Summary
Her præsenterer vi en protokol til at teste effekten af målrettede behandlinger udvalgt baseret på den genomiske makeup af en tumor. Protokollen beskriver identifikation og validering af strukturelle DNA-rearrangements, indpodning af patienters tumorer i mus og test reaktioner på tilsvarende lægemidler.
Abstract
Vi præsenterer her en integrativ tilgang til test af effekten af målrettede behandlinger, der kombinerer den næste generation sekventering technolo-gies, terapeutiske målanalyser og lægemiddelrespons overvågning ved hjælp af patient afledte xenografts (PDX). Denne strategi blev valideret ved hjælp af ovarietumorer som et eksempel. Mate-pair næste generation sekventering (parlamentsmedlemmereq) protokol blev brugt til at identificere strukturelle ændringer og efterfulgt af analyse af potentielt målbare ændringer. Humane tumorer dyrket i immunkompromitterede mus blev behandlet med lægemidler udvalgt baseret på de genomiske analyser. Resultaterne viste en god sammenhæng mellem de forventede og de observerede svar i PDX-modellen. Den præsenterede tilgang kan bruges til at teste effekten af kombinationsbehandlinger og støtte personlig behandling for patienter med tilbagevendende kræft, specielt i tilfælde, hvor standardbehandling mislykkes, og der er behov for at bruge lægemidler off label.
Introduction
Patient-afledte xenografts (PDXs), som er genereret fra implantation af patienten tumor stykker i immundefekt mus, har vist sig som en kraftfuld præklinisk model til støtte personlig anti-cancer pleje. PDX modeller er blevet udviklet med succes for en række menneskelige maligniteter. Disse omfatter brystkræft og kræft i æggestokkene, maligne melanom, kolorektal cancer, pancreas adenocarcinom, og ikke-småcellet lungekræft1,,2,,3,,4,5. Tumorvæv kan implanteres ortopisk eller heterotopisk. Førstnævnte, betragtes som mere præcise, men teknisk vanskeligt, indebærer transplantation direkte ind i orgel af tumor oprindelse. Disse typer af modeller menes at præcist efterligne histologi af den oprindelige tumor på grund af den "naturlige' mikromiljø for tumor6,7. For eksempel, orthotop transplantation i bursa af mus æggestok resulterede i tumor formidling i bughulen og produktion af ascites, typisk for kræft i æggestokkene8. Tilsvarende, injektion af bryst tumorer i brystkassen i stedet for abdominal mælkekirtlen påvirket PDX succesrate og adfærd9. Men, orthotop modeller kræver avancerede billeddannelse systemer til at overvåge tumorvækst. Heterotopisk implantation af solid tumor udføres typisk ved at implantere væv i den subkutane flanke af en mus, som giver mulighed for lettere overvågning af tumorvækst og er billigere og tidskrævende7. Men, tumorer vokset subkutant sjældent metastasere i modsætning til som observeret i tilfælde af orthotop implantation10.
Succesraten for engraftment har vist sig at variere og i høj grad afhænge af tumortype. Mere aggressive tumorer og væv prøver, der indeholder en højere procent af tumorceller blev rapporteret at have bedre succesrater12,,13. I overensstemmelse med dette, tumorer stammer fra metastatiske steder blev vist sig at indpode ved frekvenser på 50-80%, mens dem fra primære steder engraft ved frekvenser så lavt som 14%12. I modsætning hertil, væv, der indeholder nekrotiske celler og færre levedygtige tumorceller indpode dårligt. Tumorvækst kan også fremmes ved tilsætning af kældermembran matrix proteiner i vævsblandingen på tidspunktet for injektionen imus 14 uden at gå på kompromis med egenskaberne af den oprindelige tumor. Størrelsen og antallet af vævsstykker beregnet til implantation viste sig også at påvirke succesraten for engraftment. Større tumor take-rates blev rapporteret til implantation i sub-renal kapsel sammenlignet med subkutan implantation på grund af evnen af sub-renal kapsel til at opretholde den oprindelige tumor stroma og give værten stromale cellersamt 15.
De fleste undersøgelser bruger NOD / SCID immundefekt mus, som mangler naturlige dræberceller16 og har vist sig at øge tumor engraftment, vækst og metastase sammenlignet med andre stammer14. Men, yderligere overvågning er nødvendig, da de kan udvikle thymiske lymfomer så tidligt som 3-4 måned i alderen13. I ovarietumor transplantationer dyrket i SCID mus, udvækst af B-celler blev med held hæmmet af rituximab, forhindrer udviklingen af lymfomer, men uden at påvirke engraftment af æggestokkene tumorer17.
For nylig, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mus, der transporterer en null mutation i genet kodning interleukin 2 receptor gamma kæde18, blev en hyppigt anvendt stamme til generering af PDX modeller. Tumorer fra etablerede PDX modeller passageet til fremtidige generationer af mus er rapporteret at bevare histologiske og molekylære egenskaber for 3 til 6 generationer19,20. Talrige undersøgelser har vist, at behandlingsresultaterne i PDX-modeller efterligner resultaterne af deres tilsvarende patienter2,,3,,4,,21,,22,23. Responsraten på kemoterapi i PDX-modeller for ikke-små lungekræft og kolorektal karcinomer svarede til responsraten i kliniske forsøg med de sammelægemidler 24,25. Undersøgelser udført i PDX-modeller, der blev udviklet til patienter, der indgik i kliniske forsøg, viste respons på testede lægemidler svarende til dem, der blev observeret klinisk hostilsvarende patienter 2,,3,,4.
High-throughput genomiske analyser af en patient tumor i forbindelse med PDX modeller giver et kraftfuldt værktøj til at studere korrelationer mellem specifikke genomiske ændringer og en terapeutisk respons. Disse er beskrevet i nogle få publikationer26,27. For eksempel, terapeutiske reaktioner på EGFR-hæmmer cetuximab i et sæt af kolorektal PDX modeller transporterer EGFR forstærkning, parallelle kliniske reaktioner på cetuximab hos patienter28.
Der er et par udfordringer forbundet med udvikling og anvendelse af PDX-modeller. Blandt dem er tumor heterogenitet29,30, der kan kompromittere nøjagtigheden af behandling respons fortolkning som en enkelt celle klon med højere proliferativ kapacitet inden for en PDX kan vokse de andredem 31, hvilket resulterer i et tab af heterogenitet., Derudover, når enkelt tumor biopsier bruges til at udvikle PDX, nogle af de cellepopulationer kan blive savnet og vil ikke være repræsenteret i den endelige graft. Flere prøver fra samme tumor anbefales til implantation for at løse dette problem. Selvom PDX tumorer tendens til at indeholde alle de celletyper af den oprindelige donor tumor, disse celler er gradvist erstattet af dem af murine oprindelse3. Samspillet mellem murine stroma og menneskelige tumorceller i PDX modeller er ikke godt forstået. Ikke desto mindre, stromale celler blev vist sig at opsummere tumor mikromiljø33.
På trods af disse begrænsninger er PDX-modeller fortsat blandt de mest værdifulde værktøjer til translationel forskning samt personlig medicin til udvælgelse af patientbehandlinger. Større anvendelser af PDXs omfatter biomarkør opdagelse og drug test. PDX-modellerne anvendes også med succes til at undersøge lægemiddelresistenssmekanismer og identificere strategier til at overvinderesistens 34,35. Denfremgangsmåde, der er beskrevet i dette manuskript gør det muligt for forskeren at identificere potentielle terapeutiske mål i menneskelige tumorer og til at vurdere effekten af tilsvarende lægemidler in vivo , i mus huser indkapslet tumorer, som oprindeligt var genomisk karakteriseret. Protokollen bruger ovarietumorer engrafted intraperitoneally men gælder for enhver form for tumor tilstrækkeligt aggressiv til at vokse i mus2,,3,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Friske væv fra samtykkende patienter med kræft i æggestokkene blev indsamlet på tidspunktet for debulking kirurgi i henhold til en protokol godkendt af Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Alle dyreforsøg og behandlinger, der anvendes i denne protokol blev godkendt af Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og fulgte retningslinjer for dyrepleje.
1. Mate par sekvensering og analyser
BEMÆRK: Enten skal der anvendes frisk eller flashfrossen til parrepar (parlamentsmedlemmer) sekvensering. Paraffin indlejret materiale er ikke egnet, fordi det indeholder fragmenteret DNA.
- Isoler DNA fra frosset tumorvæv. Brug original humanprøve fremstillet af kirurgisk materiale eller biopsi36.
- Brug 1000 ng DNA til at gøre parlamentsmedlemmereq biblioteker og sekvens som 2 prøver pr vognbane på den næste generation sequencer (se Tabel over Materialer)36.
- Analyser data ved hjælp af et sæt algoritmer til at registrere store kromosomale afvigelser (sletninger, indsættelser, forstærkninger, inversioner og translokationer) som beskrevet tidligere36,37.
2. Udvælgelse af terapeutiske mål
- Brug værktøjet med åben adgang til panda (vej og anmærkning) eller et tilsvarende værktøj til at identificere målbare ændringer (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- Lav en liste over gener, der er identificeret af MSeq som ændret, som en simpel tabulatorsepareret fil, ved hjælp af standard accepterede gensymboler.
BEMÆRK: Det medfølgende eksempel indeholder en analyse af forstærkninger og gevinster. - Føj et "#"-tegn til overskriftslinjen på listen for at sikre, at tabeloverskriften overføres til visningen af pathway level for softwaren.
- Overfør filen ved at klikke på navigationsfanen Overfør anmærkningssæt.
- Tildel et enkelt ikon fra menuen for at repræsentere de underliggende data ved at klikke på ikonet foretrukne ikon og derefter klikke på fanen Færdiggør.
- Når anmærkningsfilerne er uploadet, skal du identificere en kolonne, der viser antallet af kommenterede gener pr. vej. Dette er den sidste kolonne til højre.
- Brug Pathway Filter øverst til venstre i hovedvinduet for at vise veje, der indeholder gener af interesse.
- Identificer veje, der har flere kommenterede gener end forventet ved en tilfældighed. Brug funktionen under fanen Berigelse.
- Vælg en database for at få vist potentielt druggable gener fra forudindstillet anmærkning ved at kontrollere et passende ikon til venstre for hovedvinduet (f.eks DGIdb, PharmGKB).
- Vælg den vej til visualisering ved at klikke på dens navn, der vises på siden Pathway Viewer.
BEMÆRK: Ikoner, der repræsenterer hvert anmærkningssæt, vises ved siden af det tilknyttede gen. Klik på genet af interesse for at åbne den tilsvarende GeneCards webside. - Vælg de veje, der viste de kommenterede gener af interesse (dvs. ændret i en given tumor) og "hits" for potentielle lægemidler til yderligere analyse.
- Lav en liste over gener, der er identificeret af MSeq som ændret, som en simpel tabulatorsepareret fil, ved hjælp af standard accepterede gensymboler.
- Brug en database, der indeholder lægemidler, der er godkendt til klinisk anvendelse (https://clinicaltrials.gov/) til at krydshenvisning af de identificerede mål.
- Prioriter målbare ændringer til yderligere test i PDX-modeller ved at udføre en litteraturgennemgang (f.eks.
3. Validering af genomiske omlægninger ved hjælp af PCR- og Sanger-sekvensering
- Design primere ved hjælp af sekventering læser fra parlamentsmedlemmereq data.
- Vælg et interesseknudepunkt for valideringen (dvs. det potentielle terapeutiske mål) baseret på parlamentsmedlemmers analyseer.
- Design primere retningsbestemt sådan, at amplicon indeholder krydset. Design 2 primere på hver side af krydset, for i alt 4, for at øge chancerne for at forstærke krydset.
BEMÆRK: Navn primere i henhold til sagen og kromosom placering. - Brug standard PCR-parametre til primerdesign og en software efter eget valg. Vælg smeltetemperatur (60-62 °C) og GC-indholdet (40-60 %). Sørg for, at primer sekvens ikke danner primer dimers, palindromes eller hårnål sløjfer.
- Bekræft, at primersekvensen mangler homologi til andre områder af det menneskelige genom ved at kontrollere det ved hjælp af BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- Kør en PCR for at forstærke interessekrydset.
- Primer fortyndes med vand til 10 mM og kombiner 10 ml af hver primer, så hver fremadgående primer parres med hver omvendt primer til en primerblanding.
BEMÆRK: Sekvenser for primere for det valgte eksempel vises i tabel 1. - Mærk 0,2 ml strimmelrør som: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 og T4, hvor C=kontrol humant genomisk DNA (kommercielt), T=Tumor DNA, isoleret fra patient- eller PDX-tumor, og tallet angiver primerblandingen.
- Der tilsættes 1 ml af hver primerblanding i de mærkede rør.
- Klargør Taq mastermix ved at kombinere reagenser, der er anført i tabel 2, og udlod enzymet i fryseren, indtil det er nødvendigt, og tilsæt det til blandingen til det sidste.
- Lav 2 master blandinger, en for hver skabelon DNA, kontrollere menneskelige DNA og tumor DNA. Der tilsættes 24 ml af hver Taq masterblanding til det respektive strimmelrør. Det samlede reaktionsvolumen er 25 ml. Vortex meget kort og derefter dreje strimlen røret ned.
- Kør en PCR i en termocycler. Brug de parametre, der er vist i tabel 3. Glødetemperaturen justeres, så den er mindst 1 °C koldere end primernes smeltetemperatur.
- Det færdige PCR-produkt opbevares ved -20 °C (lang sigt) eller nedkøles ved 4 °C (kort sigt), indtil det er nødvendigt.
- Udfør elektroforese ved 1-5 V/cm for at visualisere PCR-produktet ved hjælp af en 1,5% agarosegel. Lad 2 ml aliquot af produktet blive brugt til Sanger-sekvensering.
- Primer fortyndes med vand til 10 mM og kombiner 10 ml af hver primer, så hver fremadgående primer parres med hver omvendt primer til en primerblanding.
- Udfør Sanger-sekvensering for at bekræfte krydset og identificere det nøjagtige brudpunkt38.
- Brug PCR-produktet, hvis PCR genererede et enkelt produkt (bånd). Alternativt kan du skære båndet ud af gelen, rense og indsende til Sanger sekventering sammen med primer, der anvendes til forstærkning.
BEMÆRK: De tumorer, for hvilke genomiske analyser blev udført derefter anvendes til implantation i mus.
- Brug PCR-produktet, hvis PCR genererede et enkelt produkt (bånd). Alternativt kan du skære båndet ud af gelen, rense og indsende til Sanger sekventering sammen med primer, der anvendes til forstærkning.
4. Tumor engraftment og vedligeholdelse
- Opsæt forberedelser til at indpode tumorer i PDX musemodeller. Vælg for engraftment tumorer, for hvilke genomiske analyser vil blive eller er blevet udført.
- Sørg for, at der er en understøttende infrastruktur på plads, når der er oprettet PDX-modeller, herunder dedikerede laboratorie- og dyrefaciliteter, kvalificeret teknisk personale og detaljerede standardprocedurer.
- Sørg for hurtig transport og behandling af prøver, da hastighed er afgørende for cellernes levedygtighed og vellykket indpodning.
- Brug et sterilt miljø til at reducere bakterie- og svampeforurening til behandling og indpodning af prøver.
- Håndter humane prøver med forsigtighed i overensstemmelse med institutionelle politikker vedrørende potentielt biofarlige materialer, da de kan huse blodbårne patogener.
- Vævsvævet (0,5-0,7 cm3 i størrelse) klargøres ved at anbringe den kirurgiske prøve i et forkølet 50 ml-rør med 20 ml vævskulturmedier.
BEMÆRK: Tumorvævet kan være frisk eller inddrives fra tidligere kryopræserved materiale5. - Bekræft tumorindholdet i prøven ved at konsultere en patolog.
- Placer tumorvæv i en skål, der indeholder 10-15 ml kold PBS, eller væv kultur medier såsom RPMI 1640 eller DMEM indeholder antibiotika (1% penicillin og streptomycin).
- Identificer og isolere levedygtige tumor materiale fra tilstødende normale og nekrotiske væv med hjælp fra en patolog. Brug sterile fingre og skalpel til at fjerne nekrotisk materiale påpeget af en patolog.
BEMÆRK: Tumoren kan implanteres enten intraperitonealt eller subkutanely ind i musene. Følg trin 4.2 for at udføre en intraperitoneal implantation eller springe til trin 4.3 for at udføre en subkutan engraftment. I denne undersøgelse blev målrettede behandlinger udvalgt baseret på genomiske analyser testet i en række PDX-modeller for serøs kræft i æggestokkene af høj kvalitet med intraperitoneal implantation.
- Forbered vævet til intraperitoneal (IP) implantation hakke vævet med sterile tandbanker og en skalpel på is til at gøre stykker ca 1-1,5 mm3 i størrelse og blanding med kold kultur medium. Injicer 0,3-0,5 ml tumor gylle ved hjælp af en 16-17 gauge nål.
BEMÆRK: Alle kirurgiske indgreb udføres ved hjælp af aseptiske teknikker. Sterile handsker, sterile instrumenter, forsyninger og implanterede materialer blev brugt til at reducere sandsynligheden for infektion.- Bland stykkerne 1:1 med iskoldt kulturmedium og indsprøjt 100 ml intraperitonealt i mindst tre kvindelige SCID-mus.
- Skær tumorvævet til subkutan engraftment ved hjælp af sterile brystflæsk, skalpel eller kirurgisk saks i små fragmenter, ca. 2 x 2 x 2 mm i størrelse, og overfør det fragmenterede væv til en forkølet petriskål på is.
- Tilsæt den kolde kælder membran matrix i skålen med det fragmenterede væv (ca. 200 ml pr 10 stykker væv), bland godt, og lad vævet fragmenter lægges i blød i den kolde kælder membran matrix i 10 min.
- Anesthetize 5 kvindelige NOD / SCID mus til at forberede dem til engraftment.
- Injicer hver mus intraperitonealt med 150 mg/kg og xyazin (10 mg/kg) kombination.
- Bekræft, at musen er korrekt anesthetized ved at klemme halen spidsen med atraumatiske fingerperne.
- Fjern forsigtigt fuldt anesthetized mus fra kammeret og sætte på musen en næse kegle, som har input fra vaporizer og output fra affaldsgas skyllesystem.
- Sæt dyrlæge salve på musenøjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Forbered det område, hvor operationen vil blive udført. Brug aseptisk teknik til at udføre operationen.
- Sørg for, at den overflade, som operationen skal tage, er ikke-porøs, forseglet og desinficeres inden operationen.
- Start operation med sterile (ved autoklaver, gas eller kemisk sterilisation) instrumenter.
- Brug handsker til at håndtere instrumenter og opretholde steriliteten af instrumentet tips under hele proceduren ved nedsænkning dem i ethanol mellem kirurgi trin.
- Steriliser operationsstedet ved at anvende 3 vekslende krat af jod og alkohol. Brug steril kirurgisk saks og brystmusk til at lave et 5-10 mm lodret hudsnit på begge sider af en mus.
- Indsæt lige hamtninger forsigtigt ind i det subkutane rum for at skabe en lomme stor nok til et tumorfragment, der skal placeres under fedtpuden.
- Brug de sterile lige hæces til at indsætte tumorfragmenter i tidligere forberedt lomme i hver af 5 mus.
BEMÆRK: Placer 3-4 stykker tumorvæv i én lomme. - Luk huden indsnit ved hjælp af væv lim.
- Intraperitonealt injicere hver mus med 100 ml Rituximab efter implantation for at hæmme lymfocytpredning.
- Placer musen i et bur under en varmelampe i ca. 20 minutter, indtil den er kommet sig efter anæstesi. Overvåg musen vitale tegn og sikre dens tilstrækkelig hydrering.
- Returner musen til selskab med andre mus, efter at den er kommet sig efter anæstesi og begyndte at få mad og vand. Yde postoperativ pleje og overvågning i henhold til institutionelle retningslinjer. Kontroller for tegn på smerte og angst dagligt i 3 på hinanden følgende dage efter operationen.
BEMÆRK: Kriterier for smerte eller angst omfatter nekrose eller ulceration, vægttab / krop betingelse scoring, adfærdsmæssige tegn såsom aktivitetsniveau, motorisk funktion og kropsholdning. - Rutinemæssigt kontrollere mus for tumor dannelse bi-ugentligt, indtil tumorer nå størrelsen af 0,5 cm i diameter målt ved en caliper.
- Vurder hver muse helbredsscore som afledt af udseende, adfærd og kropstilstand39. Brug scorer på ≤6 som kriterier for, at døende mus kan ofres ved indånding af kuldioxid.
5. Test af svar på genomisk identificerede mål i PDX-modeller
- Start de udvalgte målrettede behandlinger, når tumorerne er håndgribelige og nå 0,5 cm3 målt ved en ultralydsscanning.
- Før du udfører en ultralydsscanning af maven fjerne musen abdominal pels og anvende sterile gelé smøremiddel.
- Brug en ultralydsmaskine med en transducer til at få billeder med tumoren placeret i tværsnit. Lav 3 målinger pr. session for hvert dyr og gennemsnitlige værdien for en mere præcis vurdering af tumorstørrelse.
- Analyser billederne ved hjælp af tilgængelig software40.
- Kemoterapi, der består af en blanding af carboplatin ved 51 mg/kg og paclitaxel ved 15 mg/kg intraperitonealt (IP) en gang om ugen i en samlet behandlingsvarighed på 4-6 uger. Sørg for, at det samlede volumen til injektion ikke overstiger 0,2 ml.
- Lav en MK-220641 lageropløsning i 30% cyclodextrin (f.eks.
- Forbered musen til oral sonde ved at holde den ved at klemme huden på ryggen og pinning det tilbage, således at hovedet og lemmer af musen er immobiliseret.
- Sæt sonden ned bag i musens hals, indtil sonden når spiserøret. Sørg for, at sonden ikke er indsat for langt, da musens lunger kan perforere og forårsage død.
- Lav en MK-866942 lageropløsning i ethanol ved 25 mg/ml. Det fortyndes i et køretøj, der indeholder 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 i sterilt vand til IP-injektioner ved 10 mg/kg i 5 dage hver anden uge, med en samlet varighed af behandlingen på 4 uger.
BEMÆRK: Volumen injiceres i mus bør være 50-120 ml, afhængigt af dyrets vægt. - Brug 7-8 mus pr. behandlingsgruppe til at have tilstrækkelig statistisk effekt til at påviseforskelle 43,44.
- Vurdere kropsvægt og generelle tilstand af mus i terapi dagligt. Tilbageholde narkotika, hvis et dyrs vægt falder 20% eller mere fra deres oprindelige vægt.
- Vurdere tumor størrelse ugentligt ved hjælp af ultralydsscanning. Sørg for, at den enkelte udfører overvågning af tumorvækst er blindet til behandling for at sikre den upartiske scoring af svar.
BEMÆRK: Mindre laboratorier kan ansætte 2 forskellige personer til at administrere behandling og ultralydovervågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Væv fra resected ovarietumorer på tidspunktet for debulking operationer blev indsamlet i overensstemmelse med IRB vejledning og anvendes til 1) genomisk karakterisering og 2) engraftment i immunkompromitterede mus (Figur 1). Mate-par sekventering protokol36,37 blev brugt til at identificere strukturelle ændringer i DNA herunder tab, gevinster og forstærkninger. Et repræsentativt genomplot, der illustrerer et landskab af genomiske ændringer i en tumor (angivet som OC101) er vist i figur 2. Typisk for høj kvalitet serøse subtype tumorer, flere gevinster (blå linjer) og sletninger (røde linjer) blev fundet, hvilket indikerer høje niveauer af genomisk ustabilitet, samt kromosomale tab og gevinster, tegn på aneuploidy, blev observeret. I gennemsnit 300-700 ændringer i alt er identificeret i høj kvalitet serøs subtype tumorer45. Efterfølgende analyser afslørede et par DNA-ændringer, der potentielt kunne målrettes med klinisk relevante lægemidler. Den højest rangerede ændring for terapeutisk intervention i OC101 tumor var en forstærkning ved kromosom 17 involverer ERBB2 (Figur 2 og Figur 3A). ERBB2 er et gen, der koder for HER2 receptor, som er kendt ved dimerization med EGFR, HER3 eller HER4 for at aktivere RAS / ERK og PI3K / AKT signalering veje og fremme cellevækst, celle migration og invasion. HER2-hæmmere (f.eks. monoklonale antistoffer pertuzumab og trastuzumab) er effektive til behandling af brystkræftpatienter, når tumorer overudtryker HER2-proteinet. Anti-HER2 behandling for kræft i æggestokkene, dog, er ikke FDA godkendt.
Sammenligning af donorpatients tumors genomprofil ( figur1) med en tilsvarende PDX-model (ikke vist) viste en slående lighed, i overensstemmelse med alle tidligere undersøgelser, der rapporterede den molekylære nærhed af originale tumorer til deres PDX-derivater.
For at validere parlamentsmedlemmereq resultater på DNA-niveau, flere sæt af specifikke primere blev designet til kanterne af forstærket region, der indeholder ERBB2 genet, og PCR blev udført ved hjælp af DNA isoleret fra den oprindelige tumor samt fra en tumor formeret i flere generationer i mus. Et repræsentativt gelbillede af forstærkede produkter med to forskellige sæt primere er vist i figur 3B. Der blev ikke fundet noget bånd, da det normale samlede genomiske DNA (udpeget som C), som ikke indeholdt forstærkning af ERBB-locus, blev forstærket. Rensning af produkterne fra gelen og Sanger sekvensering (ikke vist) yderligere bekræftet den ændring forudsagt af parlamentsmedlemmereq. Yderligere validering blev udført ved at undersøge ekspressionen af HER2 protein i den tilsvarende PDX tumor ved hjælp af immunblæsning. Analysen afslørede et højt niveau af HER2-protein (resultatet er ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med den observerede forstærkning af ERBB2-genet.
I DNA af en anden ovarietumor (udpeget T14) talrige regionale gevinster blev observeret. Disse omfattede AKT2- og RICTOR-gener (figur 3C). Begge var af stor interesse fra et terapeutisk perspektiv som hæmmere af AKT2 og mTOR, som RICTOR forbinder med, er tilgængelige og i øjeblikket i kliniske forsøg. Da der ikke var nogen mate par læser spænder over nærheden af enten gen, simpel PCR validering af gevinsten som opdaget af parlamentsmedlemmereq var ikke muligt. Vi testede derfor ekspressionniveauet for tilsvarende proteiner ved immunblæsning. Der blev observeret høje niveauer af AKT og RICTOR (figur 3D), hvilket tyder på, at behandling med målrettede lægemidler er berettiget.
For at teste følsomheden af denne tumor over for inhibitorer af AKT og mTOR blev PDX-mus med intraperitonealt implanteret T14 tumor udvidet og randomiseret til kun at modtage kemoterapi (carboplatin/paclitaxel) eller en kombination af kemoterapi med pan-AKT-hæmmer MK-220641 eller mTOR-hæmmer MK-866942. Kemoterapi blev givet til mus i kombinationsarmen i 2 uger før tilsætning af den målrettede behandling (figur 4). Ultralydsmålinger blev taget ugentligt for at overvåge tumorregression/vækst.
Hver behandlingsarm indeholdt ikke mindre end 7 mus. Dette antal var tilstrækkeligt til at observere forskelle i svarene mellem grupperne, samtidig med at omkostningerne ved undersøgelsen var betydeligt lavere. Færre mus (tre til fire) kan bruges i kontrol ubehandlet gruppe, som individuelle variationer i tumor vækstrate er ubetydelige og vækst er normaliseret til en tumor størrelse, hvor behandling i andre arme begynder.
Der blev ikke observeret nogen forskel mellem kemobehandlede og ubehandlede grupper i de første 3 uger af observationen (ikke vist). En betydelig reduktion af tumor byrde (58% median) blev observeret i kemoterapi behandlet gruppe ved udgangen af uge 6. En ekstra fordel i forhold til kemoterapi alene blev observeret i grupper, som fik en kombination af kemoterapi med målrettede behandlinger. Forskellen blev tydelig i uge 4 og 3 for MK-8669 (Figur 4A) og MK-2206 (Figur 4B) hhv.
Dyr blev aflivet, og tumorvæv blev indsamlet til molekylære analyser af behandlingsrespons ved afslutningen af behandlingsforsøget i uge 7. Med henblik herpå blev mængden af total og fosforyleret S6kine (figur 5A,B), AKT og mTOR (Figur 5C,D) bestemt ved hjælp af immunblæsning. Ribosomalt protein S6 kinase er en downstream budbringer af AKT-mTOR vej, kendt for at være up-reguleret og fosforyleret ved stimulering af AKT-mTOR akse af vækstfaktorer til at fremme celle overlevelse og vækst. Sammenligning af niveauet af disse proteiner i ubehandlet eller behandlet med kemoterapi PDX tumorer til mus, der fik AKT eller mTOR-hæmmere viste et markant fald i de to sidstnævnte (Figur 5), hvilket indikerer effektiviteten af den målrettede behandling på det molekylære niveau. Der bør foretages og testes justeringer af behandlingsregimentet, for så vidt angår anvendelsestidspunktet for den kombinerede behandlingsvarighed, for at opnå bedre respons.
| Primer navn | Sekvens | Primer Mix | Primere kombineret | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 og R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTTTTTCTGC | 2 | OC101 F1 og R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 og R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 og R2 | ||
Tabel 1: Primere, der anvendes til validering af ændringen af OC101chromosome 17.
| Reagens | Mængde, der skal tilsættes for 1 reaktion (μL) | Mængde tilsættes for 4 reaktioner (μL). [Gang med 4,3 for at gøre nok for hver primer mix (4)] |
| Nucleasefrit vand | 20.45 | 89.94 |
| 10x buffer (Nem A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Skabelon-DNA (koncentration >10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymerase | 0.25 | 1.08 |
Tabel 2: PCR-opsætning til validering af et vejkryds.
| Temp (C) | Tidspunkt | |
| 94 | 5 min. | |
| 94 | 40 s | 35 cyklusser |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 min. | |
| 72 | 5 min. | |
| 4 | Holde |
Tabel 3: Cykelforhold for PCR til validering af et vejkryds.
Figur 1: Skematisk repræsentation af strategien for genomisk styret terapitest ved hjælp af PDX-modeller for serøs ovariekarcinom. H & E farvning af æggestokkene tumor er vist (top). Skalerbar=100 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Genomisk karakterisering af ovarietumorer ved hjælp af parlamentsmedlemmer. Genom plot viser landskabet af strukturelle ændringer og kopiere antal ændringer som opdaget af parlamentsmedlemmereq. X-aksen spænder over kromosomets længde med viste kromosompositionnummer. Hvert kromosom er angivet på højre og venstre Y-akse. Højden af de vandrette spor for hvert kromosom angiver antallet af fundne læsninger for 30k baseparvinduer. DNA-kopinumre er angivet med farve, med grå, der repræsenterer den normale 2N kopitilstand, rød svarende til sletninger og blå-til gevinster. Forbindelse af sorte linjer svarer til kromosomale omlejringer. Ændringer på ERBB2 locus er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Udvælgelse af målbare ændringer og validering af dem. (A) Et nærsegment af genomplottet, vist i fig.1, der illustrerer en forstærkning af ERBB2-genet på kromosom 17 (i blåt). Kromosomnumre er som angivet. (B) Valideringsanalyse af brudpunkter på ERBB2 locus som identificeret af parlamentsmedlemmereq ved hjælp af PCR-forstærkning. C er en samlet genomisk DNA-kontrol, OC101 er DNA fra patienttumor, M er en DNA-stige. (C) Et nært hold af segmenter af genomplottet for en anden ovarietumor, der viser gevinster (angivet med blå linje) ved AKT locus (øverst) og ved RICTOR-genet (nederst). Kromosomer er som angivet. (D) Valideringsanalyse af ekspression af proteiner af AKT/mTOR-vej ved immunblæsning ved hjælp af tumorvæv fra PDX (T14), genomiske forandringer, for hvilke der er afbildet i C. 30 mg totalprotein og specifikke antistoffer mod AKT, RICTOR, p-mTOR. MAPK fungerede som lastekontrol. Pos con er en uafhængig tumor, der anvendes som en positiv kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af reaktioner på kemoterapi alene og kombineret med målrettet behandling i tumor husly gevinster på AKT2 og RICTOR gener med tilsvarende lægemidler. Behandlingsrespons på en kombination af kemoterapi og anti-mTOR-lægemiddel MK-8669 (A) eller inhibitor af pan-AKT MK2206 (B) versus kemoterapi alene. Tidspunktet for indgivelse af behandling for hver behandling og varigheden vises med pilene. Mængder udtrykkes som procent af den oprindelige volumen ved behandlingens start som middel +/- SD. Kemo er kemoterapi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenligning af molekylære forandringer fremkaldt af hver behandling som bestemt ved immunbblomende analyse. (A) Niveauer af S6 og fosfor-S6, downstream effektor af AKT-mTOR vej er vist. Der blev anvendt 30 mg totalprotein og specifikt antistof mod S6 og p-S6. GAPDH blev brugt som lastekontrol. Kvantificering af proteinniveauer, der er normaliseret til GAPDH-niveau, er vist i (B) (C) Niveauer af mTOR, p-mTOR, AKT og p-AKT som påvist ved immunblæsning. GAPDH blev brugt som lastekontrol. D)Kvantificering af proteinniveauer normaliseret til GAPDH-niveau. NT er ikke behandlet, kemo er kemoterapi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver den tilgang og protokoller, vi brugte til at gennemføre en "klinisk forsøg" i PDX modeller, der udnytter molekylære egenskaber af tumoren som opnået ved genomisk profilering at bestemme det bedste valg af lægemidler til test. Flere sekventering platforme er i øjeblikket anvendes til genomisk karakterisering af primære tumorer, herunder hele genom sekventering, RNAseq og tilpassede genpaneler. For høj kvalitet serøs ovariekarcinom, ParPseq at identificere strukturelle ændringer, DNA rearrangements og kopiere nummer ændringer, er især nyttig på grund af den høje grad af genomisk ustabilitet observeret i denne type tumor. Den anden fordel ved parlamentsmedlemmereq-platformen er, at den dækker hele genomet, men koster betydeligt mindre end andre omfattende sekventeringsteknologier. Parlamentsmedlemmer er imidlertid ikke egnet til punktmutationsdetektion, da basedækningen ikke er tilstrækkelig og kun når 8-10x. En af begrænsningerne ved at bruge parlamentsmedlemmereq alene til genomisk karakterisering af en tumor er tilstedeværelsen af komplekse klyngede kromosomale reorganiseringer, hvoraf analysen ikke forudsiger ekspressionen af påvirkede gener af interesse. Et vejkryds opdaget af parlamentsmedlemmereq, der forventes at skabe et formodede fusionsgen, der validerer PCR'et i DNA'et, kan ikke udtrykkes på grund af et rammeskift eller små sletninger og indsættelser i promotorregionen. På samme måde bør kromosomale gevinster og forstærkninger for potentielle terapeutiske mål nøje vurderes og valideres på RNA- eller proteinniveauet for at sikre ekspression af det interessegen.
Selv om, den molekylære make-up af tumoren er stort set bevaret efter formering i mus i flere generationer, ændringer i udtrykket niveauer af vigtige gener kan forekomme over tid enten afspejler tumor evolution, klonale udvælgelse eller adaptive reaktion på murine miljø. Således, validering af en ændring beregnet til terapeutisk intervention i både oprindelige donor tumor og PDX tumor er kritisk. For tumor isoleret fra PDX modeller både RNA og protein kan bruges til at afhøre udtrykket niveau som materialet er rigeligt. Begge kan vælges til at krydstjekke udtrykket i den oprindelige tumor, afhængigt af tilgængeligheden og typen af det lagrede væv, og tilgængeligheden af antistof til den tilsvarende proteindetektion. PDX-modellen er specifikt uvurderlig i test kombinationsbehandlinger, da in vivo-indstillingen gør det muligt at overvåge bivirkninger samt doserings- eller varighedsjusteringer i behandlingsregimet.
Valget mellem ortotopisk og subkutant indpodning kan foretages afhængigt af de specifikke spørgsmål, der behandles i undersøgelsen. Men, Det er vigtigt at huske på, at følsomheden af xenografted tumorer til terapeutiske kan moduleres af stedet for implantation46. På den anden side, ingen beviser er blevet rapporteret endnu om opdagelsen af lægemidler, der viser en terapeutisk respons i orthotopiske modeller, men fraværende i subkutant implanteret PDX9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang og Faye R. Harris, MS, for hjælpen til at udføre eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af Mr. og Mrs Neil E. Eckles 'Gave til Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
