Summary
Denne dyre modellen gjør det mulig for forskere å indusere statistisk signifikant sekundær lymfødem i hindlimb bentap av mus, som varer i minst 8 uker. Modellen kan brukes til å studere patofysiologi av lymfødem og å undersøke romanen behandlingstilbud.
Abstract
Animal modeller er av største betydning i forskningen av lymfødem for å forstå patofysiologi av sykdommen, men også å utforske potensielle behandlingstilbud. Denne muse modellen gjør det mulig for forskere å indusere betydelig lymfødem som varer i minst 8 uker. Lymfødem er indusert ved hjelp av en kombinasjon av fraksjoneres strålebehandling og kirurgisk ablasjon av lymphatics. Denne modellen krever at musene får en dose på 10 Gray (gy) stråling før og etter operasjonen. Den kirurgiske delen av modellen innebærer ligation av tre lymfe fartøy og utvinning av to lymfeknuter fra musen hindlimb bentap. Å ha tilgang til mikrokirurgisk verktøy og et mikroskop er viktig, på grunn av de små anatomiske strukturer av mus. Fordelen med denne modellen er at det resulterer i statistisk signifikant lymfødem, som gir et godt grunnlag for å vurdere ulike behandlingstilbud. Det er også et flott og lett tilgjengelig alternativ for mikrokirurgisk trening. Begrensningen av denne modellen er at prosedyren kan være tidkrevende, spesielt hvis ikke praktisert på forhånd. Modellen resulterer i objektivt målbare lymfødem i mus, uten å forårsake alvorlig sykelighet og har blitt testet i tre separate prosjekter.
Introduction
Lymfødem er preget av en opphopning av lymfe væske som fører til lokaliserte vev hevelse, som i hovedsak oppstår på grunn av nedsatt eller forstyrret flyt av lymfe væske i lymfesystemet fartøy1. Lymfe strømmen kan svekkes eller forstyrret av infeksjon, obstruksjon, skade eller medfødt defekter i lymfesystemet2. Disse årsaker resultere i opphopning av lymfatisk væske, noe som fører til en kronisk tilstand av betennelse, noe som resulterer i påfølgende fibrose, samt deponering av fettvev3. Lymfødem kan kategoriseres som primær eller sekundær lymfødem. Primær lymfødem er forårsaket av utviklingsmessige unormalt eller genetisk mutasjon2,4. Sekundær lymfødem oppstår på grunn av underliggende systemisk sykdom, kirurgi eller traumer2,4. Sekundær lymfødem er den vanligste formen for lymfødem i verden2. I utviklede land, den vanligste årsaken til sekundær lymfødem er onkologiske terapi som adjuvant strålebehandling og lymfe node disseksjon5. Lymfødem er hyppigste blant brystkreftpasienter, men kan også utvikles hos pasienter med Gynecologic, melanom, urin eller nakke kreft6. Det har blitt antydet at av alle kvinner diagnostisert med brystkreft, vil 21% utvikle lymfødem7.
Lymfødem kan være stressende for pasienten både fysisk og psykologisk. Pasienter med lymfødem har en økt risiko for infeksjon5,8,9, dårlig livskvalitet og kan utvikle sosial angst og symptomer på depresjon10. Komplikasjoner av kronisk lymfødem føre til høye kostnader for omsorg og en økt sykdoms byrde9,11. Funnene har også antydet at lymfødem kan være assosiert med økt risiko for død etter brystkreftbehandling12. Konservativ ledelse som kompresjon av det berørte området, manuell lymfe drenering og generell hudpleie forblir den første linjen tilnærming. Det er for øyeblikket ingen helbredende behandling6. Selv om fremgangen har blitt gjort innen kirurgisk og medisinsk behandling, er det fortsatt rom for forbedring. Mer forskning, som gir innsikt i patofysiologi og progresjon av sykdommen, er nødvendig for at klinikere skal kunne gi bedre behandlingsalternativer for pasientene5.
Animal modeller brukes i prekliniske forskning for å forstå patofysiologi av sykdommer og utvikle potensielle behandlingstilbud. Adskillige annerledes lymfødem dyr modeller ha blitt etablerte inne hjørnetenner13,14, kanin15, sau16, pigs17,18 og gnagere19,20, 21,22,23,24. Den gnager modellen synes å være den mest kostnadseffektive modellen, når gransker gjenoppbyggingen av lymfatisk funksjon, på grunn av gnagere blir lett tilgjengelig og relativt lavt priset25. De fleste av musene modellene har fokusert på inducing lymfødem i halen av mus21,22,23. Halen modellen er svært pålitelig, men den eksakte kirurgiske teknikken for inducing lymfødem varierer betydelig i tidligere publisert materiale. Dette resulterer i svingninger i varighet og robusthet av de utviklede lymfødem presentert i kjente litteratur25. Ulike teknikker blir også brukt for inducing lymfødem i hindlimb bentap modellen og de gir også varierende resultater, men hindlimb bentap modellen kan være lettere å forstå fra et translational perspektiv. Tidligere lymfødem modeller har blitt hemmet av spontan lymfødem oppløsning og derfor en reproduserbar og permanent lymfødem modell er nødvendig25. Forskere har tidligere forsøkt å øke dosen av stråling, for å hindre spontan lymfødem oppløsning, men dette har ofte ført til påfølgende alvorlig sykelighet25.
Denne modellen resulterer i statistisk signifikant lymfødem, uten å forårsake alvorlig sykelighet, ved å kombinere mikrokirurgi med stråling. Modellen har blitt revidert fra en tidligere kirurgisk modell ved å legge en dose av bestråling som induserer lymfødem, uten å forårsake alvorlig sykelighet26. Den likeledes tilbyder en stor opportunity for mikrokirurgisk lærer opp. Å ha tilgang til mikrokirurgisk utstyr og et mikroskop er nødvendig, på grunn av de små anatomiske strukturer av mus. Den kirurgiske prosedyren kan utføres når brukeren har lært grunnleggende mikrokirurgisk teknikker, for eksempel suturing med mikrokirurgisk instrumenter. Operatørene som utførte denne prosedyren alle så tutorial videoer av Acland på forutsetningene for mikrokirurgisk ferdigheter (1981) og grunnleggende microsuture teknikk (1985). Vi anbefaler at du praktiserer den kirurgiske prosedyren 8 − 10 ganger før du bruker den i forskning. Praktisere prosedyren sikrer at færre feil er gjort og at prosedyren kan utføres mer effektivt. Når mestret, kan den kirurgiske prosedyren utføres i 45 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene var huset inne det universitet av Sør Danmark dyr bekymre Letter ifølge institusjonell retningslinjene. Alle prosedyrer som involverer dyr har blitt godkjent av The Animal eksperimenter Datatilsynet, Miljøverndepartementet og mat av Danmark.
1. pre-kirurgi bestråling
Merk: pre-kirurgi bestråling finner sted 7 dager før operasjonen.
- Indusere anestesi.
- Plasser musen i en induksjon boks og sette fordamper til 3% isoflurane med en oksygen strømningshastighet på 0,8 − 1.2 L/min for å indusere innånding anestesi.
Merk: Alternativt kan injiserbare anestesi brukes, men for den korte varigheten av bestråling inducing innånding anestesi var tilstrekkelig. For å få resultatene som presenteres i denne artikkelen, 9-ukers gamle kvinnelige C57BL6 mus ble brukt. - Kontroller at musen er fullt anesthetized av halen eller pote knipe test.
- Plasser musen i en induksjon boks og sette fordamper til 3% isoflurane med en oksygen strømningshastighet på 0,8 − 1.2 L/min for å indusere innånding anestesi.
- Plasser musen for bestråling.
- Hvis det er fullt bedøvet, beveg musen fra induksjon boksen og plasser den under kilden til stråling i liggende posisjon og forsiktig fixate bakbena med tape.
Merk: musen vil forbli bedøvet for den korte varigheten av strålingen. - Plasser en 1,5 mm tykk bly pute for å sikre at bare det området som gjennomgår kirurgi (dvs. det sirkulære området med en diameter på 25 mm rundt kneet) blir bestrålt.
- Hvis det er fullt bedøvet, beveg musen fra induksjon boksen og plasser den under kilden til stråling i liggende posisjon og forsiktig fixate bakbena med tape.
- Administrer en dose på 10 gy stråling med en dose rate på 5,11 gy/min (100 kVp, 10 mA).
FORSIKTIG: sikkerhetsforanstaltninger må tas når du arbeider med stråling. Under dette eksperimentet, all bestråling ble utført i en stråling isolert rom, og kilden til stråling var bare slått på når alt personell hadde forlatt og forseglet rommet. - Plasser musen tilbake i buret.
2. utstyr oppsett
Merk: kirurgi bør utføres i et rom dedikert til kirurgiske prosedyrer. Den operative overflaten må være steril.
- Rengjør alle operative overflater grundig med 70% etanol. Bruk hairnet og kjeledress. Bruk sterile Kirurgiske instrumenter og sterile hansker.
- Forbered anestesi.
- Trekk opp 1 mL fentanyl (0,315 mg/mL), 1 mL midazolam (5 mg/mL) og 2 mL sterilt vann. Bruk forskjellige sprøyter og nåler for de ulike komponentene.
- Bland fentanyl og sterilt vann ved å sakte tømme sprøyter til et sterilt glass rør. Når du er blandet, legger du til midazolam for å fullføre arbeids løsningen.
- Forbered analgesi.
- Tegn opp 0,2 mL av buprenorfin (0,3 mg/mL) og 2 mL saltvann.
- Bland volumene ved å sakte tømme sprøyter til et sterilt glass rør for å fullføre arbeids løsningen.
- Slå på mikroskopet og sørg for at belysningen er tilstrekkelig, og at mikroskopet er godt justert for operatørens øyne.
Merk: alle kirurgiske prosedyrer skal utføres under et drifts mikroskop. Et forstørrelsesområde fra 4X − 25x er tilstrekkelig.
3. forberedelse
- Veie musa pre-kirurgi ved å plassere musen i en tom container på en ryddet skala.
- Administrere bedøvelse.
- Tegn opp 0,1 mL bedøvelse per 10 g mus kroppsvekt. Injiser bedøvelse subkutant som en injeksjon med bolus.
- La musen hvile i et bur med masse sengetøy og ly for ca 10 min til fullt bedøvet. Undersøk bedøvelse dybden ved å vurdere muskel avslapping og utføre pote eller hale knipe test.
- Når fullt bedøvet, barbere bakdelen som er valgt for prosedyren ved hjelp av elektriske Clippers. Sørg for å tørke av overflødig hår.
- Slå på varmeenheten, for eksempel en varmepute og dekk den med en kirurgisk klut.
- Sett luftstrømmen til 0,8 L/min og koble den til en nosecone. Bruk 100% oksygen.
Merk: nosecone er kun for oksygen levering og ikke anestesi. - Påfør øye salve og Injiser 0,5 mL saltvann subkutant, fortrinnsvis i scruff av musen, for å hindre hypovolemi under operasjonen.
- Plasser musen for kirurgi.
- Plasser musen på den kirurgiske kluten i liggende posisjon. Plasser nosecone over snuten.
- Fixate enden av hindlimbs forsiktig med teip for å hindre at musen skifter under operasjonen.
- Sterilisere huden ved hjelp av alkohol/klorheksidin eller alkohol/povidon jod.
4. kirurgi
Merk: i dette eksempelet er venstre bakben (når musen vises i liggende posisjon), valgt for prosedyren.
- Lag en sirkulær snitt.
- Løft huden med glatt tang og klipp en liten åpning ca 5 mm proksimale til popliteal Fossa.
- Skyv skarp saks inn i åpningen og klippet mot kneet slik at snittet slutter like over kneet. Pass på å ikke punktering de underliggende fartøyene ved å løfte huden med pinsett mens klipping.
- Beveg musen til liggende posisjon og fortsette å klemme fra kneet mot popliteal Fossa til circumferential snittet er fullført.
- Analysere huden under kneet.
- Forsiktig sløv analysere området under kneet til et par millimeter over ankelen, ved langsomt å åpne og lukke microscissors mens løfte huden med pinsett.
- Klipp forsiktig gjenværende synlige adhesjon ved hjelp av microscissors. Bruk sterilt saltvann regelmessig for å holde vevet fuktig under hele prosedyren.
- Analysere huden på den proksimale kanten av circumferential innsnitt slik at den kan trekkes tilbake med en elastisk retractor.
Merk: retractor gir operatøren en bedre oversikt over det proksimale lymfe fartøyet og forhindrer at proksimale felgen skifter under operasjonen. - Mens du fremdeles er i liggende posisjon, roterer du hindlimb bentap forsiktig og fixate den med tape, slik at ischiatic vene er synlig fra det mest proksimale punktet på det utsatte området til det mest flate punktet.
- Injiser ca. 0,01 mL patent blå V subkutant mellom andre og tredje tå ved hjelp av en 0,5 mL sprøyte med en 30 G nål. Trykk forsiktig på labben et par ganger for å distribuere patent Blue V. Visualiser lymfe fartøy og lymfeknuter gjennom mikroskopet som patent Blue V fyller lymfe fartøy.
Merk: Hvis den blå fargen på lymfe fartøyene fades under prosedyren, forsiktig massere labben å fremme opptak, snarere enn injisere mer patent Blue V. overflødig bruk av patent blå V kan føre til lekkasje og farging av vevet rundt lymfe fartøy som kan kompromittere prosedyren. - Finn de viktige strukturene: den popliteal lymfeknuter (PLN), de to lymfe fartøy som er på vei til lymfeknuter (DLV1 og DLV2), og en lymfe fartøyet proksimale til lymfe noden (PLV).
Merk: alle lymfe fartøy kan bli funnet ved siden av ischiatic vene. Den proksimale lymfe fartøyet er vanligvis funnet midtre til venen, er de to-gående lymfe fartøy funnet midtre og lateral til venen. Forkortelsene av strukturene brukes i den med følgende videoen. - Forstørr til å tydelig visualisere PLV og ombinde det med en 10-0 nylon Sutur ved hjelp av mikro-nål holder og microforceps. Trykk på labben et par ganger for å sikre at ingen patent Blue V passerer proksimale til Sutur.
Merk: trimming fettet rundt lymfe fartøyet kan være nødvendig. - Gjenta trinn 4,7 for å ombinde de to Trykk på labben flere ganger for å sikre at ingen patent Blue V passerer proksimale til ligatur. Hvis lymfe fartøy lyve for nær ischiatic vene, prøv dissekere enda lenger distally.
Merk: i dette eksempelet kan det ses at en av lymfe fartøy sprekker på grunn av ligatur hindrer lymfe flyt. Lymfe fartøy vil ofte splittet fra venen lenger ned. - Fjern den popliteal lymfe noden.
- Finn den popliteal lymfe noden og klippet et lite hull med microscissors for å få tilgang til den og fjerne den med microforceps og microscissors.
Merk: lymfeknuter har en glatt perle-lignende overflate i motsetning til det omgivende fettvev. - For å teste om den fjernede vevet er en lymfe node, plassere den i et reagensrør fylt med vann.
Merk: Hvis vevet består av fett, vil vevet flyte. Hvis vevet er en lymfe node, vil den synke til bunnen.
- Finn den popliteal lymfe noden og klippet et lite hull med microscissors for å få tilgang til den og fjerne den med microforceps og microscissors.
- Fjern lysken fett puten og lymfe noden.
- Før du fjerner lysken fett puten, bruk en bipolar coagulator å cauterize fartøyene går gjennom fettet.
- Resect den lysken fett puten med microforceps og microscissors. Klem forsiktig på de cauterized fartøyene som renner gjennom fettet. Deretter forsiktig resect fettet vevet i lysken området.
Merk: lymfeknuter ligger i fettet er sjelden farget av patent Blue V og kan være vanskelig å skille fra fettet. Fjerne fettet puten i ett stykke er den beste måten å sikre at lymfe noden er fjernet.
- Skyll benet grundig med sterilt saltvann og Bekreft gjennom mikroskopet at noen små hår og partikler er grundig fjernet fra operasjonsområdet for å unngå sår forurensning og infeksjon. Kontroller at det ikke er noen aktive blødninger.
- Sutur huden kantene ned til muskel instrument med en 6-0 nylon Sutur ved hjelp av tang og nål holderen, etterlot et gap på 2 − 3 mm for å begrense overfladisk lymfe flyt.
Merk: den med følgende videoen viser et eksempel på ferdige sting. - Administrere analgesi. Tegn opp 0,1 mL analgesi per 30 g mus kroppsvekt. Injiser analgesi subkutant som en injeksjon med bolus.
- Veie musa for post-kirurgi for sammenligning.
- Plasser musen i et bur i et kabinett oppvarmet for utvinning.
5. postoperativ behandling
- Gir det mus individ burene å komme seg etter kirurgi med vann og næringen annonse lib.
- Administrer en subkutan dose på 0,02 mL buprenorfin 3x daglig i 3 dager for analgesi.
- Overvåk dyret daglig for passende sår helbredelse, tegn på smerte og infeksjon. Hvis tegn på infeksjon er til stede, bruk antibiotika salve.
6. post-kirurgi bestråling
- Tre dager etter operasjonen gjentar du prosedyren for pre-kirurgisk bestråling (trinn 1,1 − 1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne prosedyren har tidligere vært brukt i tre separate eksperimenter. Alle eksperimentene ble gjort av forskjellige bly etterforskere som alle er co-forfatterne av denne artikkelen. I alle tre eksperimenter ble det tatt stor forsiktighet for å følge samme fremgangsmåte som beskrevet i denne protokollen. I alle tre eksperimenter ble sekundær lymfødem indusert i en hindlimb bentap mens de andre hindlimb bentap fungerte som en kontroll. Volumene av hindlimbs var det primære utfallet i alle tre forsøkene. Figur 1 illustrerer studie designen.
Alle mus gjennomgikk mikro-beregnede tomografi (Benvolum) skanninger i ukene etter operasjonen for å måle volumet av hindlimbs. Benvolum-skanninger ble utført på en multimodal pre-klinisk skanner (tabell av materialer) og volumet av hindlimbs ble målt via region-of-Interest (ROI)-funksjonen i den tilhørende programvaren som tidligere beskrevet26. Det tibiofibular leddet ble plassert i tredimensjonale (3D) axonal bilder ved hjelp av en metode som tidligere var beskrevet27. AVKASTNINGEN startet på den tibiofibular skjøten og inkluderte alt vevet som er i ferd med å bli til det punktet. Hounsfield-serien for analysen ble satt til-500 til 4000.
Alle data ble analysert ved hjelp av statistisk programvare (tabell av materialer). Sidak ' s Multiple sammenligning test ble brukt til å sammenligne volumet av indusert lymfødem hindlimb bentap, med kontroll hindlimb bentap. En signifikant forskjell mellom kontroll hindlimb bentap og lymfødem hindlimb bentap er definert som en P-verdi < 0,05.
Figur 1: Studer design og tid poeng for utfallet målinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Eksperiment 126 inkluderte 32 mus fordelt på grupper på fire. Et av målene var å studere flere forskjellige doser av stråling og finne den mest foretrekke dose, for inducing varig lymfødem uten å forårsake alvorlig sykelighet. Gruppen som ble gitt to doser av 10 gy bestråling inkluderte fire mus. Figur 2 viser at en konsistent tilstand av lymfødem ble oppnådd i alle 8 uker. Tabell 1 viser at det var en signifikant forskjell i volum mellom lymfødem hindlimb bentap og kontroll hindlimb bentap i uke 1, 7 og 8. Mens en konsistent tilstand av indusert lymfødem ble oppnådd, var det ikke en statistisk signifikant forskjell mellom hindlimbs i løpet av alle 8 uker. Dette utfallet skiller seg fra de to andre eksperimentene og kan forklares på grunn av den relativt mindre utvalgsstørrelsen på fire mus. Øke antall målinger vil øke kraften i studien og herved sannsynligheten for å oppdage en forskjell hvis en forskjell finnes28.
Figur 2: gjennomsnittlig hindlimb bentap volum: eksperiment 1. Målinger av 4 mus fra gruppen som ble gitt to doser av 10 gy bestråling er inkludert i dette tallet. Denne grafen viser gjennomsnittlig hindlimb bentap volumer i mm3 i 8 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Feilfeltene representerer standardavviket (SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Uke | Lymfødem volum i mm3 (n = 4) | Kontroll volum i mm3 (n = 4) | P-verdi | 95% tillit intervall |
| 1 | 218,53 ± 9,3 | 136,78 ± 2,48 | 0,002 | 53.77 − 109.73 |
| 2 | 202,25 ± 10,24 | 141,88 ± 8,02 | 0,066 | (-6.53) − 127.28 |
| 3 | 193,28 ± 10,80 | 141,20 ± 6,80 | 0,060 | (-3.7) − 107.85 |
| 4 | 194,95 ± 21,05 | 141,50 ± 8,03 | 0,224 | (-41.85) − 148.75 |
| 5 | 193,75 ± 7,07 | 141,70 ± 8,60 | 0,051 | (-0.27) − 104.37 |
| 6 | 193,23 ± 3,42 | 141,78 ± 10,29 | 0,054 | (-1.56) − 104.46 |
| 7 | 194,95 ± 7,26 | 143,23 ± 8,90 | 0,050 | 0.17 − 103.28 |
| 8 | 195,8 ± 9,65 | 152,18 ± 5,81 | 0,009 | 19.88 − 67.38 |
Tabell 1: Sidak ' s flere sammenligninger test: eksperiment 1. Denne tabellen viser den statistiske sammenligningen mellom gjennomsnittlig antall induserte lymfødem hindlimbs og kontroll hindlimbs i løpet av 8 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Verdier presenteres som: gjennomsnittlig ± SD i mm3. P-Value < 0,05 regnes som en signifikant forskjell mellom kontroll hindlimb bentap og lymfødem hindlimb bentap. n (antall observasjoner) = 4.
Eksperiment 2 inkluderte 45 mus. 15 mus fungert som kontroller og ble gitt saltvann injeksjoner. Kontrollene brukes som representative resultater som vi antar at saltvann injeksjoner hadde ingen effekt på volumet av indusert lymfødem. Figur 3 viser at lymfødem var mindre stabil enn i eksperiment 1. I tillegg volumet av kontrollen hindlimbs økt i løpet av 8 uker. Dette reduserer den relative forskjellen som er presentert i tabell 2. Det har vært spekulert at musene bruker sine ikke-opererte hindlimb bentap mer, i ukene etter operasjonen, og at dette fører til hypertrofi og økning i lem volum av ikke-opererte hindlimb bentap. Viktigst, tabell 3 viser at det er statistisk signifikant forskjell mellom lymfødem hindlimb bentap og kontroll hindlimb bentap under alle 8 uker etter operasjonen. Jo høyere antall mus beviser at denne prosedyren kan indusere statistisk signifikant lymfødem i minst 8 uker.
Figur 3: gjennomsnittlig hindlimb bentap volum: eksperiment 2. Målinger av 15 mus fra kontrollgruppen er inkludert i dette tallet. Denne grafen viser gjennomsnittlig hindlimb bentap volumer i mm3 i 8 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Feil stolpene representerer SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperiment 1 | Eksperiment 2 | Eksperiment 3 | Eksperiment 1, 2 og 3 kombinert | |||||
| Uke | Absolutt forskjell (mm3) | Relativ differanse (%) | Absolutt forskjell (mm3) | Relativ differanse (%) | Absolutt forskjell (mm3) | Relativ differanse (%) | Absolutt forskjell (mm3) | Relativ differanse (%) |
| 1 | 81,75 ± 7,20 | 0,60 ± 0,04 | 104,34 ± 25,96 | 0,76 ± 0,23 | 85,20 ± 35,05 | 0,64 ± 0,27 | 94,02 ± 29,57 | 0,69 ± 0,24 |
| 2 | 60,38 ± 17,21 | 0,43 ± 0,14 | 107,12 ± 44,33 | 0,79 ± 0,33 | 85,63 ± 37,94 | 0,63 ± 0,29 | 92,77 ± 41,68 | 0,68 ± 0,31 |
| 3 | 52,08 ± 14,35 | 0,37 ± 0,11 | 78,77 ± 39,45 | 0,57 ± 0,28 | 74,67 ± 49,57 | 0,54 ± 0,38 | 73,74 ± 41,51 | 0,53 ± 0,31 |
| 4 | 53,45 ± 24,51 | 0,38 ± 0,19 | 50,67 ± 29,94 | 0,36 ± 0,21 | 50,62 ± 16,35 | 0,37 ± 0,11 | 51,01 ± 24,03 | 0,37 ± 0,17 |
| 5 | 52,05 ± 13,46 | 0,37 ± 0,11 | 32,74 ± 24,66 | 0,22 ± 0,17 | 42,67 ± 11,81 | 0,31 ± 0,07 | 39,08 ± 20,02 | 0,27 ± 0,14 |
| 6 | 51,45 ± 13,63 | 0,36 ± 0,11 | 26,80 ± 22,35 | 0,18 ± 0,14 | 32,86 ± 10,90 | 0,22 ± 0,08 | 32,32 ± 18,96 | 0,21 ± 0,13 |
| 7 | 51,73 ± 13,26 | 0,36 ± 0,11 | 19,04 ± 17,22 | 0,12 ± 0,11 | - | - | 25,92 ± 21,15 | 0,17 ± 0,15 |
| 8 | 43,63 ± 6,11 | 0,29 ± 0,04 | 15,15 ± 11,70 | 0,10 ± 0,08 | - | - | 21,15 ± 15,96 | 0,14 ± 0,10 |
Tabell 2: absolutt og relativ forskjell. Denne tabellen viser den absolutte forskjellen i volum mellom lymfødem-og kontroll hindlimbs ± SD i mm3 og relativ forskjell ± SD i prosent.
| Uke | Lymfødem volum i mm3 (n = 15) | Kontroll volum i mm3 (n = 15) |
P-verdi | 95% tillit intervall |
| 1 | 241,82 ± 35,69 | 137,48 ± 21,54 | < 0.001 | 82.21 − 126.47 |
| 2 | 242,41 ± 45,13 | 135,29 ± 5,81 | < 0.001 | 69.33 − 144.89 |
| 3 | 216,85 ± 41,47 | 138,08 ± 5,31 | < 0.001 | 45.15 − 112.39 |
| 4 | 193,10 ± 31,27 | 142,43 ± 5,29 | < 0.001 | 25.15 − 76.18 |
| 5 | 180,03 ± 26,03 | 147,29 ± 6,45 | 0,002 | 11.72 − 53.76 |
| 6 | 179,89 ± 25,00 | 153,09 ± 6,56 | 0,004 | 7.74 − 45.85 |
| 7 | 176,45 ± 19,77 | 157,41 ± 7,49 | 0,008 | 4.35 − 33.71 |
| 8 | 166,97 ± 11,8 | 151,82 ± 10,07 | 0,002 | 5.18 − 25.12 |
Tabell 3: Sidak ' s flere sammenligninger test: eksperiment 2. Denne tabellen viser den statistiske sammenligningen mellom gjennomsnittlig volum av indusert lymfødem hindlimbs og kontroll hindlimbs i 8 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Verdier presenteres som: gjennomsnittlig ± SD i mm3. P-Value < 0,05 regnes som en signifikant forskjell mellom kontroll hindlimb bentap og lymfødem hindlimb bentap. n (antall observasjoner) = 15.
Eksperiment 3 inkludert 36 mus. 12 mus fungert som kontroller og ble gitt saltvann injeksjoner. Kontrollene brukes som representative utfall som vi antar at saltvann injeksjoner hadde ingen effekt på volumet av indusert lymfødem. I dette eksperimentet ble hindlimb bentap volumet av musene målt i 6 uker istedenfor 8. Eksperimentet varte bare 6 uker på grunn av logistiske vanskeligheter da eksperimentet ble utført. Figur 4 viser en mer konsistent lymfødem enn eksperiment 2. Tabell 4 viser at det er statistisk signifikant lymfødem i 6 uker etter operasjonen.
Figur 4: gjennomsnittlig hindlimb bentap volum: eksperiment 3. Målinger av 12 mus fra kontrollgruppen er inkludert i dette tallet. Denne grafen viser gjennomsnittlig hindlimb bentap volumer i mm3 i 6 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Feil stolpene representerer SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Uke | Lymfødem volum i mm3 (n = 12) | Kontroll volum i mm3 (n = 12) | P-verdi | 95% tillit intervall |
| 1 | 219,06 ± 35,00 | 133,86 ± 10,02 | < 0.001 | 51.66 − 118.74 |
| 2 | 220,90 ± 36,98 | 135,27 ± 5,89 | < 0.001 | 49.33 − 121.94 |
| 3 | 211,74 ± 47,30 | 137,07 ± 7,56 | 0,002 | 27.24 − 122.11 |
| 4 | 186,09 ± 20,36 | 135,47 ± 5,70 | < 0.001 | 34.98 − 66.27 |
| 5 | 182,35 ± 18,25 | 139,68 ± 7,45 | < 0.001 | 31.37 − 53.98 |
| 6 | 183,44 ± 12,11 | 150,58 ± 8,37 | < 0.001 | 22.42 − 43.29 |
Tabell 4: Sidak ' s flere sammenligninger test: eksperiment 3. Denne tabellen viser den statistiske sammenligningen mellom gjennomsnittlig antall induserte lymfødem hindlimbs og kontroll hindlimbs i 6 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Verdier presenteres som: gjennomsnittlig ± SD i mm3. P-Value < 0,05 regnes som en signifikant forskjell mellom kontroll hindlimb bentap og lymfødem hindlimb bentap. n (antall observasjoner) = 12.
Figur 5 og tabell 5 viser gjennomsnittlig hindlimb bentap volum for alle tre eksperimentene kombinert. Tabell 5 viser at bruken av denne prosedyren resulterer i statistisk signifikant lymfødem som varer i minst 8 uker. Data fra de første 6 ukene, er de kombinerte målingene av 31 mus fra eksperimenter 1, 2 og 3. I uke 7 − 8 hadde vi bare data fra eksperimenter 1 og 2 som resulterte i kombinerte målinger fra 19 mus.
Figur 5: kombinert gjennomsnittlig hindlimb bentap volum: eksperiment 1, 2 og 3. Tretti-en mus inkludert i de første 6 ukene etter operasjonen og 19 mus inkludert i de følgende 2 uker. Denne grafen viser gjennomsnittlig hindlimb bentap volumer i mm3 i 8 uker etter operasjonen. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Feil stolpene representerer SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Uke | Lymfødem volum i mm3 (uke 1 − 6 n = 31) (Uke 7 − 8 n = 19) |
Kontroll volum i mm3 (uke 1 − 6 n = 31) (Uke 7 − 8 n = 19) |
P-verdi | 95% tillit intervall |
| 1 | 230,00 ± 34,46 | 135,99 ± 16,03 | < 0.001 | 78.19 − 109.84 |
| 2 | 228,90 ± 40,91 | 136,13 ± 6,32 | < 0.001 | 70.47 − 115.07 |
| 3 | 211,83 ± 41,15 | 138,09 ± 6,36 | < 0.001 | 51.53 − 95.95 |
| 4 | 190,63 ± 25,81 | 139,62 ± 6,54 | < 0.001 | 38.15 − 63.87 |
| 5 | 182,70 ± 21,52 | 143,62 ± 7,79 | < 0.001 | 28.36 − 49.79 |
| 6 | 182,98 ± 19,11 | 150,66 ± 8,36 | < 0.001 | 22.18 − 42.47 |
| 7 | 180,34 ± 19,31 | 154,43 ± 9,60 | < 0.001 | 11.61 − 40.22 |
| 8 | 173,04 ± 16,42 | 151,89 ± 9,19 | < 0.001 | 10.35 − 31.94 |
Tabell 5: Sidak ' s flere sammenligninger test: eksperiment 1, 2 og 3 kombinert. Denne tabellen viser den statistiske sammenligningen mellom gjennomsnittlig antall induserte lymfødem hindlimbs og kontroll hindlimbs av 31 mus i de første 6 ukene etter operasjonen og 19 mus i de følgende 2 ukene. Alle mus fikk en dose på 10 gy bestråling pre-og post-kirurgi. Verdier presenteres som: gjennomsnittlig ± SD i mm3. P-Value < 0,05 regnes som en signifikant forskjell mellom kontroll hindlimb bentap og lymfødem hindlimb bentap. n (antall observasjoner) = 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes noen viktige trinn i denne protokollen. For det første er det viktig at forskerne tar sikkerhetsforanstaltninger når du arbeider med radioaktivitet. For det andre, under kirurgisk del av denne protokollen, er det viktig å starte prosedyren når musen er anesthetized og fullføre den uten unødvendige pauser. Dette er viktig for å unngå en overdrevent lang kirurgisk periode for dyret og for å hindre at anestesi mister effekt under operasjonen. Det anbefales å bare administrere en bolus injeksjon av bedøvelse og fullføre kirurgisk inngrep i en sittende. Det er også et kritisk skritt, for ikke å administrere for mye patent Blue V, som overflødig patent Blue V vil misfarges vevet rundt lymfe fartøy. Hvis det omgivende vevet blir misfarget det kan være nesten umulig å visualisere lymfe fartøy og dette kompromisser prosedyren. Selv om man ikke klarer å visualisere lymfe fartøy, vil misfarget vev gjør det vanskelig å vurdere om patent blå V passerer proksimale til ligatur eller ikke. Dette er problematisk fordi operatøren må være sikker på at de plasserte ligaturer er constricting lymfe flyt, for å sikre at prosedyren vil bli vellykket. Det er også viktig å etterlate et gap på 2 − 3 mm ved lukking av såret. Som en midlertidig hud gap er ofte nødvendig for å etterligne den menneskelige såret helbredende prosess29.
Begrensningene ved denne metoden er at det er en tidkrevende prosedyre som krever tilgang til et mikroskop og tidligere mikrokirurgisk trening. Når du utfører kirurgisk del av denne protokollen, er det viktig å planlegge tiden i-mellom kirurgiske prosedyrer. En masse tid går i venter for det dyr å bli anesthetized, barbering det hindlimb bentap og vanligvis forberede for hver inngrep fremgangsmåte. Derfor er det anbefalt å forberede boliger og bedøvelse på forhånd. Det er viktig å merke seg at for å være sikker på at kronisk lymfødem har blitt indusert, histopatologi må analyseres. Vi har ikke inkludert histopatologi i denne artikkelen, som er en begrensning. Uten histopatologi støtter det faktum at histologic endringer har skjedd med lymfe fartøyene endringene i volum i hindlimbs kan bare beskrives som ødem. Artikkelen som inkluderer alle data på de fire musene fra eksperiment 126 inkluderer histopatologi og viser at det var betydelige endringer i histopatologi ved hjelp av denne teknikken. Artikkelen inneholder også lymfatisk bildebehandling. Den samme fremgangsmåten ble brukt på musene i eksperiment 2 og 3, men histopatologi viste ingen signifikant forskjell mellom lymfødem hindlimb bentap og kontroll hindlimb bentap i disse eksperimentene. Videre studier inkludert histopatologi er nødvendig for denne modellen for å avklare om lymfødem er indusert på et histologiske nivå. Eksperimenter 2 og 3 er ennå ikke publisert, og vi kan derfor ikke henvise til dem.
Mens du bruker Benvolum skanninger å måle hindlimb bentap volum kan hevdes å være mer objektiv enn å bruke vann forskyvning metoden eller circumferential målinger, det har fortsatt sine begrensninger. Måle teknikken er kostbar, tidkrevende og krever tilgang til en Benvolum-skanner og analyse av programvare.
En av de største utfordringene med gnager lymfødem modeller generelt, har vært spontan lymfødem oppløsning, med mindre overdreven stråling ble utført25. Når du utvikler denne modellen, testet vi flere forskjellige doser av stråling for å finne en dose som ville indusere varig lymfødem uten å forårsake alvorlig sykelighet26. Tidligere har lymfødem modeller ikke blitt standardisert i metoder for lymfødem induksjon eller utfall vurderinger. Oashi et al.20 brukte en enkelt dose på 30 gy bestråling, og ligaturer hvert lymfatisk fartøy ved tre separate punkter. I denne studien, tok den kirurgiske prosedyren 90 min til å utføre. Selv om metoden som presenteres i denne artikkelen kan betraktes som tidkrevende, kan operasjonsdelen av prosedyren fortsatt utføres omtrent dobbelt så raskt som metoden som presenteres av Oashi et al.20. De hadde også en oppfølgingsperiode på 6 måneder, noe som er betydelig lengre enn noen av studiene som presenteres i denne artikkelen. De inkluderte imidlertid bare én mus, og de målte omkretsen manuelt for å vurdere hevelse, mens volumene som ble presentert i denne artikkelen, ble målt på 31 mus som brukte Benvolum-skanninger og 3D-analyseprogramvare. Komatsu et al.30 fjernet lysken lymfeknuter og tilhørende perifere lymfe fartøy og fettvev ved hjelp av en elektrisk kniv. Ved hjelp av en elektrisk kniv kan være en enklere tilnærming som ikke krever mikrokirurgisk trening, men indusert ødem løst etter dag 4, mens metoden som presenteres i denne artikkelen gir konsistent lymfødem varig minst 8 uker.
Denne protokollen vil forhåpentligvis gjøre det mulig for forskere å vurdere begrensningene og fordelene ved den reviderte lymfødem-modellen. Protokollen bør også hjelpe forskere til å gjenskape modellen. Metoden kan brukes i fremtidige observasjons og interventional studier for å forstå patofysiologi av lymfødem og forskning romanen behandlingstilbud. I fremtidige studier, vil det også være interessant å ha en oppfølging lenger enn 8 uker å observere hvor lenge indusert lymfødem varer. Det vil også være interessant å observere effekten av å utføre mer målrettet bestråling av musene pre-og post-kirurgi. Dette kan gjøres ved å utføre en CT-skanning og planlegge et mål volum. I fremtidige studier, kan denne modellen også bli støttet av fluorescens-guidet lymfatisk Imaging, perometry eller bioimpedance studier. Denne metoden gir statistisk signifikant lymfødem som varer i minst 8 uker, som har blitt målt direkte via CT volum i tre separate eksperimenter av ulike bly etterforskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Peter bollen, leder av biomedisinsk laboratorium for utlån av utstyr som trengs for å spille inn opptakene sett gjennom mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. , Springer International Publishing. New York, NY. 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment? Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R. 3rd, Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H.
- Gutknecht, M., et al.
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs' limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O'Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats' limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
