à l'amélioration. Plus de recherche, fournissant la perspicacité dans la pathophysiologie et la progression de la maladie, est nécessaire pour permettre aux cliniciens de fournir de meilleures options de traitement pour les patients5.
Des modèles animaux sont utilisés dans la recherche préclinique pour comprendre la physiopathologie des maladies et développer des options de traitement potentielles. Plusieurs modèles animaux de lymphœdème différents ont été établis chez les canines13,14, lapins15, moutons16, porcs17,18 et les rongeurs19,20, 21,22,23,24. Le modèle de rongeur semble être le modèle le plus rentable, lors de l'étude de la reconstruction de la fonction lymphatique, en raison des rongeurs étant facilement accessibles et relativement peu coûteux25. La majorité des modèles de souris se sont concentrés sur induire le lymphœdème dans la queue des souris21,22,23. Le modèle de queue est très fiable mais la technique chirurgicale exacte pour induire le lymphœdème varie considérablement dans le matériel publié précédemment. Ceci a comme conséquence des fluctuations dans la durée et la robustesse du lymphœdème développé présenté dans la litière connue25. Différentes techniques sont également utilisées pour induire le lymphœdème dans le modèle de l'arrière-pays et elles donnent également des résultats variables, mais le modèle de membre postérieur pourrait être plus facile à comprendre d'un point de vue translationnel. Les modèles précédents de lymphœdème ont été entravés par la résolution spontanée de lymphœdème et donc un modèle reproductible et permanent de lymphœdème est nécessaire25. Les chercheurs ont déjà essayé d'augmenter la dose de rayonnement, pour empêcher la résolution spontanée de lymphœdème, mais ceci a souvent mené à la morbidité grave suivante25.
Ce modèle a comme conséquence le lymphœdème statistiquement significatif, sans causer la morbidité grave, en combinant la microchirurgie avec la radiothérapie. Le modèle a été révisé à partir d'un modèle chirurgical précédent en ajoutant une dose d'irradiation qui induit le lymphœdème, sans causer de morbidité sévère26. Il offre également une excellente occasion pour la formation en microchirurgie. L'accès à l'équipement microchirurgical et au microscope est nécessaire, en raison des petites structures anatomiques des souris. L'intervention chirurgicale peut être effectuée lorsque l'utilisateur a appris des techniques microchirurgicales de base, telles que la suture avec des instruments microchirurgicaux. Les opérateurs qui ont effectué cette procédure ont tous regardé des vidéos didacticiels d'Acland sur les conditions préalables des compétences microchirurgicales (1981) et de la technique de base de la microsuture (1985). Nous recommandons de pratiquer l'intervention chirurgicale 8 à 10 fois avant de l'utiliser dans la recherche. La pratique de la procédure garantit que moins d'erreurs sont commises et que la procédure peut être effectuée plus efficacement. Une fois maîtrisée, l'intervention chirurgicale peut être effectuée en 45 minutes.
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Protocol
Les animaux étaient hébergés dans l'établissement de soins aux animaux de l'Université du Danemark méridional, conformément aux lignes directrices de l'établissement. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l'Inspection des expériences animales, ministère de l'Environnement et de l'Alimentation du Danemark.
1. Irradiation pré-chirurgicale
REMARQUE : L'irradiation préchirurgicale a lieu 7 jours avant la chirurgie.
- Induire l'anesthésie.
- Placez la souris dans une boîte à induction et placez le vaporisateur à 3 % d'isoflurane avec un débit d'oxygène de 0,8 à 1,2 L/min pour induire l'anesthésie par inhalation.
REMARQUE : Alternativement, les anesthésiques injectables peuvent être employés mais pour la courte durée de l'anesthésie inhalante induisant l'irradiation était suffisant. Pour obtenir les résultats présentés dans cet article, des souris c57BL6 femelles de 9 semaines ont été employées. - Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée par le test de pincement de la queue ou de la patte.
- Placez la souris dans une boîte à induction et placez le vaporisateur à 3 % d'isoflurane avec un débit d'oxygène de 0,8 à 1,2 L/min pour induire l'anesthésie par inhalation.
- Placez la souris pour l'irradiation.
- S'il est entièrement sous sédatif, déplacez la souris de la boîte d'induction et placez-la sous la source de rayonnement en position de supine et fixez doucement les membres postérieurs avec du ruban adhésif.
REMARQUE : La souris restera sous sédation pendant la courte durée du rayonnement. - Placez un coussin de plomb de 1,5 mm d'épaisseur pour s'assurer que seule la zone qui subit une intervention chirurgicale (c.-à-d. la zone circulaire d'un diamètre de 25 mm autour du genou) est irradiée.
- S'il est entièrement sous sédatif, déplacez la souris de la boîte d'induction et placez-la sous la source de rayonnement en position de supine et fixez doucement les membres postérieurs avec du ruban adhésif.
- Administrer une dose de 10 rayonnementgy à un taux de dose de 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
CAUTION : Des précautions de sécurité doivent être prises lorsque vous travaillez avec des radiations. Au cours de cette expérience, toute l'irradiation a été effectuée dans une pièce isolée par rayonnement, et la source de rayonnement n'a été activée que lorsque tout le personnel est parti et scellé la pièce. - Placez la souris dans sa cage.
2. Configuration de l'équipement
REMARQUE : La chirurgie doit être effectuée dans une pièce dédiée aux interventions chirurgicales. La surface opératoire doit être stérile.
- Nettoyez soigneusement toutes les surfaces opératoires avec 70% d'éthanol. Portez un filet à cheveux et une combinaison. Utilisez des instruments chirurgicaux stériles et des gants stériles.
- Préparer l'anesthésie.
- Rédiger 1 ml de fentanyl (0,315 mg/ml), 1 ml de midazolam (5 mg/ml) et 2 ml d'eau stérile. Utilisez différentes seringues et aiguilles pour les différents composants.
- Mélanger le fentanyl et l'eau stérile en vidant lentement les seringues dans un tube de verre stérile. Lorsqu'il est mélangé, ajouter du midazolam pour compléter la solution de travail.
- Préparer l'analgésie.
- Rédiger 0,2 ml de buprénorphine (0,3 mg/ml) et 2 ml de salin.
- Mélanger les volumes en vidant lentement les seringues dans un tube de verre stérile pour compléter la solution de travail.
- Allumez le microscope et assurez-vous que l'éclairage est suffisant, et que le microscope est bien ajusté pour les yeux de l'opérateur.
REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées au microscope opératoire. Une plage de grossissement de 4x à 25x est suffisante.
3. Préparation
- Peser la souris pré-chirurgie en plaçant la souris dans un récipient vide sur une balance dégagée.
- Administrer l'anesthésique.
- Rédiger 0,1 ml d'anesthésique pour 10 g de poids corporel de souris. Injecter l'anesthésique sous-cutanée sous forme d'injection de bolus.
- Laissez la souris reposer dans une cage avec beaucoup de literie et d'abri pendant environ 10 min jusqu'à ce qu'elle soit entièrement sous sédatif. Examiner la profondeur anesthésique en évaluant la relaxation musculaire et effectuer le test de pincement des pattes ou de la queue.
- Lorsqu'il est entièrement sous sédatif, raser le membre postérieur choisi pour la procédure à l'aide de tondeuses électriques. Assurez-vous d'essuyer l'excès de cheveux.
- Allumez le dispositif de chauffage, comme un coussin chauffant et recouvrez-le d'un chiffon chirurgical.
- Fixez le flux d'oxygène à 0,8 L/min et connectez-le avec un cône de nez. Utilisez 100% d'oxygène.
REMARQUE: Le cône nasal est uniquement pour la livraison d'oxygène et non l'anesthésie. - Appliquer l'onmonténégrmonmique et injecter 0,5 mL de saline sous-cutanée, de préférence dans les éraflures de la souris, pour prévenir l'hypovolémie pendant la chirurgie.
- Placez la souris pour la chirurgie.
- Placez la souris sur le tissu chirurgical en position de supine. Placer le cône de nez sur le museau.
- Fixer doucement l'extrémité des membres postérieurs avec du ruban adhésif pour empêcher la souris de se déplacer pendant la chirurgie.
- Stériliser la peau à l'aide d'alcool/chlorhexidine ou d'iode d'alcool/povidone.
4. Chirurgie
REMARQUE : Dans cet exemple, le membre arrière gauche (lorsque la souris est vue en position de supine) a été choisi pour la procédure.
- Faire une incision circulaire.
- Soulevez la peau avec des forceps lisses et clip une petite ouverture d'environ 5 mm proximale à la fossa popliteal.
- Glissez des ciseaux pointus dans l'ouverture et clip vers le genou de sorte que l'incision se termine juste au-dessus du genou. Assurez-vous de ne pas percer les vaisseaux sous-jacents en soulevant la peau avec des forceps pendant la coupure.
- Déplacez la souris en position couchée et continuez à couper du genou vers la fossa popliteal jusqu'à ce que l'incision circonférence soit terminée.
- Disséquer la peau sous le genou.
- Disséquer doucement la zone sous le genou à quelques millimètres au-dessus de la cheville, en ouvrant lentement et en fermant les microscissors tout en soulevant la peau avec des forceps.
- Couper soigneusement les adhérences visibles restantes à l'aide de microcise. Utilisez saline stérile régulièrement pour garder le tissu humide pendant toute la procédure.
- Disséquer la peau au bord proximal de l'incision circonférence afin qu'elle puisse être rétractée avec un rétracteur élastique.
REMARQUE : Le rétracteur permet à l'opérateur une meilleure vue du vaisseau lymphatique proximal et empêche la jante proximale de se déplacer pendant la chirurgie. - Bien qu'il soit encore en position couchée, faites pivoter doucement l'arrière et fixez-le avec du ruban adhésif, de sorte que la veine ischiatique soit visible du point le plus proximal de la zone exposée au point le plus distal.
- Injecter environ 0,01 ml de brevet Bleu V sous-cutané entre le deuxième et le troisième orteil à l'aide d'une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 30 G. Appuyez doucement sur la patte une couple de fois pour distribuer le brevet Bleu V. Visualisez les vaisseaux lymphatiques et les ganglions lymphatiques à travers le microscope pendant que le brevet Bleu V remplit les vaisseaux lymphatiques.
REMARQUE : Si la couleur bleue des vaisseaux lymphatiques s'estompe au cours de la procédure, massez doucement la patte pour favoriser l'utilisation, plutôt que d'injecter plus de brevet Bleu V. L'utilisation excessive du brevet Blue V peut mener à la fuite et à la coloration du tissu entourant les vaisseaux lymphatiques qui peuvent compromettre la procédure. - Localiser les structures importantes: le ganglion lymphatique popliteal (PLN), les deux vaisseaux lymphatiques distal au ganglion lymphatique (DLV1 et DLV2), et le seul vaisseau lymphatique proximal au ganglion lymphatique (PLV).
REMARQUE : Tous les vaisseaux lymphatiques peuvent être trouvés à côté de la veine ischiatique. Le vaisseau lymphatique proximal est habituellement trouvé médial à la veine, les deux vaisseaux lymphatiques distal sont trouvés médial et latéral à la veine. Les abréviations des structures sont utilisées dans la vidéo d'accompagnement. - Magnifiez pour visualiser clairement le PLV et le ligate avec une suture en nylon 10-0 utilisant le support de micro-aiguille et les microforceps. Appuyez sur la patte une couple de fois pour s'assurer qu'aucun brevet Bleu V passe proximal à la suture.
REMARQUE : Il peut être nécessaire de couper la graisse entourant le vaisseau lymphatique. - Répétez l'étape 4.7 pour liguer les deux vaisseaux lymphatiques distal. Appuyez plusieurs fois sur la patte pour s'assurer qu'aucun brevet Bleu V ne passe proximal à la ligature. Si les vaisseaux lymphatiques se trouvent à proximité de la veine ischiatique, essayez de disséquer encore plus disder.
REMARQUE: Dans cet exemple, on peut voir que l'un des vaisseaux lymphatiques éclate en raison de la ligature entraver le flux lymphatique. Les vaisseaux lymphatiques se fendront souvent de la veine plus bas. - Enlever le ganglion lymphatique popliteal.
- Localisez le ganglion lymphatique popliteal et clip un petit trou avec des microscissors pour y accéder et retirez-le avec des microforceps et des microscissors.
REMARQUE : Le ganglion lymphatique a une surface douce de perle-comme en contraste avec le tissu adipeux environnant. - Pour vérifier si le tissu enlevé est un ganglion lymphatique, placez-le dans un tube à essai rempli d'eau.
REMARQUE : Si le tissu est composé de graisse, le tissu flottera. Si le tissu est un ganglion lymphatique, il coulera au fond.
- Localisez le ganglion lymphatique popliteal et clip un petit trou avec des microscissors pour y accéder et retirez-le avec des microforceps et des microscissors.
- Enlever le tampon de graisse inguinal et le ganglion lymphatique.
- Avant d'enlever le coussinet de graisse inguinal, utilisez un coagulateur bipolaire pour cautériser les vaisseaux qui traversent la graisse.
- Reséquez le tampon de graisse inguinal à l'aide de microforceps et de microscissors. Couper doucement les vaisseaux cautérisés qui traversent la graisse. Puis reséquez doucement le tissu adipeux dans la zone inguinale.
REMARQUE: Le ganglion lymphatique situé dans la graisse est rarement coloré par Patent Blue V et peut être difficile à différencier de la graisse. L'élimination du tampon adipeux en une seule pièce est la meilleure façon de s'assurer que le ganglion lymphatique a été enlevé.
- Rincer soigneusement la jambe avec saline stérile et confirmer au microscope que les petits poils et particules ont été complètement retirés de la zone chirurgicale pour éviter la contamination des plaies et l'infection. Assurez-vous qu'il n'y a pas de saignement actif.
- Suturer les bords de la peau vers le bas à la facia musculaire avec une suture en nylon 6-0 à l'aide de forceps et porte-aiguilles, laissant un espace de 2 à 3 mm pour limiter le flux lymphatique superficiel.
REMARQUE : La vidéo d'accompagnement montre un exemple de sutures finies. - Administrer l'analgésie. Rédiger 0,1 ml d'analgésie par 30 g de poids corporel de souris. Injecter l'analgésie sous-cutanée comme une injection de bolus.
- Peser la souris pour la post-chirurgie pour la comparaison.
- Placer la souris dans une cage dans une armoire chauffée pour la récupération.
5. Soins postopératoires
- Donnez aux souris des cages individuelles pour récupérer après la chirurgie avec de l'eau et de la nourriture ad libitum.
- Administrer une dose sous-cutanée bolus de 0,02 ml de buprénorphine 3x par jour pendant 3 jours pour l'analgésie.
- Surveillez l'animal tous les jours pour la cicatrisation appropriée des plaies, les signes de douleur et d'infection. Si des signes d'infection sont présents, utilisez de l'onguent antibiotique.
6. Irradiation post-chirurgicale
- Trois jours après la chirurgie, répétez la procédure d'irradiation pré-chirurgicale (étapes 1.1-1.4).
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Representative Results
Cette procédure a déjà été utilisée dans trois expériences distinctes. Toutes les expériences ont été faites par différents chercheurs principaux qui sont tous co-auteurs de cet article. Dans les trois expériences, un grand soin a été pris pour adhérer à la même procédure que décrite dans ce protocole. Dans chacun des trois expériences, le lymphœdème secondaire a été induit dans un membre postérieur tandis que l'autre membre postérieur a servi de contrôle. Les volumes des membres postérieurs ont été le résultat principal dans les trois expériences. La figure 1 illustre la conception de l'étude.
Toutes les souris ont subi des balayages de tomographie micro-calculée (CTC) dans les semaines suivant la chirurgie pour mesurer le volume des membres postérieurs. Les balayages de CT ont été exécutés sur un scanner préclinique de multimodalité (tableau des matériaux) et le volume des membres postérieurs a été mesuré par l'intermédiaire de la fonction de région d'intérêt (ROI) dans le logiciel associé comme précédemment décrit26. L'articulation tibiofibulaire distale a été localisée dans les images axonales tridimensionnelles (3D) utilisant une méthode précédemment décrite27. Le roi-ci a commencé à l'articulation tibiofibular distale et a inclus tous les tissus distal à ce point. La plage Hounsfield pour l'analyse a été fixée à -500 à 4000.
Toutes les données ont été analysées à l'aide d'un logiciel statistique (Tableau des matériaux). Le test de comparaison multiple de Sidak a été employé pour comparer le volume du membre postérieur induit de lymphœdème, avec le membre postérieur de contrôle. Une différence significative entre le membre postérieur de contrôle et le membre postérieur de lymphœdème est définie comme une valeur de P lt;0.05.
Figure 1 : Conception de l'étude et des points de temps pour les mesures des résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L'expérience 126 a inclus 32 souris distribuées en groupes de quatre. L'un des objectifs était d'étudier plusieurs doses différentes de rayonnement et de trouver la dose la plus préférable, pour induire un lymphœdème durable sans causer de morbidité sévère. Le groupe qui a reçu deux doses de 10 irradiation de Gy a inclus quatre souris. La figure 2 montre qu'un état cohérent de lymphœdème a été réalisé dans toutes les 8 semaines. Le tableau 1 montre qu'il y avait une différence significative de volume entre le lymphœdème postérieur et le membre postérieur témoin dans les semaines 1, 7 et 8. Tandis qu'un état cohérent de lymphœdème induit a été réalisé, il n'y avait pas une différence statistiquement significative entre les membres postérieurs pendant toutes les 8 semaines. Ce résultat diffère des deux autres expériences et pourrait être expliqué en raison de la taille relativement plus petite de l'échantillon de quatre souris. L'augmentation du nombre de mesures augmenterait la puissance de l'étude et par la présente la probabilité de détecter une différence si une différence existe28.
Figure 2 : Volume moyen des membres postérieurs : Expérience 1. Les mesures de 4 souris du groupe qui a reçu deux doses de 10 irradiation gy sont incluses dans ce chiffre. Ce graphique montre les volumes moyens de membre postérieur en mm3 dans les 8 semaines suivant la chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les barres d'erreur représentent l'écart type (SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| semaine | Volume de lymphœdème en mm3 (n 4) | Volume de commande en mm3 (n 4) | Valeur P | 95% Intervalle de confiance |
| 1 | 218,53 euros 9,3 | 136,78 à 2,48 | 0.002 | de 53,77 à 109,73 |
| 2 | 202,25 à 10,24 | 141,88 à 8,02 | 0.066 | (-6,53) 127,28 |
| 3 | 193,28 à 10,80 | 141,20 à 6,80 | 0.060 | (-3,7) à 107,85 |
| 4 | 194,95 à 21,05 | 141,50 à 8,03 | 0.224 | (-41,85) 148,75 |
| 5 | 193,75 à 7,07 | 141,70 à 8,60 | 0.051 | (-0,27) à 104,37 |
| 6 | 193,23 à 3,42 | 141,78 à 10,29 | 0.054 | (-1,56) à 104,46 |
| 7 | 194,95 à 7,26 | 143,23 à 8,90 | 0.050 | 0,17 à 103,28 |
| 8 | 195,8 à 9,65 | 152,18 à 5,81 | 0.009 | 19,88 à 67,38 |
Tableau 1 : Test de comparaisons multiples de Sidak : Expérience 1. Ce tableau montre la comparaison statistique entre les volumes moyens des membres postérieurs induits de lymphœdème et des membres postérieurs de contrôle pendant les 8 semaines après chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les valeurs sont présentées comme : moyenne et SD en mm3. La valeur P 'lt; 0.05 est considérée comme une différence significative entre le membre postérieur de contrôle et le membre postérieur de lymphœdème. n (nombre d'observations) 4.
L'expérience 2 a inclus 45 souris. 15 souris ont servi de contrôles et ont reçu des injections salines. Les contrôles sont utilisés comme résultats représentatifs car nous supposons que les injections salines n'ont eu aucun effet sur le volume du lymphœdème induit. La figure 3 montre que le lymphœdème était moins stable que lors de l'expérience 1. En outre, le volume des membres postérieurs de contrôle a augmenté pendant les 8 semaines. Cela diminue la différence relative présentée dans le tableau 2. Il a été spéculé que les souris utilisent leur postérieur non-opéré plus, dans les semaines suivant la chirurgie, et que ceci mène à l'hypertrophie et à l'augmentation du volume de membre du membre postérieur non opéré. Plus important encore, le tableau 3 montre qu'il existe une différence statistiquement significative entre le lymphœdème et le membre postérieur témoin pendant les 8 semaines suivant la chirurgie. Le nombre plus élevé de souris prouve que cette procédure peut induire un lymphœdème statistiquement significatif pendant au moins 8 semaines.
Figure 3 : Volume moyen des membres postérieurs : Expérience 2. Les mesures de 15 souris du groupe témoin sont incluses dans ce chiffre. Ce graphique montre les volumes moyens de membre postérieur en mm3 dans les 8 semaines suivant la chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les barres d'erreur représentent SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
| Expérience 1 | Expérience 2 | Expérience 3 | Expérience 1, 2 et 3 combinées | |||||
| semaine | Différence absolue (mm3) | Différence relative (%) | Différence absolue (mm3) | Différence relative (%) | Différence absolue (mm3) | Différence relative (%) | Différence absolue (mm3) | Différence relative (%) |
| 1 | 81,75 à 7,20 | 0,60 à 0,04 | 104,34 à 25,96 | 0,76 à 0,23 | 85,20 à 35,05 | 0,64 à 0,27 | 94,02 à 29,57 | 0,69 à 0,24 |
| 2 | 60,38 à 17,21 | 0,43 à 0,14 | 107,12 à 44,33 | 0,79 à 0,33 | 85,63 à 37,94 | 0,63 à 0,29 | 92,77 à 41,68 | 0,68 à 0,31 |
| 3 | 52,08 à 14,35 | 0,37 à 0,11 | 78,77 à 39,45 | 0,57 à 0,28 | 74,67 à 49,57 | 0,54 à 0,38 | 73,74 à 41,51 | 0,53 à 0,31 |
| 4 | 53,45 à 24,51 | 0,38 à 0,19 | 50,67 à 29,94 | 0,36 à 0,21 | 50,62 à 16,35 | 0,37 à 0,11 | 51,01 à 24,03 | 0,37 à 0,17 |
| 5 | 52,05 à 13,46 | 0,37 à 0,11 | 32,74 à 24,66 | 0,22 à 0,17 | 42,67 à 11,81 | 0,31 à 0,07 | 39,08 à 20,02 | 0,27 à 0,14 |
| 6 | 51,45 à 13,63 | 0,36 à 0,11 | 26,80 à 22,35 | 0,18 à 0,14 | 32,86 à 10,90 | 0,22 à 0,08 | 32,32 à 18,96 | 0,21 à 0,13 |
| 7 | 51,73 à 13,26 | 0,36 à 0,11 | 19,04 à 17,22 | 0,12 à 0,11 | - | - | 25,92 à 21,15 | 0,17 à 0,15 |
| 8 | 43,63 à 6,11 | 0,29 à 0,04 | 15,15 à 11,70 | 0,10 à 0,08 | - | - | 21,15 à 15,96 | 0,14 à 0,10 |
Tableau 2 : Différence absolue et relative. Ce tableau montre la différence absolue de volume entre le lymphœdème et les membres postérieurs témoins - SD en mm3 et la différence relative - SD en pour cent.
| semaine | Volume de lymphœdème en mm3 (n - 15) | Volume de commande en mm3 (n 15) |
Valeur P | 95% Intervalle de confiance |
| 1 | 241,82 à 35,69 | 137,48 à 21,54 | lt;0,001 | 82,21 à 126,47 |
| 2 | 242,41 à 45,13 | 135,29 à 5,81 | lt;0,001 | 69,33 à 144,89 |
| 3 | 216,85 à 41,47 | 138,08 à 5,31 | lt;0,001 | 45.15 à 112.39 |
| 4 | 193,10 à 31,27 | 142,43 à 5,29 | lt;0,001 | 25.15 à 76.18 |
| 5 | 180,03 à 26,03 | 147,29 à 6,45 | 0.002 | de 11,72 à 53,76 |
| 6 | 179,89 à 25,00 | 153,09 à 6,56 | 0.004 | 7,74 à 45,85 |
| 7 | 176,45 à 19,77 | 157,41 à 7,49 | 0.008 | 4,35 à 33,71 |
| 8 | 166,97 à 11,8 | 151,82 à 10,07 | 0.002 | 5,18 à 25,12 |
Tableau 3 : Test de comparaisons multiples de Sidak : Expérience 2. Ce tableau montre la comparaison statistique entre les volumes moyens des membres postérieurs induits de lymphœdème et des membres postérieurs de contrôle dans les 8 semaines après chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les valeurs sont présentées comme : moyenne et SD en mm3. La valeur P 'lt; 0.05 est considérée comme une différence significative entre le membre postérieur de contrôle et le membre postérieur de lymphœdème. n (nombre d'observations) 15.
L'expérience 3 a inclus 36 souris. 12 souris ont servi de contrôles et ont reçu des injections salines. Les contrôles sont utilisés comme résultat représentatif car nous supposons que les injections salines n'ont eu aucun effet sur le volume du lymphœdème induit. Dans cette expérience, le volume des membres postérieurs des souris a été mesuré pendant 6 semaines au lieu de 8. L'expérience n'a duré que 6 semaines en raison de difficultés logistiques lorsque l'expérience a été effectuée. La figure 4 montre un lymphœdème plus constant que l'expérience 2. Le tableau 4 montre qu'il y a un lymphœdème statistiquement significatif dans les 6 semaines qui suivent la chirurgie.
Figure 4 : Volume moyen des membres postérieurs : Expérience 3. Les mesures de 12 souris du groupe témoin sont incluses dans ce chiffre. Ce graphique montre les volumes moyens de membre postérieur en mm3 dans les 6 semaines suivant la chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les barres d'erreur représentent SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
| semaine | Volume de lymphœdème en mm3 (n ' 12) | Volume de commande en mm3 (n '12) | Valeur P | 95% Intervalle de confiance |
| 1 | 219,06 à 35,00 | 133,86 à 10,02 | lt;0,001 | 51,66 à 118,74 |
| 2 | 220,90 à 36,98 | 135,27 à 5,89 | lt;0,001 | 49,33 à 121,94 |
| 3 | 211,74 à 47,30 | 137,07 à 7,56 | 0.002 | 27.24 à 122.11 |
| 4 | 186,09 à 20,36 | 135,47 à 5,70 | lt;0,001 | 34,98 à 66,27 |
| 5 | 182,35 à 18,25 | 139,68 à 7,45 | lt;0,001 | 31,37 à 53,98 |
| 6 | 183,44 à 12,11 | 150,58 à 8,37 | lt;0,001 | 22,42 à 43,29 |
Tableau 4 : Test de comparaisons multiples de Sidak : Expérience 3. Ce tableau montre la comparaison statistique entre les volumes moyens des membres postérieurs induits de lymphœdème et des membres postérieurs de contrôle dans les 6 semaines après chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les valeurs sont présentées comme : moyenne et SD en mm3. La valeur P 'lt; 0.05 est considérée comme une différence significative entre le membre postérieur de contrôle et le membre postérieur de lymphœdème. n (nombre d'observations) 12.
La figure 5 et le tableau 5 montrent le volume moyen des trois expériences combinées. Le tableau 5 montre que l'utilisation de cette procédure entraîne un lymphœdème statistiquement significatif d'une durée d'au moins 8 semaines. Les données des 6 premières semaines, sont les mesures combinées de 31 souris des expériences 1, 2 et 3. Au cours de la semaine 7 à 8, nous n'avions que des données provenant d'expériences 1 et 2, ce qui nous a permis de mesurer ensemble 19 souris.
Figure 5 : Volume moyen combiné des membres postérieurs : Expérience 1, 2 et 3. Trente et une souris incluses dans les 6 premières semaines après la chirurgie et 19 souris incluses dans les 2 semaines suivantes. Ce graphique montre les volumes moyens de membre postérieur en mm3 dans les 8 semaines suivant la chirurgie. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les barres d'erreur représentent SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
| semaine | Volume de lymphœdème en mm3 (Semaine 1-6 n 31) (Semaine 7 à 8 n ' 19) |
Volume de commande en mm3 (Semaine 1-6 n ' 31) (Semaine 7 à 8 n ' 19) |
Valeur P | 95% Intervalle de confiance |
| 1 | 230,00 à 34,46 | 135,99 à 16,03 | lt;0,001 | 78,19 à 109,84 |
| 2 | 228,90 à 40,91 | 136,13 à 6,32 | lt;0,001 | 70.47 à 115.07 |
| 3 | 211,83 à 41,15 | 138,09 à 6,36 | lt;0,001 | 51,53 à 95,95 |
| 4 | 190,63 à 25,81 | 139,62 à 6,54 | lt;0,001 | 38,15 à 63,87 |
| 5 | 182,70 à 21,52 | 143,62 à 7,79 | lt;0,001 | 28,36 à 49,79 |
| 6 | 182,98 à 19,11 | 150,66 à 8,36 | lt;0,001 | 22,18 à 42,47 |
| 7 | 180,34 à 19,31 | 154,43 à 9,60 | lt;0,001 | 11.61 à 40.22 |
| 8 | 173,04 à 16,42 | 151,89 à 9,19 | lt;0,001 | de 10,35 à 31,94 |
Tableau 5 : Test de comparaisons multiples de Sidak : Expérience 1, 2 et 3 combinées. Ce tableau montre la comparaison statistique entre les volumes moyens des membres postérieurs induits du lymphœdème et les membres postérieurs témoins de 31 souris dans les 6 premières semaines après la chirurgie et de 19 souris dans les 2 semaines suivantes. Toutes les souris ont reçu une dose de 10 Gy irradiation pré- et post-chirurgie. Les valeurs sont présentées comme : moyenne et SD en mm3. La valeur P 'lt; 0.05 est considérée comme une différence significative entre le membre postérieur de contrôle et le membre postérieur de lymphœdème. n (nombre d'observations) 31.
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Discussion
Il y a quelques étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, il est important que les chercheurs prennent des précautions de sécurité lorsqu'ils travaillent avec la radioactivité. Deuxièmement, pendant la partie chirurgicale de ce protocole, il est important de commencer la procédure une fois que la souris a été anesthésié et le terminer sans pauses inutiles. Ceci est important pour éviter une période chirurgicale excessivement longue pour l'animal et pour éviter que l'anesthésie perde l'effet pendant la chirurgie. Il est recommandé d'administrer seulement une injection de bolus d'anesthésique et de compléter l'intervention chirurgicale en une seule séance. C'est aussi une étape critique, de ne pas administrer trop de brevet Bleu V, comme l'excès de brevet Bleu V va décolorer le tissu entourant les vaisseaux lymphatiques. Si le tissu environnant est décoloré, il peut être presque impossible de visualiser les vaisseaux lymphatiques et cela compromet la procédure. Même si l'on parvient à visualiser les vaisseaux lymphatiques, le tissu décoloré rendra difficile d'évaluer si le brevet Bleu V passe proximal à la ligature ou non. Ceci est problématique parce que l'opérateur doit s'assurer que les ligatures placées resserrent le flux lymphatique, pour s'assurer que la procédure sera réussie. Il est également important de laisser un espace de 2 à 3 mm lors de la fermeture de la plaie. Comme un écart temporaire de la peau est souvent nécessaire pour imiter le processus de guérison des plaies humaines29.
Les limites de cette méthode sont qu'il s'agit d'une procédure longue qui nécessite l'accès à un microscope et une formation microchirurgicale précédente. Lors de l'exécution de la partie chirurgicale de ce protocole, il est important de planifier le temps entre les procédures chirurgicales. Beaucoup de temps passe à attendre que l'animal soit anesthésié, à raser l'arrière-pays et à se préparer généralement pour chaque intervention chirurgicale. Par conséquent, il est recommandé de préparer le logement et l'anesthésie à l'avance. Il est important de noter que pour être certain que le lymphœdème chronique a été induit, l'histopathologie doit être analysée. Nous n'avons pas inclus l'histopathologie dans cet article, qui est une limitation. Sans histopathologie soutenant le fait que des changements histologiques sont arrivés aux vaisseaux lymphatiques les changements dans le volume dans les membres postérieurs peuvent seulement être décrits comme oedème. L'article qui inclut toutes les données sur les quatre souris de l'expérience 126 inclut l'histopathologie et montre qu'il y avait des changements significatifs à l'histopathologie utilisant cette technique. L'article inclut également l'imagerie lymphatique. La même procédure a été employée sur les souris dans l'expérience 2 et 3, mais l'histopathologie n'a montré aucune différence significative entre le membre postérieur de lymphœdème et le hindlimb témoin dans ces expériences. D'autres études comprenant l'histopathologie sont nécessaires pour que ce modèle clarifie si le lymphœdème est induit au niveau histologique. Les expériences 2 et 3 n'ont pas encore été publiées et nous ne pouvons donc pas nous y référer.
Bien que l'utilisation de scans cT pour mesurer le volume des membres postérieurs puisse être plus objective que l'utilisation de la méthode de déplacement de l'eau ou des mesures circonférences, elle a encore ses limites. La technique de mesure est coûteuse, prend beaucoup de temps et nécessite l'accès à un scanner et à un logiciel d'analyse.
Un des plus grands défis avec les modèles de lymphœdème de rongeur en général, ont été la résolution spontanée de lymphœdème, à moins que le rayonnement excessif ait été exécuté25. Lors du développement de ce modèle, nous avons testé plusieurs doses différentes de rayonnement pour trouver une dose qui induirait un lymphœdème durable sans causer de morbidité sévère26. Auparavant, les modèles de lymphœdème n'ont pas été normalisés dans les méthodes d'induction de lymphœdème ou d'évaluations de résultats. Oashi et coll.20 ont utilisé une seule dose de 30 irradiations gy, et ligait chaque vaisseau lymphatique à trois points distincts. Dans cette étude, l'intervention chirurgicale a pris 90 min pour effectuer. Bien que la méthode présentée dans cet article puisse être considérée comme longue, la partie chirurgicale de la procédure peut encore être exécutée environ deux fois plus vite que la méthode présentée par Oashi et autres20. Ils ont également eu une période de suivi de 6 mois, qui est considérablement plus longue que n'importe laquelle des études présentées dans cet article. Cependant, ils n'ont inclus qu'une souris et ils ont mesuré manuellement la circonférence des membres pour évaluer l'enflure, alors que les volumes présentés dans cet article ont été mesurés sur 31 souris à l'aide de scans cT et de logiciels d'analyse 3D. Komatsu et coll.30 ont enlevé les ganglions lymphatiques inguinaux et les vaisseaux lymphatiques périphériques associés et le tissu adipeux à l'aide d'un couteau électrique. L'utilisation d'un couteau électrique pourrait être une approche plus simple qui ne nécessite pas de formation microchirurgicale, mais l'œdème induit résolu après le jour 4 tandis que la méthode présentée dans cet article offre un lymphœdème cohérent d'une durée d'au moins 8 semaines.
Nous espérons que ce protocole permettra aux chercheurs d'examiner les limites et les avantages du modèle révisé du lymphœdème. Le protocole devrait également aider les chercheurs à reproduire avec succès le modèle. La méthode peut être utilisée dans de futures études observationnelles et interventionnelles pour comprendre la pathophysiologie du lymphœdème et de nouvelles options de traitement de recherche. Dans les études futures, il serait également intéressant d'avoir un suivi de plus de 8 semaines pour observer combien de temps le lymphœdème induit dure. Il serait également intéressant d'observer l'effet d'effectuer une irradiation plus ciblée des souris avant et après la chirurgie. Cela pourrait être fait en effectuant une tomodensitome et en planifiant un volume cible. Dans de futures études, ce modèle pourrait également être soutenu par des études d'imagerie lymphatique guidée par la fluorescence, la pétrométrie ou la bioimpédance. Cette méthode offre un lymphœdème statistiquement significatif d'une durée d'au moins 8 semaines, qui a été mesuré directement par cT volumétrique dans trois expériences distinctes par différents chercheurs principaux.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Peter Bollen, chef du Laboratoire biomédical, d'avoir prêté l'équipement nécessaire pour enregistrer les images vues à travers les microscopes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
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