Summary
Denna djurmodell gör det möjligt för forskare att inducera statistiskt signifikanta sekundära lymfödem i bakbenen av möss, varar minst 8 veckor. Modellen kan användas för att studera patofysiologin i lymfödem och för att undersöka nya behandlingsalternativ.
Abstract
Djurmodeller är av största vikt i forskningen av lymfödem för att förstå patofysiologin av sjukdomen, men också att utforska potentiella behandlingsalternativ. Denna musmodell gör det möjligt för forskare att inducera betydande lymfödem varar minst 8 veckor. Lymfödem induceras med hjälp av en kombination av fraktionerad strålbehandling och kirurgisk ablation av lymphatics. Denna modell kräver att mössen får en dos av 10 grå (Gy) strålning före och efter operationen. Den kirurgiska delen av modellen innebär ligering av tre lymfkärlen och utvinning av två lymfkörtlar från musen bakben. Att ha tillgång till mikrokirurgiska verktyg och ett Mikroskop är viktigt, på grund av de små anatomiska strukturer av möss. Fördelen med denna modell är att det resulterar i statistiskt signifikanta lymfödem, vilket ger en god grund för att utvärdera olika behandlingsalternativ. Den er också en stor och lätt tillgänglig valen för mikrokirurgisk bildning. Begränsningen av denna modell är att förfarandet kan vara tidskrävande, särskilt om inte praktiseras i förväg. Modellen resulterar i objektivt kvantifierbara lymfödem hos möss, utan att orsaka allvarlig morbiditet och har testats i tre separata projekt.
Introduction
Lymfödem kännetecknas av en ansamling av lymfa vätska som leder till lokaliserad vävnad svullnad, som främst uppstår på grund av nedsatt eller störd flöde av lymfvätska i lymfkärlen1. Lymfflödet kan försämras eller störas av infektion, obstruktion, skada eller medfödda defekter i lymfsystemet2. Dessa etiologier resultera i ackumulering av lymf vätskan, vilket leder till ett kroniskt tillstånd av inflammation, vilket resulterar i efterföljande fibros, samt avsättning av fettvävnad3. Lymfödem kan kategoriseras som primära eller sekundära lymfödem. Primära lymfödem orsakas av utvecklingsstörningar eller genetisk mutation2,4. Sekundära lymfödem uppstår på grund av underliggande systemisk sjukdom, kirurgi eller trauma2,4. Sekundära lymfödem är den vanligaste formen av lymfödem i världen2. I utvecklade länder, den vanligaste orsaken till sekundära lymfödem är onkologisk terapi såsom Adjuvant strålbehandling och lymfkörtel dissektion5. Lymfödem är vanligast bland bröstcancerpatienter, men kan också utvecklas hos patienter med gynekologisk, melanom, urogenital eller halscancer6. Det har föreslagits att av alla kvinnor som diagnostiserats med bröstcancer, 21% kommer att utveckla lymfödem7.
Lymfödem kan vara stressande för patienten både fysiskt och psykiskt. Patienter med lymfödem har en ökad risk för infektion5,8,9, dålig livskvalitet och kan utveckla social ångest och symtom på depression10. Komplikationer av kroniska lymfödem leder till höga kostnader för vård och en ökad sjukdomsbörda9,11. Fynd har också föreslagit att lymfödem kan vara förknippade med ökad risk för dödsfall efter bröstcancerbehandling12. Konservativ förvaltning såsom komprimering av det drabbade området, Manuell lymfdränage och allmän hudvård förblir den första linjen strategi. Det finns för närvarande ingen botande behandling6. Även om framsteg har gjorts inom området kirurgisk och medicinsk terapi, finns det fortfarande utrymme för förbättringar. Mer forskning, ge insikt i patofysiologi och progression av sjukdomen, behövs för att kliniker att ge bättre behandlingsalternativ för patienterna5.
Djurmodeller används i preklinisk forskning för att förstå sjukdomens patofysiologi och utveckla potentiella behandlingsalternativ. Flera olika lymfödem djurmodeller har fastställts i hundar13,14, kaniner15, får16, svin17,18 och gnagare19,20, 21,22,23,24. Den gnagare modellen verkar vara den mest kostnadseffektiva modellen, när man undersöker återuppbyggnaden av lymfatiska funktion, på grund av gnagare är lättillgänglig och relativt lågpris25. Majoriteten av möss modellerna har fokuserat på att inducera lymfödem i svansen på möss21,22,23. Svansen modellen är mycket tillförlitlig, men den exakta kirurgiska tekniken för att inducera lymfödem varierar avsevärt i tidigare publicerat material. Detta resulterar i variationer i varaktighet och robusthet av de utvecklade lymfödem presenteras i känd litteratur25. Olika tekniker används också för att inducera lymfödem i bakbenen modellen och de ger också varierande resultat, men bakbenen modellen kan vara lättare att förstå från ett translationell perspektiv. Tidigare lymfödem modeller har hämmats av spontan lymfödem upplösning och därför en reproducerbar och permanent lymfödem modell behövs25. Forskare har tidigare försökt att öka dosen av strålning, för att förhindra spontan lymfödem upplösning, men detta har ofta lett till efterföljande svår morbiditet25.
Denna modell resulterar i statistiskt signifikanta lymfödem, utan att orsaka allvarlig morbiditet, genom att kombinera mikrokirurgi med strålning. Modellen har reviderats från en tidigare kirurgisk modell genom att tillsätta en dos av bestrålning som inducerar lymfödem, utan att orsaka allvarlig morbiditet26. Det erbjuder också en stor möjlighet för mikrokirurgisk träning. Att ha tillgång till mikrokirurgisk utrustning och ett Mikroskop är nödvändigt, på grund av de små anatomiska strukturer av möss. Det kirurgiska ingreppet kan utföras när användaren har fått lära sig grundläggande mikrokirurgiska tekniker, såsom suturering med mikrokirurgiska instrument. Operatörerna som utförde den här proceduren alla såg handledning videor av Acland om förutsättningarna för mikrokirurgiska färdigheter (1981) och grundläggande microsutur teknik (1985). Vi rekommenderar att du tränar kirurgiska ingrepp 8 − 10 gånger innan du använder det i forskning. Öva proceduren säkerställer att färre misstag görs och att förfarandet kan utföras mer effektivt. När behärskar, kan det kirurgiska ingreppet utföras i 45 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuren var inhysta i universitet av sydlig dansk djuromsorg Faciliteters så per institutionell riktlinjerna. Alla förfaranden som involverar försöksdjur har godkänts av djur experiment inspektionen, Danmarks miljö-och livsmedels ministerium.
1. bestrålning före kirurgi
Anmärkning: bestrålning före operationen sker 7 dagar före operationen.
- Inducera anestesi.
- Placera musen i en induktions låda och Ställ in spridare till 3% isofluran med ett syre flöde på 0,8 − 1,2 L/min för att inducera inhalationsanestesi.
Anmärkning: Alternativt kan injicerbara anestetika användas men för den korta varaktigheten av bestrålning inducerande inandning anestesi var tillräcklig. För att få de resultat som presenteras i denna artikel, 9-veckors gamla kvinnliga C57BL6 möss användes. - Se till att musen är helt sövda av svans eller tass nypa test.
- Placera musen i en induktions låda och Ställ in spridare till 3% isofluran med ett syre flöde på 0,8 − 1,2 L/min för att inducera inhalationsanestesi.
- Placera musen för bestrålning.
- Om helt Sedated, flytta musen från induktion rutan och placera den under källan till strålning i liggande läge och försiktigt fixera bakbenen med tejp.
Obs: musen kommer att förbli Sedated under den korta varaktigheten av strålningen. - Placera en 1,5 mm tjock bly pad för att säkerställa att endast det område som genomgår kirurgi (dvs, det cirkulära området med en diameter på 25 mm runt knäet) blir bestrålade.
- Om helt Sedated, flytta musen från induktion rutan och placera den under källan till strålning i liggande läge och försiktigt fixera bakbenen med tejp.
- Administrera en dos på 10 Gy-strålning med en doshastighet av 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
FÖRSIKTIGHET: säkerhetsåtgärder måste vidtas vid strålningsarbete. Under detta experiment utfördes all bestrålning i ett strålisolerat rum, och strålkällan var endast påslagen när all personal hade lämnat och beseglat rummet. - Placera musen tillbaka i sin bur.
2. inställning av utrustning
Anmärkning: kirurgi bör utföras i ett rum avsett för kirurgiska ingrepp. Den operativa ytan måste vara steril.
- Rengör alla operativa ytor grundligt med 70% etanol. Bär hårnät och overaller. Använd sterila kirurgiska instrument och sterila handskar.
- Förbered anestesi.
- Dra upp 1 mL fentanyl (0,315 mg/mL), 1 mL midazolam (5 mg/mL) och 2 mL sterilt vatten. Använd olika sprutor och nålar för de olika komponenterna.
- Blanda fentanyl och sterilt vatten genom att sakta tömma sprutorna i ett sterilt glasrör. När det blandas lägger du till midazolam för att slutföra arbetslösningen.
- Förbered analgesi.
- Dra upp 0,2 mL buprenorfin (0,3 mg/mL) och 2 mL saltlösning.
- Blanda volymerna genom att sakta tömma sprutorna i ett sterilt glasrör för att slutföra arbetslösningen.
- Slå på mikroskopet och se till att belysningen är tillräcklig, och att mikroskopet är väl justerat för förarens ögon.
Anmärkning: alla kirurgiska ingrepp ska utföras under ett drift Mikroskop. Ett förstorings intervall från 4x − 25x räcker.
3. förberedelser
- Väg musen före operationen genom att placera musen i en tom behållare på en rensat skala.
- Administrera bedövningsmedel.
- Dra upp 0,1 mL bedövningsmedel per 10 g mus kroppsvikt. Injicera bedövningsmedlet subkutant som en bolusinjektion.
- Låt musen vila i en bur med mycket sängkläder och skydd för ca 10 min tills helt Sedated. Undersök anestesidjupet genom att bedöma muskelavslappning och utföra tass eller svans nypa test.
- När den är helt sederad, raka bakbenet som valts för förfarandet med hjälp av elektriska Clippers. Se till att torka av överflödigt hår.
- Slå på uppvärmningsanordningen, till exempel en värmedyna och täck den med en kirurgisk trasa.
- Ställ in flödet av syre till 0,8 L/min och Anslut den med en Nosecone. Använd 100% syre.
Anmärkning: den noskon är endast för syre leverans och inte anestesi. - Applicera oftalmologiska salva och injicera 0,5 mL saltlösning subkutant, företrädesvis i skruffen av musen, för att förhindra hypovolemi under operationen.
- Placera musen för kirurgi.
- Placera musen på den kirurgiska duken i liggande läge. Placera noskon över nos.
- Fixera slutet av bakbenen försiktigt med tejp för att förhindra musen från att skifta under operationen.
- Sterilisera huden med alkohol/klorhexidin eller alkohol/povidon jod.
4. kirurgi
ANMÄRKNINGAR: i det här exemplet har den vänstra bakbenen (när musen visas i liggande läge) valts för förfarandet.
- Gör ett cirkulärt snitt.
- Lyft huden med slät tång och klämma en liten öppning ca 5 mm proximalt till pop lie tal lymf-och fossa.
- Skjut skarpa saxar i öppningen och klämma mot knäet så att snittet slutar strax ovanför knäet. Se till att inte punktera de underliggande kärlen genom att lyfta huden med pinps under klippning.
- Flytta musen till liggande position och fortsätta att klämma från knäet mot pop lie tal lymf-och fossa tills omkretsriktningen snittet är klar.
- Dissekera huden under knäet.
- Försiktigt slö dissekera området under knäet till ett par millimeter ovanför vristen, genom att sakta öppna och stänga mikrosaxen samtidigt lyfta huden med pinvar.
- Försiktigt klipp återstående synliga adhesioner med mikrosax. Använd steril saltlösning regelbundet för att hålla vävnaden fuktig under hela proceduren.
- Dissekera huden vid den proximala kanten av omkretsriktningen snitt så att den kan dras tillbaka med en elastisk upprullningsdon.
Obs: upprullningsdonet ger operatören en bättre bild av det proximala lymf kärlet och förhindrar att den proximala fälgen förskjuts under operationen. - Medan fortfarande i liggande läge, rotera bakbenen försiktigt och fixera den med tejp, så att ischiatiska venen är synlig från den mest proximala punkten i det exponerade området till den mest distala punkten.
- Injicera cirka 0,01 mL av patentet blått V subkutant mellan den andra och tredje tån med en 0,5 mL spruta med en 30 G nål. Tryck försiktigt på Paw ett par gånger för att distribuera patentet blå V. visualisera lymfkärlen och lymfkörtel genom mikroskopet som patentet blå V fyller lymfkärlen.
Anmärkning: om den blå färgen på lymfkärlen bleknar under förfarandet, försiktigt massera tass att främja upptag, snarare än injicera mer patent blå V. överanvändning av patent Blue V kan leda till läckage och färgning av vävnaden som omger lymfkärlen och som kan äventyra förfarandet. - Lokalisera de viktiga strukturerna: Poplietallymfknutor lymfkörteln (PLN), de två lymfkärlen distala till lymfknutor (DLV1 och DLV2), och en lymfa kärlet proximalt till lymfkörtel (PLV).
Anmärkning: alla lymfkärlen kan hittas intill ischiatiska ven. Den proximala lymfa kärlet finns vanligtvis mediala till venen, de två distala lymfkärlen finns mediala och laterala till venen. Förkortningarna av strukturerar används i den medföljande videoen. - Förstora för att tydligt visualisera PLV och ligera den med en 10-0 nylon sutur med mikro-nål hållare och microforceps. Tryck på Paw ett par gånger för att säkerställa att inga patent blå V passerar proximalt till suturen.
Anmärkning: trimning av fettet som omger lymf kärlet kan vara nödvändigt. - Upprepa steg 4,7 för att ligera de två distala lymfkärlen. Tryck på Paw flera gånger för att säkerställa att inget patent blått V passerar proximalt till ligatur. Om lymfkärlen ligga nära ischiatiska ven, försök dissekera ännu mer distalt.
Notera: i detta exempel kan man se att en av lymfkärlen skurar på grund av ligatur hindrar lymfflödet. Lymfkärlen kommer ofta att delas upp från venen längre ner. - Ta bort Poplietallymfknutor lymfkörteln.
- Lokalisera Poplietallymfknutor lymfkörteln och klipp ett litet hål med mikrosax för att komma åt den och ta bort den med microforceps och microsax.
Notera: lymfkörtlarna har en slät pärlemorliknande yta i motsats till den omgivande fettvävnaden. - För att testa om den borttagna vävnaden är en lymfkörtel, placera den i ett provrör fyllt med vatten.
Obs: om vävnaden består av fett, kommer vävnaden flyta. Om vävnaden är en lymfkörtel, det kommer att sjunka till botten.
- Lokalisera Poplietallymfknutor lymfkörteln och klipp ett litet hål med mikrosax för att komma åt den och ta bort den med microforceps och microsax.
- Ta bort ljumsk fett pad och lymfkörtel.
- Innan du tar bort ljumsk fett pad, Använd en bipolär koagulator att bränna de fartyg som löper genom fettet.
- Resect den ljumsk fett pad med microforceps och microsax. Klipp försiktigt de flamberats fartyg som går genom fettet. Sedan försiktigt resect fettvävnad i ljumsk området.
Obs: lymfkörtel som ligger i fettet är sällan färgade av patent blå V och kan vara svårt att skilja från fettet. Ta bort fett pad i ett stycke är det bästa sättet att säkerställa att lymfkörtel har tagits bort.
- Skölj benet grundligt med steril saltlösning och bekräfta genom mikroskopet att alla små hårstrån och partiklar har grundligt avlägsnats från operationsområdet för att undvika sårkontaminering och infektion. Se till att det inte finns någon aktiv blödning.
- Sutur huden kanterna ner till muskeln facia med en 6-0 nylon sutur med hjälp av tång och nål hållare, vilket ger en lucka på 2 − 3 mm för att begränsa det ytliga lymfflödet.
Obs: den medföljande videon visar ett exempel på färdiga suturer. - Administrera analgesi. Dra upp 0,1 mL analgesi per 30 g mus kroppsvikt. Injicera analgesi subkutant som en bolusinjektion.
- Väga musen för post-kirurgi för jämförelse.
- Placera musen i en bur i ett skåp uppvärmd för återhämtning.
5. postoperativ vård
- Ge mössen individuella burar att återhämta sig efter operationen med vatten och mat AD libitum.
- Administrera en subkutan bolusdos på 0,02 mL buprenorfin 3x dagligen i 3 dagar för analgesi.
- Övervaka djuret dagligen för lämplig sårläkning, tecken på smärta och infektion. Om tecken på infektion är närvarande, använda antibiotika salva.
6. bestrålning efter operationen
- Tre dagar efter operationen, upprepa proceduren för bestrålning före kirurgi (steg 1.1 − 1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna procedur har tidigare använts i tre separata experiment. Alla experiment gjordes av olika bly utredare som alla är medförfattare till denna artikel. I alla tre experimenten togs stor omsorg för att följa samma förfarande som beskrivs i detta protokoll. I alla tre experiment, var sekundärt lymfödem induceras i en bakben medan den andra bakbenen tjänade som en kontroll. Volymerna av bakbenen var det primära utfallet i alla tre experimenten. Figur 1 illustrerar studiens utformning.
Alla möss genomgick mikrodatortomografi (μCT) skanningar under veckorna efter operationen för att mäta volymen av bakbenen. De μCT skanningar utfördes på en multimodalitet preklinisk Scanner (tabell över material) och volymen av bakbenen mättes via regionen-of-Interest (ROI) funktion i den tillhörande programvaran som tidigare beskrivits26. Den distala syndesmosis leden var placerad i tredimensionella (3D) axonala bilder med hjälp av en metod som tidigare beskrivits27. ROI började vid distala syndesmosis gemensamma och inkluderade all vävnad distalt till den punkten. Hounsfield-intervallet för analysen var inställt på-500 till 4000.
Alla data analyserades med hjälp av statistisk programvara (tabell över material). Sidaks multipeljämförelse test användes för att jämföra volymen av den inducerade lymfödem bakbenen, med kontroll hindlimb. En signifikant skillnad mellan kontroll bakbenet och lymfödem bakbenen definieras som ett P-värde < 0,05.
Figur 1: studiens utformning och tidpunkter för utfall mätningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Experiment 126 inkluderade 32 möss fördelade i grupper om fyra. Ett av målen var att studera flera olika doser av strålning och hitta den mest föredragna dosen, för att inducera varaktig lymfödem utan att orsaka svår morbiditet. Gruppen som fick två doser av 10 Gy-strålning inkluderade fyra möss. Figur 2 visar att ett konsekvent tillstånd av lymfödem uppnåddes under alla 8 veckor. Tabell 1 visar att det fanns en signifikant skillnad i volym mellan lymfödem bakben och kontroll bakbenet i vecka 1, 7 och 8. Medan ett konsekvent tillstånd av inducerad lymfödem uppnåddes, det fanns inte en statistiskt signifikant skillnad mellan bakbenen under alla 8 veckor. Detta utfall skiljer sig från de två andra experimenten och kan förklaras på grund av den relativt mindre urvalsstorleken på fyra möss. Öka antalet mätningar skulle öka kraften i studien och härmed sannolikheten för att upptäcka en skillnad om det finns en skillnad28.
Figur 2: medelvärde för bakextremitets volym: experiment 1. Mätningar av 4 möss från gruppen som fick två doser av 10 Gy-strålning ingår i denna siffra. Detta diagram visar de genomsnittliga bakextremiteterna i mm3 under de 8 veckorna efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Felstaplarna representerar standardavvikelsen (SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vecka | Lymfödem volym i mm3 (n = 4) | Kontroll volym i mm3 (n = 4) | P-värde | 95% konfidensintervall |
| 1 | 218,53 ± 9,3 | 136,78 ± 2,48 | 0,002 | 53.77 − 109.73 |
| 2 | 202,25 ± 10,24 | 141,88 ± 8,02 | 0,066 | (-6.53) − 127.28 |
| 3 | 193,28 ± 10,80 | 141,20 ± 6,80 | 0,060 | (-3.7) − 107.85 |
| 4 | 194,95 ± 21,05 | 141,50 ± 8,03 | 0,224 | (-41.85) − 148.75 |
| 5 | 193,75 ± 7,07 | 141,70 ± 8,60 | 0,051 | (-0,27) − 104.37 |
| 6 | 193,23 ± 3,42 | 141,78 ± 10,29 | 0,054 | (-1,56) − 104.46 |
| 7 | 194,95 ± 7,26 | 143,23 ± 8,90 | 0,050 | 0.17 − 103.28 |
| 8 | 195,8 ± 9,65 | 152,18 ± 5,81 | 0,009 | 19.88 − 67.38 |
Tabell 1: sidaks multipla jämförelser test: experiment 1. Denna tabell visar den statistiska jämförelsen mellan de genomsnittliga volymerna av inducerad lymfödem bakbenen och kontrollera bakbenen under 8 veckor efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Värden presenteras som: medelvärde ± SD i mm3. P-värde < 0,05 betraktas som en signifikant skillnad mellan kontroll bakbenet och lymfödem bakben. n (antal observationer) = 4.
Experiment 2 inkluderade 45 möss. 15 möss fungerade som kontroller och fick saltlösning. Kontrollerna används som representativa resultat som vi antar att de saltlösning injektioner hade ingen effekt på volymen av inducerad lymfödem. Figur 3 visar att lymfödem var mindre stabila än i experiment 1. Dessutom ökade volymen av kontroll bakbenen under 8 veckor. Detta minskar den relativa skillnaden som presenteras i tabell 2. Det har spekulerats att möss använder sina icke-manövrerade bakben mer, under veckorna efter operationen, och att detta leder till hypertrofi och ökning av lem volym av den icke-manövrerade bakbenet. Viktigast av allt, tabell 3 visar att det finns statistiskt signifikant skillnad mellan lymfödem bakben och kontroll bakbenet under alla 8 veckor efter operationen. Det högre antalet möss bevisar att detta förfarande kan inducera statistiskt signifikanta lymfödem i minst 8 veckor.
Figur 3: medelvärde för bakextremitets volym: experiment 2. Mätningar av 15 möss från kontrollgruppen ingår i denna siffra. Detta diagram visar de genomsnittliga bakextremiteterna i mm3 under de 8 veckorna efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Felstaplarna representerar SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Experiment 1 | Experiment 2 | Experiment 3 | Experiment 1, 2 och 3 kombinerade | |||||
| Vecka | Absolut skillnad (mm3) | Relativ skillnad (%) | Absolut skillnad (mm3) | Relativ skillnad (%) | Absolut skillnad (mm3) | Relativ skillnad (%) | Absolut skillnad (mm3) | Relativ skillnad (%) |
| 1 | 81,75 ± 7,20 | 0,60 ± 0,04 | 104,34 ± 25,96 | 0,76 ± 0,23 | 85,20 ± 35,05 | 0,64 ± 0,27 | 94,02 ± 29,57 | 0,69 ± 0,24 |
| 2 | 60,38 ± 17,21 | 0,43 ± 0,14 | 107,12 ± 44,33 | 0,79 ± 0,33 | 85,63 ± 37,94 | 0,63 ± 0,29 | 92,77 ± 41,68 | 0,68 ± 0,31 |
| 3 | 52,08 ± 14,35 | 0,37 ± 0,11 | 78,77 ± 39,45 | 0,57 ± 0,28 | 74,67 ± 49,57 | 0,54 ± 0,38 | 73,74 ± 41,51 | 0,53 ± 0,31 |
| 4 | 53,45 ± 24,51 | 0,38 ± 0,19 | 50,67 ± 29,94 | 0,36 ± 0,21 | 50,62 ± 16,35 | 0,37 ± 0,11 | 51,01 ± 24,03 | 0,37 ± 0,17 |
| 5 | 52,05 ± 13,46 | 0,37 ± 0,11 | 32,74 ± 24,66 | 0,22 ± 0,17 | 42,67 ± 11,81 | 0,31 ± 0,07 | 39,08 ± 20,02 | 0,27 ± 0,14 |
| 6 | 51,45 ± 13,63 | 0,36 ± 0,11 | 26,80 ± 22,35 | 0,18 ± 0,14 | 32,86 ± 10,90 | 0,22 ± 0,08 | 32,32 ± 18,96 | 0,21 ± 0,13 |
| 7 | 51,73 ± 13,26 | 0,36 ± 0,11 | 19,04 ± 17,22 | 0,12 ± 0,11 | - | - | 25,92 ± 21,15 | 0,17 ± 0,15 |
| 8 | 43,63 ± 6,11 | 0,29 ± 0,04 | 15,15 ± 11,70 | 0,10 ± 0,08 | - | - | 21,15 ± 15,96 | 0,14 ± 0,10 |
Tabell 2: absolut och relativ skillnad. Denna tabell visar den absoluta skillnaden i volym mellan lymfödem-och kontroll bakbenen ± SD i mm3 och den relativa skillnaden ± SD i procent.
| Vecka | Lymfödem volym i mm3 (n = 15) | Kontroll volym i mm3 (n = 15) |
P-värde | 95% konfidensintervall |
| 1 | 241,82 ± 35,69 | 137,48 ± 21,54 | < 0,001 | 82.21 − 126.47 |
| 2 | 242,41 ± 45,13 | 135,29 ± 5,81 | < 0,001 | 69.33 − 144.89 |
| 3 | 216,85 ± 41,47 | 138,08 ± 5,31 | < 0,001 | 45.15 − 112.39 |
| 4 | 193,10 ± 31,27 | 142,43 ± 5,29 | < 0,001 | 25.15 − 76.18 |
| 5 | 180,03 ± 26,03 | 147,29 ± 6,45 | 0,002 | 11.72 − 53.76 |
| 6 | 179,89 ± 25,00 | 153,09 ± 6,56 | 0,004 | 7.74 − 45.85 |
| 7 | 176,45 ± 19,77 | 157,41 ± 7,49 | 0,008 | 4,35 − 33.71 |
| 8 | 166,97 ± 11,8 | 151,82 ± 10,07 | 0,002 | 5.18 − 25.12 |
Tabell 3: Sidaks multipla jämförelser test: experiment 2. Denna tabell visar den statistiska jämförelsen mellan de genomsnittliga volymerna av inducerad lymfödem bakbenen och kontrollera bakbenen i 8 veckor efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Värden presenteras som: medelvärde ± SD i mm3. P-värde < 0,05 betraktas som en signifikant skillnad mellan kontroll bakbenet och lymfödem bakben. n (antal observationer) = 15.
Experiment 3 inkluderade 36 möss. 12 möss fungerade som kontroller och fick saltlösning. Kontrollerna används som representativa resultat som vi antar att de saltlösning injektioner hade ingen effekt på volymen av inducerad lymfödem. I detta experiment mättes bakbenet-volymen av mössen för 6 veckor i stället för 8. Experimentet varade bara 6 veckor på grund av logistiska svårigheter när experimentet utfördes. Figur 4 visar en mer konsekvent lymfödem än experiment 2. Tabell 4 visar att det finns statistiskt signifikant lymfödem i 6 veckor efter operationen.
Figur 4: medelvärde för bakextremitets volym: experiment 3. Mätningar av 12 möss från kontrollgruppen ingår i denna siffra. Detta diagram visar de genomsnittliga bakextremiteterna i mm3 under de 6 veckorna efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Felstaplarna representerar SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vecka | Lymfödem volym i mm3 (n = 12) | Kontroll volym i mm3 (n = 12) | P-värde | 95% konfidensintervall |
| 1 | 219,06 ± 35,00 | 133,86 ± 10,02 | < 0,001 | 51.66 − 118.74 |
| 2 | 220,90 ± 36,98 | 135,27 ± 5,89 | < 0,001 | 49.33 − 121.94 |
| 3 | 211,74 ± 47,30 | 137,07 ± 7,56 | 0,002 | 27.24 − 122.11 |
| 4 | 186,09 ± 20,36 | 135,47 ± 5,70 | < 0,001 | 34.98 − 66.27 |
| 5 | 182,35 ± 18,25 | 139,68 ± 7,45 | < 0,001 | 31.37 − 53.98 |
| 6 | 183,44 ± 12,11 | 150,58 ± 8,37 | < 0,001 | 22.42 − 43.29 |
Tabell 4: Sidaks multipla jämförelser test: experiment 3. Denna tabell visar den statistiska jämförelsen mellan de genomsnittliga volymerna av inducerad lymfödem bakbenen och kontrollera bakbenen i 6 veckor efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Värden presenteras som: medelvärde ± SD i mm3. P-värde < 0,05 betraktas som en signifikant skillnad mellan kontroll bakbenet och lymfödem bakben. n (antal observationer) = 12.
Figur 5 och tabell 5 visar den genomsnittliga bakdelen av alla tre kombinerade experiment. Tabell 5 visar att användningen av detta förfarande resulterar i statistiskt signifikanta lymfödem som varar i minst 8 veckor. Data från de första 6 veckorna, är de kombinerade mätningarna av 31 möss från experiment 1, 2 och 3. I vecka 7 − 8 hade vi bara data från experiment 1 och 2, vilket resulterade i kombinerade mätningar från 19 möss.
Figur 5: kombinerad medelvärde för bakextremitets volym: experiment 1, 2 och 3. Trettioen möss inkluderade i de första 6 veckorna efter operationen och 19 möss inkluderade i de följande 2 veckorna. Detta diagram visar de genomsnittliga bakextremiteterna i mm3 under de 8 veckorna efter operationen. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Felstaplarna representerar SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vecka | Lymfödem volym i mm3 (vecka 1 − 6 n = 31) (Vecka 7 − 8 n = 19) |
Kontroll volym i mm3 (vecka 1 − 6 n = 31) (Vecka 7 − 8 n = 19) |
P-värde | 95% konfidensintervall |
| 1 | 230,00 ± 34,46 | 135,99 ± 16,03 | < 0,001 | 78.19 − 109.84 |
| 2 | 228,90 ± 40,91 | 136,13 ± 6,32 | < 0,001 | 70.47 − 115.07 |
| 3 | 211,83 ± 41,15 | 138,09 ± 6,36 | < 0,001 | 51.53 − 95.95 |
| 4 | 190,63 ± 25,81 | 139,62 ± 6,54 | < 0,001 | 38.15 − 63.87 |
| 5 | 182,70 ± 21,52 | 143,62 ± 7,79 | < 0,001 | 28.36 − 49.79 |
| 6 | 182,98 ± 19,11 | 150,66 ± 8,36 | < 0,001 | 22.18 − 42.47 |
| 7 | 180,34 ± 19,31 | 154,43 ± 9,60 | < 0,001 | 11.61 − 40.22 |
| 8 | 173,04 ± 16,42 | 151,89 ± 9,19 | < 0,001 | 10.35 − 31.94 |
Tabell 5: Sidaks multipla jämförelser test: experiment 1, 2 och 3 kombinerade. Denna tabell visar den statistiska jämförelsen mellan de genomsnittliga volymerna av inducerad lymfödem bakbenen och kontrollera bakbenen av 31 möss under de första 6 veckorna efter operationen och 19 möss under de följande 2 veckorna. Alla möss fick en dos på 10 Gy bestrålning före och efter operationen. Värden presenteras som: medelvärde ± SD i mm3. P-värde < 0,05 betraktas som en signifikant skillnad mellan kontroll bakbenet och lymfödem bakben. n (antal observationer) = 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns några kritiska steg i det här protokollet. För det första är det viktigt att forskarna vidtar säkerhetsåtgärder vid arbete med radioaktivitet. För det andra, under den kirurgiska delen av detta protokoll, är det viktigt att inleda förfarandet när musen har sövda och avsluta det utan onödiga pauser. Detta är viktigt för att undvika en överdrivet lång kirurgisk period för djuret och för att förhindra att anestesi förlorar effekt under operationen. Det rekommenderas att endast administrera en bolusinjektion av bedövningsmedel och slutföra kirurgiska ingrepp i ett sammanträde. Det är också ett kritiskt steg, att inte administrera för mycket Patentblått V, som överskott Patentblått V kommer att missfärgar vävnaden som omger lymfkärlen. Om den omgivande vävnaden blir missfärgad kan det vara nästan omöjligt att visualisera lymfkärlen och detta äventyrar förfarandet. Även om man lyckas visualisera lymfkärlen, den missfärgade vävnaden kommer att göra det svårt att bedöma om patentet blå V passerar proximalt till ligatur eller inte. Detta är problematiskt eftersom operatören måste vara säker på att de placerade ligaturer är bromsande lymfflödet, för att säkerställa att förfarandet kommer att lyckas. Det är också viktigt att lämna ett mellanrum på 2 − 3 mm när såret stängs. Som en tillfällig hud gap behövs ofta för att efterlikna den mänskliga sårläkningsprocessen29.
Begränsningarna med denna metod är att det är en tidskrävande förfarande som kräver tillgång till ett mikroskop och tidigare mikrokirurgisk utbildning. När du utför den kirurgiska delen av detta protokoll, är det viktigt att planera tiden mellan de kirurgiska ingrepp. Mycket tid går i väntan på att djuret ska bedra, rakning bakbenen och allmänt förbereda sig för varje kirurgiskt ingrepp. Därför, det rekommenderas att förbereda bostäder och bedövningsmedel i förväg. Det är viktigt att notera att för att vara säker på att kroniska lymfödem har inducerats, histopatologi måste analyseras. Vi har inte inkluderat histopatologi i denna artikel, vilket är en begränsning. Utan histopatologi stödja det faktum att histologiska förändringar har hänt med lymfkärlen förändringarna i volym i bakbenen kan endast beskrivas som ödem. Artikeln som innehåller alla data om de fyra möss från experiment 126 inkluderar histopatologi och visar att det fanns betydande förändringar i histopatologin med hjälp av denna teknik. Artikeln innehåller även lymfatisk avbildning. Samma förfarande användes på möss i experiment 2 och 3, men histopatologin visade ingen signifikant skillnad mellan lymfödem bakben och kontroll bakbenet i dessa experiment. Ytterligare studier inklusive histopatologi behövs för denna modell för att klargöra om lymfödem induceras på en histologisk nivå. Experiment 2 och 3 har ännu inte offentliggjorts och vi kan därför inte hänvisa till dem.
Medan du använder μct skanningar för att mäta bakdelen volym kan hävdas vara mer objektiva än att använda metoden vatten förskjutning eller omkretsriktningen mätningar, har det fortfarande sina begränsningar. Mättekniken är dyr, tidskrävande och kräver tillgång till en μCT-skanner och analysprogramvara.
En av de största utmaningarna med gnagare lymfödem modeller i allmänhet, har spontana lymfödem upplösning, om inte överdriven strålning utfördes25. När vi utvecklade denna modell, testade vi flera olika doser av strålning för att hitta en dos som skulle framkalla varaktig lymfödem utan att orsaka allvarlig morbiditet26. Tidigare, lymfödem modeller har inte standardiserats i metoderna för lymfödem induktion eller resultat bedömningar. Oashi et al.20 använde en engångsdos av 30 Gy bestrålning, och och ligaturer varje lymfkärl på tre separata punkter. I denna studie, det kirurgiska ingreppet tog 90 min att utföra. Även om den metod som presenteras i denna artikel kan anses tidskrävande, kan den kirurgiska delen av förfarandet fortfarande utföras ungefär dubbelt så snabbt som den metod som presenteras av Oashi et al.20. De hade också en uppföljningsperiod på 6 månader, vilket är betydligt längre än någon av de studier som presenteras i denna artikel. Men de inkluderade bara en mus och de manuellt uppmätta lem omkrets för att bedöma svullnad, medan de volymer som presenteras i denna artikel mättes på 31 möss med hjälp av μCT skanningar och 3D-analysprogramvara. Komatsu et al.30 avlägsnade ljumsk lymfkörtlar och tillhörande perifera lymfkärlen och fettvävnad med hjälp av en elektrisk kniv. Med hjälp av en elektrisk kniv kan vara en enklare metod som inte kräver mikrokirurgisk träning, men det inducerade ödem lösas efter dag 4 medan den metod som presenteras i denna artikel erbjuder konsekvent lymfödem varar minst 8 veckor.
Detta protokoll kommer förhoppningsvis att göra det möjligt för forskare att överväga begränsningarna och fördelarna med den reviderade lymfödem modellen. Protokollet bör också hjälpa forskare att framgångsrikt replikera modellen. Metoden kan användas i framtida observationella och interventionella studier för att förstå patofysiologin i lymfödem och forskning roman behandlingsalternativ. I framtida studier, det skulle också vara intressant att ha en uppföljning längre än 8 veckor att observera hur länge det inducerade lymfödem varar. Det skulle också vara intressant att iaktta effekten av att utföra mer riktad bestrålning av möss före och efter operationen. Detta kan göras genom att utföra en datortomografi och planera en mål volym. I framtida studier kan denna modell också stödjas av fluorescensstyrd lymfatisk avbildning, perometri eller bioimpedansstudier. Denna metod erbjuder statistiskt signifikanta lymfödem varar minst 8 veckor, som har mätts direkt via CT volumetrisk i tre separata experiment av olika bly utredare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Peter bollen, chef för biomedicinska laboratoriet för utlåning av utrustning som behövs för att spela in materialet sett genom Mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. , Springer International Publishing. New York, NY. 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment? Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R. 3rd, Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H.
- Gutknecht, M., et al.
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs' limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O'Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats' limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
