Summary
여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.
Abstract
당사는 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 차세대 시퀀싱 테크놀로 기, 치료 표적 분석 및 약물 반응 모니터링을 결합한 표적 치료법의 효능을 테스트하기 위한 통합 접근법을 소개합니다. 이 전략은 예로 난소 종양을 사용하여 검증되었습니다. 메이트 쌍 차세대 시퀀싱(MpPseq) 프로토콜은 구조적 변화를 식별하는 데 사용되었으며, 그 다음에는 잠재적으로 표적화 가능한 변경에 대한 분석이 뒤따랐습니다. 면역 절제된 마우스에서 자란 인간 종양은 게놈 분석에 기초하여 선택된 약물로 처리되었다. 결과는 PDX 모델에서 예측된 응답과 관찰된 응답 사이의 좋은 상관 관계를 보여 주었다. 제시된 접근은 조합 처리의 효험을 시험하고 재발성 암을 가진 환자를 위한 개인화한 처리를 돕기 위하여 이용될 수 있습니다, 표준 치료가 실패하고 라벨 떨어져 약을 사용할 필요가 있는 경우에 특히.
Introduction
환자 종양 조각을 면역형 마우스로 이식하여 발생하는 환자 유래 이종이이식(PDXs)은 개인화된 항암 치료를 돕기 위한 강력한 전임상 모델로 부상하고 있다. PDX 모델은 다양한 인간 악성 을 위해 성공적으로 개발되었습니다. 여기에는 유방 및 난소암, 악성 흑색종, 대장암, 췌장 선암 및 비소세포 폐암1,,2,,3,,4,5가5포함됩니다. 종양 조직은 정형소 또는 이종학적으로 이식될 수 있다. 전자, 더 정확 하지만 기술적으로 어려운 간주, 종양 기원의 기관에 직접 이식 을 포함. 이러한 유형의 모델은 종양6,,7에대한 "자연적인' 미세 환경으로 인해 원래 종양의 조직학을 정확하게 모방하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 마우스 난소의 부르사내로의 교정 이식은 종양이 복막 구멍으로 보급되고, 난소암8의전형적인 아분담의 생산으로 종양이 보급되었다. 유사하게, 복부 유방 선 대신 흉부로 유방 종양의 주입은 PDX 성공률 및 행동9에영향을 미쳤다. 그러나, 치열 교정 모형은 종양 성장을 감시하기 위하여 정교한 화상 진찰 시스템을 요구합니다. 고형 종양의 이종화 이식은 전형적으로 종양 성장을 쉽게 모니터링할 수 있고 비용이 적게소요되는7인 마우스의 피하 측면에 조직을 이식하여 수행됩니다. 그러나, 종양은 기립성이식(10)의경우와 달리 피하로 성장했다.
이식성공률은 종양 유형에 따라 다양하고 크게 의존하는 것으로 나타났다. 종양 세포의 더 높은 백분율을 포함하는 더 공격적인 종양 및 조직 견본은 더 나은 성공률12,,13가있기 위하여 보고되었습니다. 이와 일치, 전이성 부위에서 파생된 종양은 50-80%의 주파수에서 이식하는 것으로 나타났으며, 1차 부위에서 온 종양은 14%12로낮은 주파수에서 이식하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 괴사 세포를 포함하는 조직 및 더 적은 실행 가능한 종양 세포가 제대로 이식합니다. 종양 성장은 또한 원래 종양의 특성을 손상시키지 않고마우스(14)로 주입될 때 조직 혼합에 지하 막 매트릭스 단백질을 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 이식을 위한 조직 조각의 크기와 수는 또한 이식의 성공률에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 더 큰 종양 테이크 비율은 원래 종양 기질을 유지하고 숙주 기질 세포를 제공하기 위해 서브 신장 캡슐의 능력에 의한 피하 이식에 비해 하위 신장 캡슐에서 이식을 위해 보고되었다15.
대부분의 연구는 NOD/SCID 면역 결핍 마우스를 사용, 이는 자연 킬러 세포 부족16 다른 균주에 비해 종양 engraftment, 성장 및 전이를 증가 표시 되었습니다14. 그러나,13세의3-4개월 초에 흉림프종을 개발할 수 있기 때문에 추가 모니터링이 필요하다. SCID 마우스에서 자란 난소 종양 이식에서, B 세포의 아웃성장은 림프종의 발달을 방지하지만 난소종양(17)의이식에 영향을 미치지 않고 리툭시맙에 의해 성공적으로 억제되었다.
최근에는 NSG(NOD) Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)마우스는 인터류신 2 수용체 감마사슬(18)을코딩하는 유전자에서 null 돌연변이를 운반하여 PDX 모델의 생성에 자주 사용되는 변형이 되었다. 마우스의 미래 세대로 항통과된 PDX 모델으로부터종양은 3~6세대19,,20대에대한 조직학적 및 분자 특성을 유지하는 것으로 보고된다. 수많은 연구는 PDX 모델에서 처리 결과가 그들의 해당 환자의 그(것)들을 모방한다는 것을 보여주었습니다2,,33,4,,21,,22,,23. 비소폐암 및 대장암에 대한 PDX 모델에서 화학요법에 대한 반응률은 동일한약물(24,,25)에대한 임상 시험과 유사했다. 임상시험에 등록된 환자를 위해 개발된 PDX 모델에서 실시한 연구는 해당 환자에서 임상적으로 관찰된 약물과 유사한 테스트된 약물에 대한 반응을입증했다 2,,3,,4.
PDX 모델과 함께 환자 종양의 높은 처리량 게놈 분석은 특정 게놈 변경과 치료 반응 사이의 상관 관계를 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 이들은 몇 가지 간행물26,,27에설명되었습니다. 예를 들어, EGFR 증폭을 운반하는 대장 PDX 모델 세트에서 EGFR 억제제 cetuximab에 대한 치료 반응은환자(28)에서cetuximab에 대한 병렬 임상 반응이다.
PDX 모델의 개발 및 적용과 관련된 몇 가지 과제가 있습니다. 그 중 종양 이질성(29)은29PDX30 내의 증식 능력이 높은 단일 세포 클론으로서 처리 반응 해석의 정확도를 손상시킬 수 있어 다른세포(31)를능가할 수 있으므로 이질성의 손실을 초래한다. 추가적으로, 단 하나 종양 생검이 PDX를 개발하기 위하여 이용될 때, 세포 인구의 몇몇은 놓칠 수 있고 최종 이식에서 표현되지 않을 것입니다. 동일한 종양에서 여러 샘플이 문제를 해결하기 위해 이식하는 것이 좋습니다. PDX 종양은 원래 기증자 종양의 모든 세포 유형을 포함하는 경향이 있지만, 이러한 세포는 점차적으로 뮤린 기원3의사람들에 의해 대체된다. PDX 모형에 있는 뮤린 스트로마와 인간 종양 세포 사이 상호 작용은 잘 이해되지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 기질 세포는 종양미세환경(33)을재구성하는 것으로 나타났다.
이러한 제한에도 불구하고 PDX 모델은 환자 치료를 선택하기 위한 맞춤형 의학뿐만 아니라 번역 연구를위한 가장 가치있는 도구 중 하나입니다. PDX의 주요 응용 프로그램은 바이오 마커 발견 및 약물 테스트를 포함한다. PDX 모델은 또한 성공적으로 약물 내성 메커니즘을 연구하고 약물 저항을 극복하기위한 전략을 식별하는 데사용된다 34,,35. 본 원고에 기재된 접근법은 연구원이 인간 종양에 있는 잠재적인 치료 표적을 확인하고 생체내에서 대응하는 약의 효험을 평가하는 것을허용합니다, 처음에 genomically 특징이 었던 이식된 종양을 품고 있는 마우스에서. 프로토콜은 인과간 이식된 난소 종양을 사용하지만 마우스2,,3,,12에서성장하기에 충분히 공격적인 종양의 모든 유형에 적용가능하다.
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Protocol
난소암을 가진 동의한 환자에게서 새로운 조직은 메이요 클리닉 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수술을 해독하는 시간에 수집되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 동물 절차 및 치료는 메이요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 동물 관리 지침을 따랐습니다.
1. 메이트 쌍 시퀀싱 및 분석
참고: 신선하거나 플래시가 고정된 조직은 메이트 쌍(MPeq) 시퀀싱에 사용해야 합니다. 파라핀 임베디드 물질은 단편화된 DNA를 포함하기 때문에 적합하지 않습니다.
- 냉동 종양 조직에서 DNA를 분리합니다. 수술 물질 또는생검(36)에서얻은 원래 인간 표본을 사용한다.
- 차세대 시퀀서에 차선당 2개의 샘플로 MPeq 라이브러리 및 서열을 만들기 위해 DNA 1000 ng를 사용합니다(재료 표참조)36.
- 알고리즘 세트를 사용하여 데이터를 분석하여 이전36,,37에설명된 바와 같이 큰 염색체 수차(삭제, 삽입, 증폭, 반전 및 전좌)를 감지한다.
2. 치료 대상 의 선택
- 오픈 액세스 팬더 도구(경로 및 주석) 또는 유사한 도구를 사용하여 대상 변경(http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda)을 식별합니다.
- 표준 허용 된 유전자 기호를 사용하여 간단한 탭 분리 파일로, 변경된 MSeq에 의해 확인된 유전자의 목록을 확인합니다.
참고: 포함된 예제는 증폭 및 이득에 대한 분석을 특징으로 합니다. - 테이블 헤더가 소프트웨어의 경로 수준 보기로 전송되도록 목록의 헤더 줄에 "#" 기호를 추가합니다.
- 업로드 어음 세트 탐색 탭을 클릭하여 파일을 업로드합니다.
- 메뉴에서 단일 아이콘을 할당하여 선택한 아이콘을 클릭한 다음 최종 탭을 클릭하여 기본 데이터를 나타냅니다.
- 별표 파일이 업로드된 후 경로당 부음 유전자 수를 표시하는 열을 식별합니다. 오른쪽의 마지막 열입니다.
- 메인 창의 왼쪽 상단에 있는 통로 필터를 사용하여 관심 있는 유전자를 포함하는 경로를 표시합니다.
- 우연히 예상되는 것보다 더 많은 부가 된 유전자가있는 경로를 식별합니다. 보강 탭 아래에 있는 함수를 사용합니다.
- 메인 창 왼쪽에 있는 적절한 아이콘(예: DGIdb, PharmGKB)을 확인하여 사전 설정 기여에서 잠재적으로 약물이 가능한 유전자를 표시하는 데이터베이스를 선택합니다.
- 경로 뷰어 페이지에 표시된 이름을 클릭하여 시각화할 경로를 선택합니다.
참고: 각 음권 세트를 나타내는 아이콘은 관련 유전자 옆에 표시됩니다. 관심 유전자를 클릭하여 해당 GeneCards 웹 페이지를 엽니다. - 관심의 인가 유전자를 보여 준 경로를 선택 (즉, 주어진 종양에서 변경) 및 추가 분석을위한 잠재적 인 약물에 대한 "안타".
- 표준 허용 된 유전자 기호를 사용하여 간단한 탭 분리 파일로, 변경된 MSeq에 의해 확인된 유전자의 목록을 확인합니다.
- 임상 적용(https://clinicaltrials.gov/)을 위해 승인된 약물을 함유한 데이터베이스를 사용하여 확인된 표적을 상호 참조한다.
- 특정 유형의 종양의 생물학과 관련성을 확인하기 위해 문헌 검토(예: PubMed)를 수행하여 PDX 모델에서 추가 검사를 위한 표적 변경의 우선 순위를 지정합니다.
3. PCR 및 Sanger 시퀀싱에 의한 게놈 재배열 검증
- MPeq 데이터에서 얻은 시퀀싱 읽기를 사용하여 프라이머를 디자인합니다.
- MVPeq 분석을 기반으로 유효성 검사(즉, 잠재적 치료 대상)에 대한 관심 접합을 선택합니다.
- 앰플리시온이 접합을 포함할 수 있도록 방향적으로 프라이머를 디자인합니다. 접합의 각 측면에 2 프라이머를 설계하여 총 4개씩 접합을 증폭시킬 확률을 높입니다.
참고: 케이스 및 염색체 위치에 따라 프라이머의 이름 입니다. - 프라이머 디자인과 선택한 소프트웨어에 표준 PCR 매개 변수를 사용합니다. 용융 온도(60-62°C)와 GC 함량(40-60%)을 선택합니다. 프라이머 시퀀스가 프라이머 디머, 팔린드롬 또는 헤어핀 루프를 형성하지 않는지 확인합니다.
- 프라이머 서열이 BLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)를 사용하여 확인하여 인간 게놈의 다른 영역에 동성애가 부족하다는 것을 확인한다.
- 관심의 교차를 증폭하기 위해 PCR을 실행합니다.
- 프라이머를 물로 10mM로 희석하고 각 프라이머의 10mL를 결합하여 각 포워드 프라이머와 각 리버스 프라이머를 프라이머 믹스에 결합합니다.
참고: 선택한 예제의 프라이머에 대한 시퀀스는 표 1에표시됩니다. - 라벨 0.2 mL 스트립 튜브: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 및 T4 어디 C=제어 인간 게놈 DNA (상업), T=종양 DNA, 환자 또는 PDX 종양으로부터 분리, 그리고 숫자는 프라이머 믹스를 나타냅니다.
- 각 프라이머 믹스 1mL을 라벨이 붙은 튜브에 넣습니다.
- 표 2에나열된 시약을 결합하여 타크 마스터믹스를 준비하여 필요한 때까지 냉동실에 효소를 남기고 마지막에 믹스에 추가합니다.
- 2 마스터 믹스를 확인, 각 템플릿 DNA에 대한 하나, 인간의 DNA와 종양 DNA를 제어. 각 Taq 마스터 믹스24mL을 각 스트립 튜브에 추가합니다. 총 반응 량은 25mL입니다. 소용돌이는 매우 짧게 스트립 튜브를 아래로 회전.
- 열순환기에서 PCR을 실행합니다. 표 3에 표시된 매개 변수를 사용합니다. 프라이머의 용융 온도보다 적어도 1 °C 더 추워지 않도록 어닐링 온도를 조정합니다.
- 완성된 PCR 제품을 -20°C(장기)에 저장하거나 필요할 때까지 4°C(단기)로 냉장 보관하십시오.
- 1-5 V/cm에서 전기 전도를 수행하여 1.5% 아가로즈 젤을 사용하여 PCR 제품을 시각화합니다. Sanger 시퀀싱에 사용할 제품의 2mL 알리쿼트를 둡니다.
- 프라이머를 물로 10mM로 희석하고 각 프라이머의 10mL를 결합하여 각 포워드 프라이머와 각 리버스 프라이머를 프라이머 믹스에 결합합니다.
- Sanger 시퀀싱을 수행하여 접합을 확인하고 정확한중단점(38)을식별합니다.
- PCR이 단일 제품(대역)을 생성한 경우 PCR 제품을 사용합니다. 또는, 젤에서 밴드를 잘라, 정화 및 증폭에 사용되는 프라이머와 함께 Sanger 시퀀싱에 대한 제출.
참고: 유전체 분석이 수행된 종양은 마우스의 이식에 사용됩니다.
- PCR이 단일 제품(대역)을 생성한 경우 PCR 제품을 사용합니다. 또는, 젤에서 밴드를 잘라, 정화 및 증폭에 사용되는 프라이머와 함께 Sanger 시퀀싱에 대한 제출.
4. 종양 이식 및 유지 보수
- PDX 마우스 모형으로 종양을 이식하는 준비를 설치합니다. 유전체 분석이 수행되거나 수행된 이식 종양을 선택합니다.
- 전용 실험실 및 동물 시설, 숙련된 기술 직원 및 상세한 표준 운영 절차를 포함한 모든 PDX 모델 개발이 시작될 때 지원 인프라가 마련되어 있는지 확인하십시오.
- 속도는 세포 생존력과 성공적인 이식에 매우 중요하기 때문에 표본의 신속한 운송 및 처리를 보장하십시오.
- 멸균 환경을 사용하여 세균 및 곰팡이 오염을 감소시키고 시편을 이식합니다.
- 잠재적으로 생체 내성 물질에 관한 제도적 정책에 따라, 혈액 매개 병원균을 품을 수 있기 때문에 인간의 표본을 주의 깊게 처리하십시오.
- 20mL의 조직 배양 배지를 가진 사전 냉각된 50mL 튜브에 수술용 표본을 넣어 이식을 위한 조직(0.5-0.7 cm 크기)을 준비한다.3
참고: 종양 조직은 이전에 냉동 보존된 물질5에서신선하거나 회복될 수 있다. - 병리학자와 상담하여 시편의 종양 함량을 확인합니다.
- 종양 조직을 감기 PBS의 10-15mL 또는 항생제를 함유하는 RPMI 1640 또는 DMEM과 같은 조직 배양 배지(1% 페니실린 및 연쇄절제술)를 포함하는 접시에 놓는다.
- 병리학자의 도움으로 인접한 정상 및 괴사 조직에서 실행 가능한 종양 물질을 식별하고 분리합니다. 멸균 집게와 메스를 사용하여 병리학자가 지적한 괴사 물질을 제거하십시오.
참고: 종양은 마우스로 복경구 또는 피하로 이식될 수 있다. 4.2단계를 따라 복막 이식을 수행하거나 4.3단계로 건너뛰어 피하 이식을 수행한다. 이 연구에서는, 게놈 분석에 근거를 둔 표적으로 한 치료는 복막 이식을 가진 높은 급성 난소암을 위한 PDX 모형의 시리즈에서 시험되었습니다.
- 멸균 집게와 얼음에 메스를 가진 조직을 다진 인트라보네아(IP) 이식조직을 준비하여 약 1-1.5mm3크기의 조각을 만들고 냉기 배지와 혼합한다. 16-17 게이지 바늘을 사용하여 종양 슬러리의 0.3-0.5 mL을 주입하십시오.
참고: 모든 수술 절차는 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 멸균 장갑, 멸균 기구, 소모품 및 이식 된 물질이 감염 가능성을 줄이기 위해 사용되었습니다.- 조각 1:1을 얼음-차가운 배양 배지와 혼합하고 적어도 3개의 암컷 SCID 마우스에 100mL내과 회음하여 주입한다.
- 멸균 집게, 메스 또는 수술 가위를 사용하여 피하 이식을 위한 종양 조직을 작은 조각으로 자르고, 약 2 x 2 x 2mm 크기로, 조각난 조직을 얼음 위에 미리 차가운 페트리 접시로 옮춥니다.
- 차가운 지하 막 매트릭스를 조각난 조직(조직 10개당 약 200mL)으로 접시에 넣고 잘 섞어 10분 동안 차가운 지하 막 매트릭스에 적재합니다.
- 5 명의 여성 NOD / SCID 마우스를 마취하여 이식을 준비합니다.
- 각 마우스를 케타민(150 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg) 조합으로 각 마우스를 인트라페톤으로 주입합니다.
- 마우스가 외상성 집게로 꼬리 끝을 꼬집어 제대로 마취되어 있는지 확인합니다.
- 챔버에서 부드럽게 완전히 마취 된 마우스를 제거하고 마우스에 기화기의 입력과 폐 가스 청소 시스템에서 출력이있는 코 콘을 마우스에 놓습니다.
- 마취 하에 건조를 방지하기 위해 마우스 눈에 수의사 연고를 넣습니다. 수술이 수행될 영역을 준비합니다. 무균 기술을 사용하여 수술을 수행하십시오.
- 수술이 수행될 표면이 다공성, 밀봉되지 않았는지, 수술 전에 폐화되는지 확인하십시오.
- 멸균 (오토 클레이브, 가스 또는 화학 살균에 의해) 기기로 수술을 시작합니다.
- 장갑을 사용하여 기기를 처리하고 수술 단계 사이에 에탄올에 침수하여 절차 전반에 걸쳐 악기 팁의 멸균을 유지합니다.
- 요오드와 알코올의 3 교대 스크럽을 적용하여 수술 부위를 살균. 멸균 수술 가위와 집게를 사용하여 마우스 양쪽 측면에 5-10mm 수직 피부 절개를 합니다.
- 피하 공간에 직선 포셉을 부드럽게 삽입하여 종양 단편이 지방 패드 아래에 배치될 수 있을 만큼 큰 포켓을 만듭니다.
- 멸균 직선 집게를 사용하여 5개의 마우스 각각에 이전에 준비된 주머니에 종양 조각을 삽입합니다.
참고: 한 주머니에 종양 조직의 3-4 조각을 놓습니다. - 조직 접착제를 사용하여 피부 절개를 닫습니다.
- 임포세포 증식을 억제하기 위해 이식 후 리툭시맙 100mL의 각 마우스를 내분하소서 주사한다.
- 마취에서 회복 될 때까지 약 20 분 동안 열 램프 아래에 마우스를 케이지에 넣습니다. 마우스 활력 징후를 모니터링하고 충분한 수분을 보장합니다.
- 마취에서 회복하고 음식과 물을 가지고 시작한 후 다른 마우스의 회사에 마우스를 반환합니다. 기관 지침에 따라 수술 후 치료 및 모니터링을 제공합니다. 수술 후 3일 연속 매일 통증과 고통의 징후를 확인하십시오.
참고: 통증 이나 고민에 대 한 기준 괴 사 또는 궤 양, 체중 감소/신체 상태 점수, 활동 수준 등 행동 징후, 운동 기능 및 자세. - 종양이 캘리퍼에 의해 측정된 직경 0.5 cm의 크기에 도달할 때까지 정기적으로 종양 형성을 위한 마우스를 검사합니다.
- 각 마우스의 체력 점수를 모양, 동작 및 신체상태(39)에서파생된 것으로 평가한다. 이산화탄소 흡입에 의해 희생되는 moribund 마우스에 대한 기준으로 ≤6의 점수를 사용합니다.
5. PDX 모델에서 genomically 식별된 대상에 대한 응답 테스트
- 종양이 만져볼 수 있을 때 선택된 표적 처리를 시작하고 초음파 검사에 의해 측정된 대로 0.5 cm3에 도달하십시오.
- 복부의 초음파 스캔을 수행하기 전에 마우스 복부 모피를 제거하고 멸균 젤리 윤활제를 적용합니다.
- 트랜스듀서가 있는 초음파 기계를 사용하여 단면에 위치한 종양으로 이미지를 얻습니다. 각 동물당 세션당 3가지 측정값을 측정하고 종양 크기를 보다 정확하게 평가할 수 있도록 평균 값을 측정합니다.
- 사용 가능한소프트웨어(40)를사용하여 이미지를 분석합니다.
- 카보플라틴의 혼합물로 구성된 화학요법을 투여하여 51 mg/kg, 파클리탁셀은 4-6주의 총 치료 기간 동안 일주일에 한 번 15 mg/kg의 인트라피톤(IP)에서 카보플라틴을 투여한다. 주사의 총 부피가 0.2 mL를 초과하지 않는지 확인하십시오.
- MK-220641 스톡 용액을 30% 사이클로덱스트린(예: 캡티솔)으로 만들고 매일 120 mg/kg에서 4주 연속 경구 용품을 통해 배송한다.
- 마우스의 머리와 팔다리가 고정되도록 마우스를 뒤로 꼬집고 다시 고정하여 마우스를 고정하여 구강 개구부용 마우스를 준비합니다.
- 프로브가 식도에 도달할 때까지 마우스 목구멍 뒤쪽에 게이지 프로브를 삽입합니다. 마우스의 폐가 천공을 할 수 있기 때문에 프로브가 너무 멀리 삽입되지 않았는지 확인하여 사망을 유발합니다.
- 25 mg/mL에서 에탄올에 MK-866942 스톡 솔루션을 만듭니다. 5.2% Tween 80, 5.2% PEG400을 함유한 차량에 희석하여 IP 주사를 위한 멸균수로 5일 동안 10 mg/kg으로 총 치료 기간을 4주간 희석한다.
참고: 쥐에 주입된 부피는 동물의 체중에 따라 50-120mL여야 합니다. - 치료 군당 7-8마우스를 사용하여43,,44의차이를 감지하기에 충분한 통계적 힘을 갖도록 한다.
- 매일 치료에서 쥐의 체중과 일반적인 상태를 평가합니다. 동물의 체중이 초기 체중에서 20% 이상 떨어지면 약물을 보류하십시오.
- 초음파 스캐닝을 사용하여 매주 종양 크기를 평가합니다. 종양 성장의 모니터링을 수행하는 개인이 반응의 편견 점수를 보장하기 위해 치료에 눈이 멀게되는지 확인하십시오.
참고: 소규모 실험실은 치료 및 초음파 모니터링을 관리하기 위해 2 명의 다른 사람을 고용 할 수 있습니다.
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Representative Results
탈크 수술 시 절제된 난소 종양으로부터의 조직은 IRB 지침에 따라 수집되어 1) 게놈 특성화 및 2) 면역 절인 된 마우스에서 이식에사용되었다(도 1). 메이트 쌍 염기서열 분석프로토콜(36)37은 손실, 이득 및 증폭을 포함한 DNA의 구조적 변화를 식별하는 데 사용되었다., 한 종양(OC101로 지정된)에서 게놈 변화의 풍경을 보여주는 대표적인 게놈 플롯이 도 2에도시된다. 상급 장뇌 아형 종양에 전형적으로, 여러 이득(블루 라인) 및 삭제(red line)가 발견되었으며, 이는 높은 수준의 게놈 불안정뿐만 아니라 염색체 손실 및 이득을 나타내는, 부추증을 나타내는 것으로 관찰되었다. 평균 300-700변경합계는 고등급 세루 아형종양(45)에서확인된다. 후속 분석은 잠재적으로 임상 관련 약으로 표적으로 한 몇몇 DNA 변경을 밝혔습니다. OC101 종양에서 치료 개입에 대한 최상위 변경은 ERBB2(도2 및 도 3A)를포함하는 염색체 17에서 증폭되었다. ERBB2는 EGFR, HER3 또는 HER4로 이산화 시로 알려진 HER2 수용체에 대한 코드로 RAS/ERK 및 PI3K/AKT 신호 경로를 활성화하고 세포 성장, 세포 이동 및 침입을 촉진하는 유전자입니다. HER2 억제제(예를 들어, 단일클론 항체 pertuzumab 및 trastuzumab)는 종양이 HER2 단백질을 과발현할 때 유방암 환자 치료에 효과적입니다. 그러나 난소암에 대한 항 HER2 요법은 FDA승인되지 않습니다.
기증자 환자의종양(도 1)의게놈 프로파일을 해당 PDX 모델(도시되지 않음)의 비교는 PDX 유도체에 대한 원래 종양의 분자 근접성을 보고하는 모든 이전 연구와 일치하는 눈에 띄는 유사성을 드러냈습니다.
DNA 수준에서 의석 결과를 검증하기 위해, 특정 프라이머의 몇몇 세트는 ERBB2 유전자를 포함하는 증폭된 영역의 가장자리를 위해 설계되었고, PCR은 원래 종양으로부터 분리된 DNA뿐만 아니라 마우스에서 여러 세대에 전파된 종양으로부터 수행되었다. 도 3B에2개의 서로 다른 프라이머 세트를 이용한 증폭 제품의 대표적인 젤 이미지가 나타난다. ERBB 궤적의 증폭을 포함하지 않은 정상적인 풀게놈 DNA(C로 지정)가 증폭되었을 때 어떤 밴드도 검출되지 않았다. 젤및 생거 시퀀싱(도시되지 않음)으로부터 제품의 정제는 의원들에 의해 예측되는 변경을 더욱 확인했다. 추가 유효성 검사는 면역 블로팅을 사용하여 해당 PDX 종양에서 HER2 단백질의 발현을 검사함으로써 수행되었다. 분석은 ERBB2 유전자의 관찰된 증폭과 일치하는 HER2 단백질의 높은 수준을 드러냈다(결과는 도시되지 않음).
상이한 난소종양(지정 T14)의 DNA에서 수많은 지역적 이득이 관찰되었다. 그 포함 AKT2 및 RICTOR 유전자(그림 3C). 둘 다 AKT2와 mTOR의 억제제로 치료 관점에서 큰 관심을 했다, 어떤 RICTOR 연결, 사용할 수 있으며 현재 임상 시험에서. 어느 유전자의 부근에 걸쳐 짝 쌍 읽기가 없었기 때문에, 의원에 의해 검출된 이득의 간단한 PCR 검증은 가능하지 않았습니다. 따라서 우리는 면역 blotting에 의한 해당 단백질의 발현 수준을 테스트했습니다. AKT와 RICTOR의 높은 수준이 관찰되었다(그림 3D)표적 약물치료가 보증되는 것을 시사.
AKT 및 mTOR의 억제제에 대한 이 종양의 민감도를 테스트하기 위해, 인과간 이식된 T14 종양을 가진 PDX 마우스는 화학요법(카보플라틴/파클리파셀) 또는 범악악억제제 MK-220641 또는 mTOR 억제제 MK-869와 화학요법의 조합을 수신하기 위해 확장 및 무작위화되었다.42 화학요법은 표적 요법의첨가(도 4)를첨가하기 전에 2주 동안 조합암에서 마우스에게 주어졌다. 초음파 측정은 종양 회귀/성장을 감시하기 위하여 매주 취했습니다.
각 치료 팔에는 7개 이상의 마우스가 함유되어 있습니다. 이 숫자는 상당히 낮은 마크에 연구의 비용을 유지하면서 그룹 간의 응답의 차이를 관찰하기에 충분했다. 적은 마우스(3 개 4)는 종양 성장율의 개별 적인 변이가 무시할 수 있고 성장이 다른 무기에서 처리가 시작되는 종양 크기로 정상화되기 때문에, 대조군 처리되지 않은 단에서 이용될 수 있다.
관찰의 처음 3 주에서 화학 요법과 치료되지 않은 그룹 사이에 차이가 관찰되지 않았다 (표시되지 않음). 종양 부담의 현저한 감소(58% 중앙값)는 6주 말까지 화학요법 치료군에서 관찰되었다. 화학 요법에 대한 추가 혜택만으로도 표적 요법으로 화학 요법의 조합을 받은 그룹에서 관찰되었습니다. MK-8669(그림4A)와MK-2206(그림4B)의경우 4주차와 3주차에 차이가 나타났다.
동물은 안락사되었고 종양 조직은 7주차에 치료 시험이 끝날 때 치료 반응의 분자 분석을 위해 수집되었다. 이를 위해 총 및 인계 S6 키나아제(도5A,B),AKT 및 mTOR(도5C,D)의양은 면역블로팅을 사용하여 결정되었다. 리보소말 단백질 S6 키나아제는 AKT-mTOR 통로의 다운스트림 메신저로, 세포 생존과 성장을 촉진하기 위한 성장인자에 의한 AKT-mTOR 축의 자극에 따라 업 조절 및 인으로 알려져 있다. AKT 또는 mTOR 억제제를 받은 마우스에 대한 치료되지 않거나 화학요법 PDX 종양으로 치료되지 않은 이들 단백질의 수준을 비교한 결과, 분자 수준에서 표적 치료의 효과를 나타내는 후자2(도 5)에서현저한 감소를 보였다. 치료 연대에 대한 조정, 지금까지 결합 된 약물 및 치료 기간에 대한 응용 타이밍, 만들어 더 나은 응답을 달성하기 위해 테스트해야합니다.
| 프라이머 이름 | 시퀀스 | 프라이머 믹스 | 프라이머 결합 | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAA타가타가타가타가타가타가타가타가타카타타타타야트카타카캐크 | 1 | OC101 F1 및 R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACC타타타타그TTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 및 R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 및 R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCC타그GTCTCTATCCACTG | 4 | OC101 F2 및 R2 | ||
표 1: OC101 염색체 17 변경의 유효성 검사에 사용되는 프라이머.
| 시약 | 1 반응에 추가 하는 수량 (μL) | 4 반응 (μL)에 추가 하는 수량. 【 4.3로 곱하여 각 프라이머 믹스 (4)에 대해 충분히 만들 수 있습니다】 |
| 뉴클레아제 없는 물 | 20.45 | 89.94 |
| 10배 버퍼(이지 A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTP 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| 템플릿 DNA(농도 및 10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| 타크 폴리머라제 | 0.25 | 1.08 |
표 2: 접합의 유효성을 검사하기 위한 PCR 설정입니다.
| 온도 (C) | 시간 | |
| 94 | 5분 | |
| 94 | 40 s | 35사이클 |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2분 | |
| 72 | 5분 | |
| 4 | 개최 |
표 3: PCR의 자전거 이동 조건으로 접합의 유효성을 검사합니다.
그림 1: 장란성 난소 암에 대한 PDX 모델을 사용하여 genomically 유도 치료 테스트를위한 전략의 회로도 표현. 난소 종양의 H&E 염색이 도시되어 있습니다(상단). 배율 막대=100mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 의원을 이용한 난소 종양의 유전체 특성화. 구조 변경 및 복사 번호 변경의 풍경을 보여주는 게놈 플롯은 의원에 의해 감지된 바와 같이 변경됩니다. X 축은 염색체의 길이에 걸쳐 염색체 위치 번호가 표시됩니다. 각 염색체는 오른쪽 및 왼쪽 Y축에 표시됩니다. 각 염색체에 대한 수평 추적의 높이는 30k 베이스 쌍 창에 대해 감지된 읽기 수를 나타냅니다. DNA 사본 번호는 색상으로 표시되며, 회색은 일반 2N 카피 상태를 나타내며 삭제 및 청색-이득에 해당하는 빨간색이 있습니다. 검은 선을 연결하는 것은 염색체 재배열에 해당합니다. ERBB2 메뚜기의 변경이 묘사됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대상 변경 및 유효성 검사 선택입니다. (a)염색체 17(파란색)에 ERBB2 유전자의 증폭을 보여주는 도 1에 도시된 게놈 플롯의 클로즈업 세그먼트. 염색체 숫자는 표시된 대로 표시됩니다. (B)PCR 증폭을 이용하여 의원들이 확인한 ERBB2 궤적에서 의결점의 유효성 검사 분석. C는 풀로 된 게놈 DNA 대조군, OC101은 환자 종양으로부터의 DNA, M은 DNA 사다리이다. (C)AKT 궤적(상단)과 RICTOR 유전자(bottom)에서 이득을 나타내는 다른 난소 종양에 대한 게놈 플롯의 세그먼트클로즈.. 염색체는 표시된 대로. (D)PDX(T14)에서 종양 조직을 이용한 면역블로팅에 의한 AKT/mTOR 통로의 단백질 발현의 유효성 검사 분석, 총 단백질 및 특정 항체의 C.30 mg에서 AKT, RICTOR, p-mTOR에 묘사되는 게놈 변경이 사용되었다. MAPK는 로딩 컨트롤역할을 했습니다. Pos 콘은 양성 조절으로 사용되는 독립적인 종양이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 화학요법에 대한 반응의 비교는 AKT2 및 RICTOR 유전자에서 종양 항만에서 표적 요법과 결합되어 해당 약물을 갖는다. 화학요법과 항mTOR 약물 MK-8669(A) 또는A범AKT MK2206(B) 억제제의B조합에 대한 치료 반응은 화학요법에 만한다. 각 치료 및 지속 시간에 대한 투여 시간은 화살표에 의해 표시됩니다. 볼륨은 평균 +/- SD. 화학 요법으로 치료의 시작 시 초기 부피의 백분율로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 면역 벌팅 분석에 의해 결정된 각 처리에 의해 유도된 분자 변경의 비교. (a)S6 및 인-S6의 수준, AKT-mTOR 통로의 다운스트림 이펙터가 도시된다. S6 및 p-S6에 대한 총 단백질 및 특정 항체 30 mg이 사용되었다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. GAPDH 수준으로 정규화된 단백질 수치의 정량화는 면역블로팅에 의해 검출된 바와 같이 mTOR, p-mTOR, AKT 및 p-AKT의수준(B) (B)(C)수준에 도시된다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (D)GAPDH 수준으로 정규화된 단백질 수준의 정량화. NT는 치료되지 않으며, 화학 요법은 화학 요법입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 우리가 시험을 위한 약의 최상 선택을 결정하기 위하여 게놈 프로파일링에 의해 얻어진 종양의 분자 특성을 이용하는 PDX 모형에 있는 "임상 시험"을 수행하는 데 이용된 접근 및 프로토콜을 기술합니다. 다중 시퀀싱 플랫폼은 현재 전체 게놈 시퀀싱, RNAEq 및 사용자 정의 유전자 패널을 포함한 1 차 종양의 게놈 특성화에 사용됩니다. 고급 난소 암종의 경우, 구조적 변경, DNA 재배열 및 복사 번호 변경을 식별하는 Mpeq의 경우 이러한 유형의 종양에서 관찰된 높은 수준의 유전체 불안정성 때문에 특히 유용합니다. Mpeq 플랫폼의 두 번째 장점은 전체 게놈을 커버하지만 다른 포괄적 인 시퀀싱 기술보다 훨씬 적은 비용이 든다는 것입니다. 그러나 Mpeq는 기본 적용 범위가 충분하지 않기 때문에 포인트 돌연변이 검출에 적합하지 않으며 8-10배에 불과합니다. 종양의 게놈 특성화를 위해 혼자 의원을 사용하는 한계 중 하나는 복잡한 클러스터된 염색체 재배열의 존재이며, 그 중 분석은 관심있는 유전자의 발현을 예측하지 못한다. MPeq에 의해 검출된 접합은 프로모터 지역에서 프레임 시프트 또는 작은 삭제 및 삽입으로 인해 표현되지 않을 수 있습니다. 유사하게, 잠재적인 치료 표적을 위한 염색체 이득 및 증폭은 관심 있는 유전자의 발현을 보장하기 위하여 RNA 또는 단백질 수준에 주의 깊게 평가되고 검증되어야 합니다.
비록, 종양의 분자 메이크업은 주로 여러 세대에 대 한 쥐에서 전파 후 보존, 주요 유전자의 발 현 수준에 있는 변화는 종양 진화를 반영 하는 시간이 지남에 발생할 수 있습니다., 복제 선택 또는 murine 환경에 적응 반응. 따라서, 원래 기증자 종양과 PDX 종양 모두에서 치료 적 개입을 위한 변경의 유효성 검사는 매우 중요하다. PDX 모델으로부터 분리된 종양의 경우 RNA 및 단백질 모두 물질이 풍부하기 때문에 발현 수준을 심문하는 데 사용될 수 있다. 어느 쪽이든 저장된 조직의 가용성 및 유형, 및 해당 단백질 검출을 위한 항체의 가용성에 따라 원래 종양에서 발현을 교차 검사하도록 선택할 수 있다. PDX 모델은 생체 내 설정이 부작용의 모니터링뿐만 아니라 치료 요법의 투여 량 또는 기간 조정을 허용하므로 조합 요법을 테스트하는 데 특히 중요합니다.
정형소와 피하 이식 사이의 선택은 연구에서 다루어지는 특정 질문에 따라 이루어질 수 있습니다. 그러나, 이노이식 종양의 민감도가 이식부위(46)에의해 변조될 수 있다는 점을 명심하는 것이 중요하다. 한편, 정형소 모델에서 치료 반응을 보이고 있지만 피하로 이식된 PDX9에는존재하지 않는 약물의 발견에 대한 증거는 아직 보고되지 않았다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 실험을 수행하는 데 도움을 준 린 양 박사와 페이 R. 해리스 박사를 위한 메이요 클리닉 센터 (CIM) 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 개인화 의학 (CIM)에 대한 메이요 클리닉 센터에 씨와 부인 닐 E. 에클스의 선물에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
