Summary
Her presenterer vi en protokoll for å teste effekten av målrettede terapier valgt basert på genomisk sminke av en svulst. Protokollen beskriver identifisering og validering av strukturelle DNA-omorganiseringer, engraftment av pasientenes svulster i mus og testing av tiltak mot tilsvarende legemidler.
Abstract
Vi presenterer her en integrerende tilnærming for testing av effekt av målrettede terapier som kombinerer neste generasjons sekvensering av technolo-gies, terapeutiske målanalyser og overvåking av legemiddelrespons ved hjelp av pasientavledede xenografts (PDX). Denne strategien ble validert ved hjelp av ovarietumorer som et eksempel. Mate-pair neste generasjon sekvensering (MPseq) protokollen ble brukt til å identifisere strukturelle endringer og etterfulgt av analyse av potensielt målrettede endringer. Menneskelige svulster dyrket i immunkompromitterte mus ble behandlet med legemidler valgt basert på genomiske analyser. Resultatene viste en god sammenheng mellom de forventede og observerte svarene i PDX-modellen. Den presenterte tilnærmingen kan brukes til å teste effekten av kombinasjonsbehandlinger og hjelpe personlig behandling for pasienter med tilbakevendende kreft, spesielt i tilfeller der standardbehandling svikter, og det er behov for å bruke legemidler av etiketten.
Introduction
Pasientavledede xenografts (PDXs), som genereres fra implantasjon av pasientsvulststykker til immundefeksiale mus, har dukket opp som en kraftig preklinisk modell for å hjelpe personlig anti-kreftbehandling. PDX-modeller er utviklet for en rekke menneskelige maligniteter. Disse inkluderer brystkreft og eggstokkreft, malignt melanom, kolorektal kreft, bukspyttkjertelanokarsinom og ikke-småcellet lungekreft1,,2,,3,,4,5. Tumorvev kan implanteres ortopotopisk eller heterotopisk. Den tidligere, ansett som mer nøyaktig, men teknisk vanskelig, innebærer transplantasjon direkte inn i organet av tumoropprinnelse. Disse typer modeller antas å nøyaktig etterligne histologi av den opprinnelige svulsten på grunn av den "naturlige" mikromiljø for svulsten6,7. For eksempel resulterte ortotopisk transplantasjon i bursa av mus eggstokken i tumorspredning i bukhulen og produksjon av ascites, typisk for eggstokkreft8. På samme måte påvirket injeksjon av brystsvulster i thoraxen i stedet for bukm mammarykjertelen PDX-suksessraten ogatferden 9. Imidlertid krever ortotopiske modeller sofistikerte bildesystemer for å overvåke tumorvekst. Heterotopisk implantasjon av solid svulst utføres vanligvis ved å implantere vev i den subkutane flanken av en mus som gir lettere overvåking av tumorvekst og er billigere og tidkrevende7. Imidlertid dyrket svulster subkutant sjelden sjelden i motsetning til som observert i tilfelle av ortotopisk implantasjon10.
Suksessraten for engraftment har vist seg å variere og er sterkt avhengig av tumortypen. Mer aggressive svulster og vevsprøver som inneholder en høyere prosentandel av tumorceller ble rapportert å ha bedre suksessrater12,13. I samsvar med dette ble svulster avledet fra metastatiske steder vist å engraft ved frekvenser på 50-80%, mens de fra primære steder engraft på frekvenser så lavt som 14%12. I motsetning, vev som inneholder nekrotiske celler og færre levedyktige tumorceller engraft dårlig. Tumorvekst kan også fremmes ved tilsetning av kjellermembranmatriseproteiner i vevsblandingen på tidspunktet for injeksjonen i mus14 uten at det går på bekostning av den opprinnelige svulstens egenskaper. Størrelsen og antall vevsbiter beregnet for implantasjon ble også funnet å påvirke suksessraten for engraftment. Større tumor take-rater ble rapportert for implantasjon i sub-nyrekapselen sammenlignet med subkutan implantasjon på grunn av evnen til sub-nyrekapselen for å opprettholde den opprinnelige svulst stroma og gi verten stromal celler samt15.
De fleste studier bruker NOD/SCID immundefeksinasjonsmus, som mangler naturlige morderceller16 og har vist seg å øke tumoren, veksten og metastasen sammenlignet med andre stammer14. Ytterligere overvåking er imidlertid nødvendig da de kan utvikle thymiske lymfomer så tidlig som 3-4 måneder i alderen13. I ovarietumortransplantasjoner dyrket i SCID-mus, ble utveksten av B-celler vellykket hemmet av rituksimab, og forhindret utvikling av lymfomer, men uten å påvirke engraftment av ovarietumorer17.
Mer nylig, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mus, bærer en null mutasjon i genet koding interleukin 2 reseptor gamma kjede18, ble en ofte brukt belastning for generering av PDX-modeller. Svulster fra etablerte PDX-modeller som er til fremtidige generasjoner av mus, rapporteres å beholde histologiske og molekylære egenskaper i 3 til 6 generasjoner19,,20. Tallrike studier har vist at behandlingsutfallene i PDX-modeller etterligner de av deres tilsvarende pasienter2,3,4,21,22,23. Responsraten på kjemoterapi i PDX-modeller for ikke-små lungekreft- og kolorektalkarsinomer var lik den i kliniske studier for de samme legemidlene24,25. Studier utført i PDX-modeller, utviklet for pasienter som er inkludert i kliniske studier, viste respons på testede legemidler som ligner de som ble observert klinisk hos tilsvarende pasienter2,,3,,4.
Genomiske analyser med høy gjennomstrømning av en pasientsvulst sammen med PDX-modeller gir et kraftig verktøy for å studere korrelasjoner mellom spesifikke genomiske endringer og en terapeutisk respons. Disse er beskrevet i noen få publikasjoner26,27. For eksempel, terapeutiske responser på EGFR-hemmeren cetuximab i et sett med kolorektal PDX-modeller som bærer EGFR-forsterkning, parallelle kliniske responser på cetuximab hos pasienter28.
Det er noen utfordringer knyttet til utvikling og anvendelse av PDX-modeller. Blant disse er tumor heterogenitet29,30 som kan kompromittere nøyaktigheten av behandling respons tolkning som en enkelt celle klone med høyere proliferativ kapasitet i en PDX kan vokse de andre31, og dermed resulterer i tap av heterogenitet. I tillegg, når enkelt tumorbiopsier brukes til å utvikle PDX, kan noen av cellepopulasjonene bli savnet og vil ikke bli representert i det endelige transplantatet. Flere prøver fra samme svulst anbefales for implantasjon for å løse dette problemet. Selv om PDX svulster har en tendens til å inneholde alle celletyper av den opprinnelige donorsvulsten, blir disse cellene gradvis erstattet av de av murin opprinnelse3. Samspillet mellom murine stroma og menneskelige tumorceller i PDX-modeller er ikke godt forstått. Likevel ble stromale celler vist å rekapitulere tumor mikromiljø33.
Til tross for disse begrensningene er PDX-modellene fortsatt blant de mest verdifulle verktøyene for translasjonell forskning samt personlig medisin for valg av pasientbehandling. Store anvendelser av PDXs inkluderer biomarkør oppdagelse og narkotikatesting. PDX-modeller brukes også med hell til å studere resistensmekanismer og identifisere strategier for å overvinne resistens34,35. Tilnærmingen som er beskrevet i det nåværende manuskriptet gjør det mulig for forskeren å identifisere potensielle terapeutiske mål i menneskelige svulster og å vurdere effekten av tilsvarende legemidler in vivo, hos mus som huser transplanterte svulster som i utgangspunktet var genomisk karakterisert. Protokollen bruker ovarietumorer engrafted intraperitoneally men gjelder for alle typer svulster tilstrekkelig aggressiv til å vokse i mus2,3,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ferskt vev fra samtykkende pasienter med eggstokkreft ble samlet inn på tidspunktet for debulking kirurgi i henhold til en protokoll godkjent av Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Alle dyreprosedyrer og behandlinger som ble brukt i denne protokollen ble godkjent av Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og fulgte retningslinjene for dyrepleie.
1. Mate parsekvensering og analyser
MERK: Enten ferskt eller flashfrosset vev må brukes til parsekvensering av parkamerat (paresk. Parafin innebygd materiale er ikke egnet fordi den inneholder fragmentert DNA.
- Isoler DNA fra frosset tumorvev. Bruk original human prøve hentet fra kirurgisk materiale eller biopsi36.
- Bruk 1000 ng av DNA for å lage MPseq biblioteker og sekvens som 2 prøver per kjørefelt på neste generasjon sequencer (se Tabell over materialer)36.
- Analysere data ved hjelp av et sett med algoritmer for å oppdage store kromosomavvik (slettinger, innsettinger, forsterkninger, inversjoner og translokasjoner) som beskrevet tidligere36,37.
2. Valg av terapeutiske mål
- Bruk pandaverktøyet for åpen tilgang (Pathway and Annotation) eller et analogt verktøy for å identifisere målbare endringer (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- Lag en liste over gener som identifiseres av MSeq som endret, som en enkel tabulatordelt fil, ved hjelp av standard aksepterte gensymboler.
MERK: Det inkluderte eksemplet har analyse av forsterkninger og gevinster. - Legg til et "#" -tegn på overskriftslinjen i listen for å sikre at tabelloverskriften overføres til visningen av banensnivå for programvaren.
- Last opp filen ved å klikke på Navigasjon-fanen Last opp merknadssett.
- Tilordne ett enkelt ikon fra menyen for å representere de underliggende dataene Finalize ved å klikke på ikonet du velger, og deretter klikke fullfør-fanen.
- Når merknadsfilene er lastet opp, identifiserer du en kolonne som viser antall kommenterte gener per vei. Dette er den siste kolonnen til høyre.
- Bruk Pathway Filter øverst til venstre i hovedvinduet for å vise veier som inneholder gener av interesse.
- Identifiser veier som har flere kommenterte gener enn forventet ved en tilfeldighet. Bruk funksjonen som er plassert under Berikelse-fanen.
- Velg en database for å vise potensielt legemidler fra Forhåndsinnstillingsmerknad ved å sjekke et passende ikon til venstre for hovedvinduet (f.eks. DGIdb, PharmGKB).
- Velg vei for visualisering ved å klikke på navnet som vises på Pathway Viewer-siden.
MERK: Ikoner som representerer hvert merknadssett, vises ved siden av det tilknyttede genet. Klikk på genet av interesse for å åpne den tilsvarende GeneCards nettside. - Velg banene som viste de kommenterte genene av interesse (dvs. endret i en gitt svulst) og "treff" for potensielle legemidler for videre analyse.
- Lag en liste over gener som identifiseres av MSeq som endret, som en enkel tabulatordelt fil, ved hjelp av standard aksepterte gensymboler.
- Bruk en database som inneholder legemidler som er godkjent for klinisk bruk (https://clinicaltrials.gov/) til å kryssreferere de identifiserte målene.
- Prioriter målbare endringer for videre testing i PDX-modeller ved å utføre en litteraturgjennomgang (f.eks. PubMed) for å bekrefte relevansen til biologien til en bestemt type svulst.
3. Validering av genomiske omorganiseringer ved PCR- og Sanger-sekvensering
- Design primere ved hjelp av sekvensering leser hentet fra MPseq data.
- Velg et interesseknutepunkt for valideringen (dvs. potensielt terapeutisk mål) basert på parlamentsmedlemmer.
- Design primere retningsmessig slik at amplicon inneholder krysset. Design 2 primere på hver side av krysset, for totalt 4, for å øke sjansene for å forsterke krysset.
MERK: Navnprimere i henhold til saken og kromosomplasseringen. - Bruk standard PCR-parametere for primerdesign og en programvare du velger. Velg smeltetemperatur (60-62 °C) og GC-innholdet (40-60 %). Pass på at primersekvensen ikke danner primer dimers, palindromes eller hårnålsløkker.
- Bekreft at primersekvensen mangler homologi til andre områder av det menneskelige genomet ved å sjekke det ved hjelp av BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- Kjør en PCR for å forsterke krysset av interesse.
- Fortynn primere med vann til 10 mM og kombiner 10 ml av hver primer slik at hver fremover primer er parret med hver omvendt primer i en primer blanding.
MERK: Sekvenser for primere for det valgte eksemplet vises i tabell 1. - Etikett 0,2 ml stripe rør som: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 og T4 der C = kontrollere menneskelig genomisk DNA (kommersiell), T = Tumor DNA, isolert fra pasient eller PDX svulst, og nummeret indikerer primer blandingen.
- Tilsett 1 ml av hver primerblanding i de merkede rørene.
- Forbered Taq mastermix ved å kombinere reagenser oppført i tabell 2, og la enzymet stå i fryseren til det er nødvendig, og legg det til blandingen helt på slutten.
- Lag 2 master mikser, en for hver mal DNA, kontroll menneskelig DNA og tumor DNA. Tilsett 24 ml av hver Taq master mix til sin respektive stripe rør. Det totale reaksjonsvolumet er 25 ml. Vortex veldig kort og deretter spinne stripen røren ned.
- Kjør en PCR i en termosyklus. Bruk parameterne som vises i tabell 3. Juster glødetemperaturen slik at den er minst 1 °C kaldere enn smeltetemperaturen til primerne.
- Oppbevar det ferdige PCR-produktet ved -20 °C (lang sikt) eller oppbevares i kjøleskap ved 4 °C (kort sikt) til det er nødvendig.
- Utfør elektroforese ved 1-5 V/cm for å visualisere PCR-produktet ved hjelp av en 1,5 % agarosegel. La 2 ml aliquot av produktet brukes til Sanger sekvensering.
- Fortynn primere med vann til 10 mM og kombiner 10 ml av hver primer slik at hver fremover primer er parret med hver omvendt primer i en primer blanding.
- Utfør Sanger-sekvensering for å bekrefte krysset og identifisere det nøyaktige avbruddspunktet38.
- Bruk PCR-produktet hvis PCR genererte ett enkelt produkt (bånd). Alternativt kan du kutte båndet ut av gel, rense og sende inn for Sanger sekvensering sammen med primeren som brukes til forsterkning.
MERK: Svulstene som genomiske analyser ble utført for, brukes deretter til implantasjon hos mus.
- Bruk PCR-produktet hvis PCR genererte ett enkelt produkt (bånd). Alternativt kan du kutte båndet ut av gel, rense og sende inn for Sanger sekvensering sammen med primeren som brukes til forsterkning.
4. Tumor engraftment og vedlikehold
- Sett opp preparater for å registrere svulster i PDX-musemodeller. Velg for engraftment svulster som genomiske analyser vil være eller har blitt utført.
- Sørg for at en støttende infrastruktur er på plass på tidspunktet for starten av utviklingen av eventuelle PDX-modeller, inkludert dedikerte laboratorie- og dyreanlegg, dyktige tekniske medarbeidere og detaljerte standard driftsprosedyrer.
- Sørg for rask transport og behandling av prøver som hastighet er avgjørende for celle levedyktighet og vellykket engraftment.
- Bruk et sterilt miljø for å redusere bakteriell og soppkontaminering for behandling og engrafting av prøver.
- Håndter menneskelige prøver med forsiktighet, i samsvar med institusjonelle retningslinjer for potensielt biohazardous materialer, da de kan huse blodbårne patogener.
- Forbered vevet (0,5-0,7 cm3 i størrelse) for engraftment ved å sette den kirurgiske prøven i et forhåndskjølt 50 ml rør med 20 ml vevskulturmedier.
MERK: Tumorvevet kan friskes eller gjenopprettes fra tidligere kryopreservert materiale5. - Bekreft tumorinnholdet i prøven ved å konsultere en patolog.
- Plasser tumorvevet i en tallerken som inneholder 10-15 ml kald PBS, eller vevskulturmedier som RPMI 1640 eller DMEM som inneholder antibiotika (1% penicillin og streptomycin).
- Identifiser ogisoler levedyktig tumormateriale fra tilstøtende normalt og nekrotisk vev ved hjelp av en patolog. Bruk sterile tang og skalpell for å fjerne nekrotisk materiale påpekt av en patolog.
MERK: Svulsten kan implanteres enten intraperitonealt eller subkutøst inn i musene. Følg trinn 4.2 for å utføre en intraperitoneal implantasjon eller hopp til trinn 4.3 for å utføre en subkutan engraftment. I denne studien ble målrettede behandlinger valgt basert på genomiske analyser testet i en rekke PDX-modeller for høygradig serøs eggstokkreft med intraperitoneal implantasjon.
- Forbered vevet for intraperitoneal (IP) implantasjon mincing vevet med sterile tang og en skalpell på is for å lage stykker ca 1-1,5 mm3 i størrelse og blanding med kald kultur medium. Injiser 0,3–0,5 ml tumorslam ved hjelp av en 16-17 gauge nål.
MERK: Alle kirurgiske prosedyrer utføres ved hjelp av aseptiske teknikker. Sterile hansker, sterile instrumenter, forsyninger og implanterte materialer ble brukt til å redusere sannsynligheten for infeksjon.- Bland bitene 1:1 med iskaldt kulturmedium og injiser 100 ml intraperitonealt i minst tre kvinnelige SCID-mus.
- Skjær tumorvevet for subkutan engraftment ved hjelp av sterile tang, skalpell eller kirurgisk saks i små fragmenter, omtrent 2 x 2 x 2 mm i størrelse, og overfør det fragmenterte vevet til en forhåndskjølt Petri-tallerken på is.
- Tilsett den kalde kjellermembranmatrisen i parabolen med det fragmenterte vevet (ca. 200 ml per 10 stykker vev), bland godt, og la vevfragmentene suge i den kalde kjellermembranmatrisen i 10 min.
- Bedøv 5 kvinnelige NOD/SCID-mus for å forberede dem på engraftment.
- Injiser hver mus intraperitonealt med ketamin (150 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) kombinasjon.
- Kontroller at musen er riktig bedøvet ved å klemme halespissen med atraumatiske tang.
- Fjern forsiktig fullt bedøvet mus fra kammeret og sette på musen en nese kjegle som har inngang fra fordamper og produksjon fra avfallsgass scavenging system.
- Sett veterinær salve på museøyne for å hindre tørrhet mens under anestesi. Forbered området der operasjonen vil bli utført. Bruk aseptisk teknikk for å utføre operasjonen.
- Sørg for at overflaten som operasjonen skal ta er ikke-porøs, forseglet og desinfiseres før operasjonen.
- Start kirurgi med sterile (ved autoklav, gass eller kjemisk sterilisering) instrumenter.
- Bruk hansker til å håndtere instrumenter og opprettholde steriliteten til instrumentspisene gjennom hele prosedyren ved å senke dem ned i etanol mellom operasjonstrinn.
- Steriliser operasjonsstedet ved å bruke 3 vekslende skrubber av jod og alkohol. Bruk steril kirurgisk saks og tang for å lage et 5-10 mm vertikalt hudsnitt på begge flankene av en mus.
- Sett inn rette tang forsiktig inn i det subkutane rommet for å skape en lomme som er stor nok til at et tumorfragment kan plasseres under fettputen.
- Bruk de sterile rette tangene til å sette inn tumorfragmenter i tidligere forberedt lomme i hver av 5 mus.
MERK: Legg 3-4 stykker tumorvev i en lomme. - Lukk hudsnittene ved hjelp av vevlim.
- Injiser hver mus intraperitonealt med 100 ml Rituksimab etter implantasjon for å hemme lymfocytterproliferasjon.
- Plasser musen i et bur under en varmelampe i ca. 20 minutter til den er gjenopprettet fra anestesi. Overvåk musens vitale tegn og sikre tilstrekkelig hydrering.
- Returner musen til selskap med andre mus etter at den gjenopprettet fra anestesi og begynte å ha mat og vann. Gi postoperativ omsorg og overvåking i henhold til institusjonelle retningslinjer. Se etter tegn på smerte og nød daglig i 3 påfølgende dager etter operasjonen.
MERK: Kriterier for smerte eller nød inkluderer nekrose eller sårdannelse, vekttap/kroppstilstandsscoring, atferdstegn som aktivitetsnivå, motorisk funksjon og holdning. - Kontroller rutinemessig musene for tumordannelse annenhver uke til svulstene når størrelsen på 0, 5 cm i diameter målt ved en kaliper.
- Vurder helsepoengsummen til hver mus som avledet fra utseende, atferd og kroppstilstand39. Bruk score på ≤ 6 som kriterier for at moribundmus skal ofres ved karbondioksidinnånding.
5. Testing av tiltak mot genomisk identifiserte mål i PDX-modeller
- Start de valgte målrettede behandlingene når svulstene er håndgripelige og når 0, 5 cm3 målt ved en ultralydsskanning.
- Før du utfører en ultralydskanning av magen, fjern musmagen og påfør sterilt gelésmør.
- Bruk en ultralydmaskin med en transduser for å få bilder med svulsten plassert i tverrsnitt. Gjør 3 målinger per økt for hvert dyr og gjennomsnittlig verdien for en mer nøyaktig vurdering av tumorstørrelse.
- Analyser bildene ved hjelp av tilgjengelig programvare40.
- Administrer kjemoterapi bestående av en blanding av karboplatin ved 51 mg/kg og paklitaksel ved 15 mg/kg intraperitonealt (IP) én gang i uken i en total behandlingsvarighet på 4-6 uker. Kontroller at det totale injeksjonsvolumet ikke overstiger 0,2 ml.
- Lag en MK-220641 lagerløsning i 30% cyklodekstrin (f.eks Captisol) og lever via oral gavage ved 120 mg/kg daglig i 4 påfølgende uker.
- Forbered musen for oral gavage ved å holde den ved å klemme huden på ryggen og feste den tilbake, slik at musens hode og lemmer er immobilisert.
- Sett gavage-sonden ned baksiden av halsen på musen til sonden når spiserøret. Pass på at sonden ikke er satt inn for langt, da musens lunger kan perforere, noe som forårsaker død.
- Lag en MK-866942 lagerløsning i etanol ved 25 mg/ml. Fortynn det i et kjøretøy som inneholder 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 i sterilt vann til IP-injeksjoner ved 10 mg/kg i 5 dager annenhver uke, med en total varighet av behandlingen av 4 uker.
MERK: Volumet som injiseres i mus, skal være 50-120 ml, avhengig av dyrets vekt. - Bruk 7-8 mus per behandlingsgruppe for å ha nok statistisk kraft til å oppdage forskjeller43,,44.
- Vurder kroppsvekt og generell tilstand av musene i terapi daglig. Hold tilbake narkotika hvis et dyrs vekt faller 20% eller mer fra deres opprinnelige vekt.
- Vurder tumorstørrelsen ukentlig ved hjelp av ultralydskanning. Sørg for at den enkelte som utfører overvåkingen av tumorveksten, er blindet for behandlingen for å sikre objektiv skåring av svar.
MERK: Mindre laboratorier kan ansette 2 forskjellige personer til å administrere behandling og ultralydovervåking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vev fra resected ovarietumorer på tidspunktet for debulking operasjoner ble samlet inn i samsvar med IRB veiledning og brukes for 1) genomisk karakterisering og 2) engraftment i immunkompromitterte mus (Figur 1). Mate-pair sekvensering protokoll36,37 ble brukt til å identifisere strukturelle endringer i DNA inkludert tap, gevinster og forsterkninger. Et representativt genomplott som illustrerer et landskap av genomiske endringer i en svulst (utpekt som OC101) er vist i figur 2. Typisk for høyverdige serøse subtypesvulster, flere gevinster (blå linjer) og slettinger (røde linjer) ble funnet, noe som indikerer høye nivåer av genomisk ustabilitet, samt kromosomale tap og gevinster, som indikerer aneuploidy, ble observert. I gjennomsnitt er 300-700 endringer totalt identifisert i høygradig serøs subtype svulster45. Senere analyser viste noen DNA-endringer som potensielt var målbare med klinisk relevante legemidler. Den topprangerte endringen for terapeutisk inngrep i OC101-svulsten var en forsterkning ved kromosom 17 som involverte ERBB2 (figur 2 og figur 3A). ERBB2 er et gen som koder for HER2 reseptor som er kjent ved dimerisering med EGFR, HER3 eller HER4 for å aktivere RAS / ERK og PI3K / AKT signalveier og fremme cellevekst, cellemigrasjon og invasjon. HER2-hemmere (f.eks. monoklonale antistoffer pertuzumab og trastuzumab) er effektive i behandling av brystkreftpasienter når svulster overuttrykker HER2-proteinet. Anti-HER2 terapi for eggstokkreft, men er ikke FDA godkjent.
Sammenligning av genomisk profil av donorpasienters svulst (figur 1) til en tilsvarende PDX-modell (ikke vist) viste en slående likhet, i samsvar med alle tidligere studier som rapporterte molekylær nærhet av originale svulster til deres PDX-derivater.
For å validere parlamentsmedlemmerqresultater på DNA-nivå, ble flere sett med spesifikke primere designet for kantene av forsterket region som inneholder ERBB2-genet, og PCR ble utført ved hjelp av DNA isolert fra den opprinnelige svulsten, samt fra en svulst som forplantes i flere generasjoner i musene. Et representativt gelbilde av forsterkede produkter ved hjelp av to forskjellige sett med primere er vist i figur 3B. Ingen bånd ble oppdaget da normal samlet genomisk DNA (utpekt som C), som ikke inneholdt forsterkning av ERBB-locus, ble forsterket. Rensing av produktene fra gel og Sanger sekvensering (ikke vist) ytterligere bekreftet endringen spådd av Parlamentsmedlemmer. Videre validering ble utført ved å undersøke uttrykket av HER2-protein i den tilsvarende PDX-svulsten ved hjelp av immunoblotting. Analysen viste et høyt nivå av HER2 protein (resultatet er ikke vist), i samsvar med observert forsterkning av ERBB2 genet.
I DNA av en annen ovarietumor (utpekt T14) ble det observert mange regionale gevinster. De inkluderte AKT2- og RICTOR-gener (figur 3C). Begge var av stor interesse fra et terapeutisk perspektiv som hemmere av AKT2 og mTOR, som RICTOR forbinder med, er tilgjengelige og for tiden i kliniske studier. Siden det var ingen kompis par leser som strekker seg over nærheten av noen av genene, enkel PCR validering av gevinsten som oppdaget av Parlamentsmedlemmereq var ikke mulig. Vi testet derfor uttrykksnivået for tilsvarende proteiner ved immunoblotting. Høye nivåer av AKT og RICTOR ble observert (figur 3D) som tyder på at behandling med målrettede legemidler er berettiget.
For å teste følsomheten til denne svulsten til hemmere av AKT og mTOR, ble PDX-mus med intraperitonealt implantert T14-svulst utvidet og randomisert til å bare få kjemoterapi (karboplatin/paklitaksel) eller en kombinasjon av kjemoterapi med pan-AKT-hemmer MK-220641 eller mTOR-hemmer MK-866942. Kjemoterapi ble gitt til mus i kombinasjonsarmen i 2 uker før tilsetning av målrettet behandling (figur 4). Ultralydmålinger ble tatt ukentlig for å overvåke tumorregresjon / vekst.
Hver behandlingsarm inneholdt ikke mindre enn 7 mus. Dette tallet var tilstrekkelig til å observere forskjeller i svar mellom gruppene samtidig som kostnadene ved studien ble betydelig lavere. Færre mus (tre til fire) kan brukes i kontrollen ubehandlet gruppe, som individuelle variasjoner i tumorvekst rate er ubetydelig og veksten normaliseres til en tumorstørrelse der behandlingen i andre armer begynner.
Det ble ikke observert noen forskjell mellom cellegiftbehandlede og ubehandlede grupper i løpet av de første 3 ukene med observasjon (ikke vist). En signifikant reduksjon av tumorbyrden (58 % median) ble observert i kjemoterapigruppen innen utgangen av uke 6. En ekstra fordel over kjemoterapi alene ble observert i grupper som fikk en kombinasjon av kjemoterapi med målrettet behandling. Forskjellen ble tydelig i uke 4 og 3 for MK-8669 (figur 4A) og MK-2206 (figur 4B).
Dyr ble eutanisert og tumorvev ble samlet inn for molekylære analyser av behandlingsrespons ved slutten av behandlingsstudien i uke 7. For dette formål ble mengdene av total og fosforsatt S6 kinase (figur 5A,B),AKT og mTOR (figur 5C,D) bestemt ved hjelp av immunoblotting. Ribosomalt protein S6 kinase er en nedstrøms budbringer av AKT-mTOR-banen, kjent for å være oppregulert og fosforforatert ved stimulering av AKT-mTOR-aksen ved vekstfaktorer for å fremme celleoverlevelse og vekst. Sammenligning av nivåene av disse proteinene i ubehandlede eller behandlet med kjemoterapi PDX svulster til mus som fikk AKT eller mTOR hemmere viste en markert reduksjon i de to sistnevnte (figur 5), noe som indikerer effektiviteten av målrettet terapi på molekylært nivå. Justeringer av behandlingsregimentet, når det gjelder søknadstid for de kombinerte legemidlene og behandlingsvarigheten, bør gjøres og testes for å oppnå bedre respons.
| Primer navn | Sekvens | Primer Mix | Primere kombinert | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 og R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTAGTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 og R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG (NÆR GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG) | 3 | OC101 F2 og R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 og R2 | ||
Tabell 1: Primere som brukes til validering av OC101chromosome 17-endringen.
| Reagens | Antall som skal legges til for 1 reaksjon (μL) | Antall som skal tilføres for 4 reaksjoner (μL). [Multipliser med 4,3 for å gjøre nok for hver primerblanding (4)] |
| Nukleasefritt vann | 20.45 | 89.94 |
| 10x buffer (enkel A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Mal DNA (konsentrasjon >10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymerase | 0.25 | 1.08 |
Tabell 2: PCR-oppsett for å validere et veikryss.
| Temp (C) | Tid | |
| 94 | 5 min. | |
| 94 | 40 s | 35 sykluser |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 min. | |
| 72 | 5 min. | |
| 4 | Holde |
Tabell 3: Sykkelforhold for PCR for å validere et veikryss.
Figur 1: Skjematisk representasjon av strategien for genomstyrt terapitesting ved hjelp av PDX-modeller for serøs ovariekarsinom. H & E farging av ovarietumor er vist (topp). Skala bar = 100 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Genomisk karakterisering av ovarietumorer ved hjelp av MPseq. Genomplott som viser landskapet av strukturelle endringer og kopinummerendringer som oppdaget av Parlamentsmedlemmer. X-aksen strekker seg over lengden på kromosomet med kromosomposisjonsnummer vist. Hvert kromosom er angitt på høyre og venstre Y-akse. Høyden på de horisontale sporene for hvert kromosom indikerer antall leser oppdaget for 30k base par vinduer. DNA-kopinumre indikeres med farge, med grå som representerer normal 2N-kopitilstand, rød som tilsvarer slettinger og blå-til-gevinster. Koble svarte linjer tilsvarer kromosomale omorganiseringer. Endringer på ERBB2 locus er avbildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Valg av målbare endringer og validering. (A) Et nærbilde av genomplottet vist i Fig.1 som illustrerer en forsterkning av ERBB2-genet på kromosom 17 (i blått). Kromosomtall er som angitt. (B) Valideringsanalyse av avbruddspunkter ved ERBB2-locus som identifisert av MPseq ved hjelp av PCR-forsterkning. C er en samlet genomisk DNA-kontroll, OC101 er DNA fra pasientsvulst, M er en DNA-stige. (C) Et nærbilde av segmenter av genomplottet for en annen ovariesvulst som viser gevinster (indikert med blå linje) på AKT-locus (øverst) og på RICTOR-genet (nederst). Kromosomer er som angitt. (D) Valideringsanalyse av uttrykk for proteiner av AKT/mTOR-vei ved immunoblotting ved bruk av tumorvev fra PDX (T14), genomiske endringer som er avbildet i C. 30 mg totalt protein og spesifikke antistoffer mot AKT, RICTOR, p-mTOR ble brukt. MAPK fungerte som en lastekontroll. Pos con er en uavhengig svulst som brukes som en positiv kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sammenligningen av tiltak mot kjemoterapi alene og kombinert med målrettet behandling i tumor harboring gevinster ved AKT2 og RICTOR gener med tilsvarende legemidler. Behandlingsrespons på en kombinasjon av kjemoterapi og anti-mTOR-legemiddel MK-8669 (A) eller hemmer av pan-AKT MK2206 (B) versus kjemoterapi alene. Administrasjonstidspunktet for hver behandling og varigheten vises av pilene. Volumene uttrykkes som prosent av det første volumet ved behandlingsstart, da gjennomsnittlig +/- SD. Kjemo er kjemoterapi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Sammenligning av molekylære endringer fremkalt av hver behandling som bestemmes av immunoblottinganalyse. (A) Nivåer av S6 og fosfo-S6, nedstrøms effektor av AKT-mTOR banen er vist. 30 mg totalt protein og spesifikt antistoff til S6 og p-S6 ble brukt. GAPDH ble brukt som lastekontroll. Kvantifisering av proteinnivåer normalisert til GAPDH-nivå er vist i (B) (C) Nivåer av mTOR, p-mTOR, AKT og p-AKT som påvist ved immunoblotting. GAPDH ble brukt som lastekontroll. (D) Kvantifisering av proteinnivåer normalisert til GAPDH-nivå. NT behandles ikke, kjemo er kjemoterapi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver tilnærmingen og protokollene vi brukte til å gjennomføre en "klinisk studie" i PDX-modeller som utnytter molekylære egenskaper av svulsten som oppnådd ved genomisk profilering for å bestemme det beste valget av legemidler for testing. Flere sekvenseringsplattformer brukes for tiden til genomisk karakterisering av primære svulster, inkludert hele genomsekvensering, RNAseq og tilpassede genpaneler. For høygradig serøs ovariekarsinom er parlamentsmedlemmer for å identifisere strukturelle endringer, DNA-omorganiseringer og kopinummerendringer, spesielt nyttig på grunn av den høye graden av genomisk ustabilitet observert i denne typen svulst. Den andre fordelen med parlamentseq-plattformen er at den dekker hele genomet, men koster betydelig mindre enn andre omfattende sekvenseringsteknologier. Parlamentsmedlemmereq er imidlertid ikke egnet for punktmutasjonsdeteksjon, da grunndekningen ikke er tilstrekkelig, og når bare 8-10x. En av begrensningene ved å bruke Parlamentsmedlemmereq alene for genomisk karakterisering av en svulst er tilstedeværelsen av komplekse grupperte kromosomale omorganiseringer, analyse som ikke forutsier uttrykket av berørte gener av interesse. Et veikryss oppdaget av MPseq spådde å skape et antatt fusjonsgen som validerer i DNA av PCR, kan ikke uttrykkes på grunn av et rammeskift eller små slettinger og innsettinger i arrangørområdet. På samme måte bør kromosomale gevinster og forsterkninger for potensielle terapeutiske mål vurderes nøye og valideres på RNA- eller proteinnivå for å sikre uttrykk for interessegenet.
Selv om den molekylære make-up av svulsten er i stor grad bevart etter forplantning i mus i flere generasjoner, endringer i uttrykk nivåer av viktige gener kan oppstå over tid enten reflekterer tumor evolusjon, klonal seleksjon eller adaptiv respons på murine miljø. Dermed er validering av en endring beregnet for terapeutisk inngrep i både original donorsvulst og PDX-svulst kritisk. For tumor isolert fra PDX-modeller kan både RNA og protein brukes til å forhøre uttrykksnivået som materialet er rikelig. Enten kan man velges å krysssjekke uttrykket i den opprinnelige svulsten, avhengig av tilgjengeligheten og typen av det lagrede vevet, og tilgjengeligheten av antistoff for tilsvarende proteindeteksjon. PDX-modellen er spesielt uvurderlig i testing kombinasjonsbehandlinger som in vivo innstillingen tillater overvåking av bivirkninger, samt dosering eller varighet justeringer i behandlingsregimet.
Valget mellom ortotopisk og subkutan engraftment kan gjøres avhengig av de spesifikke spørsmålene som tas opp i studien. Det er imidlertid viktig å huske på at følsomheten til xenografted svulster til terapeutiske midler kan moduleres av implantasjonsstedet46. På den annen side er det ennå ikke rapportert bevis på oppdagelsen av legemidler som viser en terapeutisk respons i ortotopiske modeller, men fraværende i subkutant implantert PDX9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang og Faye R. Harris, MS, for hjelpen til å gjennomføre eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av Mr. og Mrs. Neil E. Eckles' Gift til Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
