Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.
Abstract
אנו מציגים כאן גישה אינטגרטיבית לבדיקת יעילות של טיפולים ייעודיים המשלב הדור הבא ברצף technolo-, ניתוחי היעד הטיפולית וניטור תגובת התרופה באמצעות מטופל הנגזר xenografts תלי (PDX). אסטרטגיה זו אומתה באמצעות גידולים בשחלות כדוגמה. פרוטוקול רצף הדור הבא (MPseq) של זוג הזוגות שימש לזיהוי שינויים מבניים ולאחריו ניתוח של שינויים שעלולים לגרום לשימוש בטבלה. גידולים אנושיים שגדלו בעכברים בסיכון חיסוני טופלו תרופות שנבחרו מבוסס על ניתוחים גנומית. תוצאות הפגינו מתאם טוב בין התגובות החזוי והנצפים במודל PDX. הגישה המוצגת ניתן להשתמש כדי לבדוק את היעילות של טיפולים שילוב וסיוע טיפול מותאם אישית עבור חולים עם סרטן חוזרים, במיוחד במקרים שבהם טיפול רגיל נכשלת ויש צורך להשתמש בסמים מחוץ לתווית.
Introduction
המטופל נגזר xenografts תלי (pdxs), אשר נוצר מן ההשתלה של חתיכות הסרטן החולה לתוך עכברים לקויה, התפתחה כמו מודל רב עוצמה פרה לסייע אישית אנטי סרטן טיפול. מודלים PDX פותחו בהצלחה עבור מגוון רחב של ממאירות אנושית. אלה כוללים סרטן השד והשחלות, מלנומה ממאירה, סרטן המעי הגס, אדנוקרצינומה הלבלב, ו סרטן ריאות תאים לא קטנים1,2,3,4,5. רקמת הגידול יכול להיות מושתל אורתולמריחה או הטרועור. לשעבר, נחשב מדויק יותר אבל מבחינה טכנית קשה, כרוך השתלת ישירות לתוך איבר של מוצא הגידול. סוגים אלה של מודלים מאמינים בדיוק לחקות היסטולוגיה של הגידול המקורי בשל "טבעי" מיקרו הסביבה עבור הגידול6,7. לדוגמה, השתלת הנושא אורתוגרקציה לתוך בורסה של השחלה העכבר הביא הפצת הגידול לתוך חלל הצפק וייצור של מיימת, אופייני לסרטן השחלות8. באופן דומה, הזרקה של גידולים בשד לתוך החזה במקום בלוטת הפטמות הבטן השפיעו על שיעור ההצלחה PDX והתנהגות9. עם זאת, מודלים אורתוטופית דורשים מערכות דימות מתוחכמות כדי לפקח על צמיחת הגידול. הטרוההשתלת הגידול מוצק מבוצעת בדרך כלל על ידי השתלת רקמת לאגף תת עורית של העכבר המאפשר ניטור קל יותר של צמיחת הגידול והוא פחות יקר זמן רב7. עם זאת, גידולים הגדלים תת-עורי לעתים נדירות גרורות בניגוד לציין במקרה של השרשה אורתודפית10.
שיעור ההצלחה של החרט הוכח להשתנות ומאוד תלוי בסוג הגידול. גידולים אגרסיביים יותר ודגימות רקמות המכילות אחוז גבוה יותר של תאים סרטניים דווחו יש שיעורי הצלחה טובה יותר12,13. בהתאם למצב זה, גידולים שמקורם באתרים גרוניים הוכחו להיחרט בתדרים של 50 – 80%, בעוד אלה מהאתרים העיקריים העפילו בתדרים נמוך כמו 14%12. לעומת זאת, הרקמה המכילה את התאים נקרוטיק ופחות תאים סרטניים קיימא חרט גרוע. צמיחה הגידול יכול גם להיות מקודם על ידי תוספת של המרתף קרום מטריקס חלבונים לתוך תערובת רקמות בזמן הזריקה לתוך עכברים14 מבלי להתפשר על מאפיינים של הגידול המקורי. הגודל ומספר הרקמה שנועדו לשרשה נמצאו גם הם להשפיע על שיעור ההצלחה של החרט. גידול גדול יותר לקחת-שיעורי דווחו על השרשה בקפסולה תת כליות לעומת השתלת תת עורית בשל היכולת של קפסולת תת כליות לשמור על משתית הגידול המקורי ולספק את התאים סטרומה המארח גם15.
רוב המחקרים להשתמש בעכברים חיסוני SCID הלקוי, אשר חסר תאים הרוצח טבעי16 הוכחו להגדיל את הגידול בתאום, צמיחה גרורות לעומת זנים אחרים14. עם זאת, ניטור נוסף נדרש כפי שהם עשויים לפתח לימפומה הרתי מוקדם ככל 3-4 חודש של גיל13. ב השתלות גידול השחלות גדל בעכברים SCID, הצמיחה של התאים B היה מעוכב בהצלחה על ידי rituximab, מניעת פיתוח של לימפומה אך מבלי להשפיע על העפילה של גידולים בשחלות17.
לאחרונה, NSG (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/szj) עכברים, נושא מוטציה null בקידוד הגן של האינטרלוקין 2 שרשרת גמא הקולטן18, הפך להיות זן שימוש תכוף עבור הדור של מודלים pdx. גידולים מדגמי pdx הוקמה לדורות הבאים של עכברים מדווחים לשמור על תכונות היסטולוגית ומולקולרית עבור 3 עד 6 דורות19,20. מחקרים רבים הראו כי התוצאות הטיפול ב pdx מודלים לחקות את אלה של המטופלים המתאימים שלהם2,3,4,21,22,23. שיעור התגובה כימותרפיה ב pdx מודלים עבור סרטן ריאות לא קטן קרצינומות המעי הגס היה דומה לזה בניסויים קליניים עבור תרופות אותן24,25. מחקרים שנערכו בדגמי pdx, שפותחו עבור חולים שנרשמו בניסויים קליניים, הפגינו תגובות תרופות בדוקות דומה לאלה שנצפו קלינית בחולים המתאימים2,3,4.
גבוהה – התפוקה גנומית ניתוח של גידול החולה בשילוב עם מודלים PDX לספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את היחסים בין שינויים גנותיים ספציפיים תגובה טיפולית. אלה תוארו במספר פרסומים26,27. לדוגמה, התגובות הטיפוליות ל-egfr מעכב ארביטוקס בקבוצה של מודלים pdx המעי הגס נושא הגברה egfr, וקרב התגובות הקליניות כדי ארביטוקס בחולים28.
ישנם כמה אתגרים הקשורים לפיתוח ויישום של מודלים PDX. בין אלה הוא גידול טרוגניות29,30 זה עלול לפגוע בדיוק של פרשנות תגובת הטיפול כמו שיבוט תא יחיד עם קיבולת ההתרבות גבוה יותר בתוך pdx יכול לעבור את אלה אחרים31, ובכך התוצאה היא אובדן של טרוגניות. בנוסף, כאשר ביופסיות הגידול בודד משמשים לפיתוח PDX, חלק מאוכלוסיית התאים עלולים להיות מחמיץ ולא יהיה מיוצג בשתל הסופי. דגימות מרובות מאותו גידול מומלצות להשתלה כדי לפתור את הבעיה. למרות הגידולים PDX נוטים להכיל את כל סוגי התא של גידול תורם המקורי, תאים אלה הם הוחלף בהדרגה על ידי אלה של מקור murine3. הגומלין בין מסטרומה מורטין ותאי הגידול האנושיים בדגמי PDX לא מובנים היטב. למרות זאת, תאים סטרומה הוכחו באופן מסכם מיקרו סביבה גידול33.
למרות מגבלות אלה, מודלים PDX להישאר בין הכלים החשובים ביותר עבור מחקר טרנסלtional, כמו גם רפואה אישית לבחירת טיפולים החולה. יישומים עיקריים של PDXs כוללים גילוי סמנים ביואריקר ובדיקות סמים. Pdx מודלים משמשים גם בהצלחה כדי ללמוד התנגדות לסמים מנגנונים ולזהות אסטרטגיות כדי להתגבר על עמידות לסמים34,35. הגישה המתוארת בכתב היד הנוכחי מאפשרת לחוקר לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בגידולים אנושיים ולהעריך את היעילות של התרופות המתאימות בvivo, בעכברים המייצגים גידולים מנופה שgenomically בתחילה. הפרוטוקול משתמש גידולים השחלות המנופה intraperitoneally אבל הוא ישים לכל סוג של הגידול אגרסיבי מספיק כדי לגדול בעכברים2,3,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות טריות מן ההסכמה חולים עם סרטן השחלות נאספו בזמן של ניתוח debulking על פי פרוטוקול שאושרו על ידי מאיו קליניק מוסדי סקירה הלוח (IRB). כל ההליכים בעלי חיים וטיפולים המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים מרפאת מיונז והשתמש הוועדה (IACUC) ואחריו הנחיות לטיפול בבעלי חיים.
1. הצמד רצף וניתוח של זוג
הערה: יש להשתמש ברקמה הטרייה או הקפואה לצורך שימוש ברצף משני הצדדים (MPseq). פרפין חומר מוטבע אינו מתאים משום שהוא מכיל דנ א מפוצל.
- . בידוד דנ א מרקמת הגידול הקפואה השתמש בדגימה האדם המקורי שהתקבל מחומר כירורגי או ביופסיה36.
- השתמש 1000 ng של DNA כדי להפוך את הספריות MPseq ורצף כמו 2 דגימות למסלול על ברצף הדור הבא (ראה טבלת חומרים)36.
- ניתוח נתונים באמצעות ערכת אלגוריתמים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות גדולות (מחיקות, הוספות, הגברה, היפוכיהם וטרנסמייקומים) כמתואר לעיל36,37.
2. מבחר מטרות טיפוליות
- השתמש בכלי הגישה הפתוחה Panda (נתיב וביאור) או בכלי מקביל לזיהוי שינויים בטבלת היעד (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- הפוך רשימה של גנים המזוהים על-ידי MSeq כשינוי, כקובץ פשוט המופרד בטאבים, תוך שימוש בסמלי גנים סטנדרטיים מקובלים.
הערה: הדוגמה הכלולה כוללת ניתוח של הגברה ורווחים. - הוסף סימן "" לשורת הכותרת של הרשימה כדי לוודא שכותרת הטבלה מועברת לתצוגת רמת הנתיב של התוכנה.
- העלה את הקובץ על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ' טען ערכת ביאור לניווט '.
- הקצה סמל בודד מהתפריט כדי לייצג את הנתונים המשמשים כבסיס על-ידי לחיצה על סמל הבחירה ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסיה סיום .
- לאחר העלאת קבצי הביאור, זהה עמודה המציגה את מספר הגנים המוארים לכל מסלול. . זו העמודה האחרונה מימין
- השתמש מסנן מסלול בפינה השמאלית העליונה של החלון הראשי כדי להציג מסלולים המכילים גנים של עניין.
- זיהוי מסלולים בעלי גנים מוערת יותר מהצפוי במקרה. השתמש בפונקציה הממוקמת תחת הכרטיסיה העשרה .
- בחר מסד נתונים להצגת druggable גנים שעלולים להיות מוגדרים מראש על-ידי בדיקת סמל מתאים משמאל לחלון הראשי (לדוגמה, DGIdb, PharmGKB).
- בחר מסלול להדמיה על-ידי לחיצה על שמו המוצג בעמוד ' מציג הנתיב '.
הערה: סמלים המייצגים כל ערכת ביאור מוצגים לצד הגן המשויך. לחץ על גן העניין כדי לפתוח את דף האינטרנט המתאים. - בחר את מסלולים שהראו את הגנים מסומן של עניין (כלומר, שונה בגידול נתון) ו "להיטים" עבור תרופות פוטנציאליות לניתוח נוסף.
- הפוך רשימה של גנים המזוהים על-ידי MSeq כשינוי, כקובץ פשוט המופרד בטאבים, תוך שימוש בסמלי גנים סטנדרטיים מקובלים.
- השתמש במסד נתונים המכיל תרופות המאושרות עבור יישום קליני (https://clinicaltrials.gov/) כדי להצליב הפניות למטרות שזוהו.
- קביעת עדיפות שינויים היעד לבדיקה נוספת במודלים PDX על ידי ביצוע סקירה ספרות (למשל, פומד) כדי לאשר רלוונטיות לביולוגיה של סוג מסוים של הגידול.
3. ואלידציה של הסדרי גנומית על ידי רצפי PCR ו-Sanger
- עיצוב בצבעי יסוד בעזרת רצף קריאות שהתקבלו מנתוני MPseq.
- בחר צומת מעניין עבור האימות (כלומר, יעד טיפולי פוטנציאלי) המבוסס על ניתוחי MPseq.
- עיצוב כיוון התחל לעצב כגון האמפליצין מכיל את הצומת. עיצוב 2 התחל בכל צד של הצומת, בסכום של 4, כדי להגדיל את הסיכויים של הגברת הצומת.
הערה: שם התחל בהתאם למקרה ולמיקום הכרומוזום. - השתמש בפרמטרי PCR סטנדרטיים עבור העיצוב התחל ותוכנה של בחירה. בחר טמפרטורת התכה (60-62 ° c) ותוכן ה-GC (40-60%). ודא שהרצף הפריימר אינו יוצר מפלינדרומים, לולאות בלתי מיוצרות.
- ודא כי הרצף הפריימר חסר הומולוגיה לתחומים אחרים של הגנום האנושי על ידי בדיקת השימוש בבלט (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- הפעל את ה-PCR כדי להגביר את צומת הריבית.
- לדלל את התחל עם מים כדי 10 מ"מ ולשלב 10 מ ל של כל פריימר, כך כל פריימר קדימה מזווג עם כל פריימר הפוכה לתערובת פריימר.
הערה: רצפי הצבעי היסוד עבור הדוגמה שנבחרה מוצגים בטבלה 1. - תווית 0.2 mL שפופרות הרצועה כמו: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 ו-T4 שבו C = בקרת DNA גנומית האדם (מסחרי), T = DNA הגידול, מבודד מסרטן או הגידול PDX, ואת המספר מציין את התמהיל פריימר.
- הוסף 1 מ ל של כל שילוב פריימר לתוך הצינורות שלו התווית.
- להכין את המיקס Taq ידי שילוב ריאגנטים המפורטים בטבלה 2, להשאיר את האנזים במקפיא עד הצורך, הוספת אותו לערבב בסוף.
- הפוך 2 תערובות מאסטר, אחד עבור כל ה-DNA תבנית, בקרת דנ א אנושי הגידול DNA. הוסף 24 מ ל של כל תערובת בסיס Taq לצינור הרצועה המתאים שלה. נפח התגובה הכולל הוא 25 מ ל. מערבולת לזמן קצר מאוד ואז לסובב את הצינור העירום למטה.
- תריץ את הסרט הPCR. בתוך מפעל התרמותרמי השתמש בפרמטרים המוצגים בטבלה 3. התאימו את טמפרטורת הריפוי כדי להגיע ללפחות 1 ° צ' קר מטמפרטורת ההיתוך של התחל.
- אחסן את מוצר ה-PCR המלא ב-20 ° צ' (טווח ארוך) או בקירור ב-4 ° צ' (טווח קצר) עד לצורך.
- לבצע אלקטרופורזה ב 1-5 V/cm כדי להמחיש את המוצר PCR באמצעות 1.5% agarose ג'ל. השאר 2 mL סדרת מחלקים של המוצר כדי לשמש רצף של sanger.
- לדלל את התחל עם מים כדי 10 מ"מ ולשלב 10 מ ל של כל פריימר, כך כל פריימר קדימה מזווג עם כל פריימר הפוכה לתערובת פריימר.
- בצעו רצף של Sanger כדי לאשר את הצומת ולזהות את נקודת העצירה המדויקת38.
- השתמש במוצר ה-PCR אם ה-PCR יצר מוצר אחד (רצועה). לחילופין, לחתוך את הלהקה מתוך ג'ל, לטהר ולהגיש לרצף שסנגר יחד עם הפריימר המשמש הגברה.
הערה: גידולים שעבורם ניתוחים גנומית בוצעו אז משמשים השרשה בעכברים.
- השתמש במוצר ה-PCR אם ה-PCR יצר מוצר אחד (רצועה). לחילופין, לחתוך את הלהקה מתוך ג'ל, לטהר ולהגיש לרצף שסנגר יחד עם הפריימר המשמש הגברה.
4. הטיפול בתיאום ואחזקה של הגידול
- הגדרת ההכנות לגידולים עפיל לתוך מודלים של עכבר PDX. בחר עבור גידולים בתיאום שעבורם ניתוחים גנומית יהיו או בוצעו.
- ודא שתשתית תומכת נמצאת במקום בזמן תחילת הפיתוח של כל דגמי PDX, כולל מתקני מעבדה ובעלי חיים ייעודיים, צוות טכני מיומן ונוהלי הפעלה סטנדרטיים מפורטים.
- להבטיח את התחבורה המהירה ואת העיבוד של דגימות כמו מהירות היא חיונית לכדאיות התא והעפילה מוצלחת.
- השתמש בסביבה סטרילית כדי להפחית זיהום חיידקי ופטרייתי לעיבוד וחרט דגימות.
- לטפל בדגימות של בני אדם בזהירות, בהתאם למדיניות המוסדית בנוגע לחומרים העלולים להיות מסוכנים, כאשר הם עלולים להיות בעלי פתוגנים הנישאים בדם.
- הכן את הרקמה (0.5-0.7 ס"מ3 בגודל) עבור חרט על ידי הצבת דגימה כירורגית לתוך צינור מקורר 50 mL עם 20 מ ל של מדיה תרבות רקמות.
הערה: רקמת הגידול יכול להיות טרי או התאושש בעבר חומר הקפאה5. - לאשר את תכולת הגידול בדגימה על ידי ייעוץ פתולוגית.
- מניחים את רקמת הגידול בקערה המכילה 10-15 mL של הקרים PBS, או מדיה תרבות רקמות כגון RPMI 1640 או DMEM המכילים אנטיביוטיקה (1% פניצילין ו-סטרפטומיצין).
- לזהות ולבודד חומר הגידול קיימא מרקמת נורמלי ונמק סמוכים עם עזרה של הפתולוג. השתמש מלקחיים סטרילי אזמל להסיר חומר נקרוטי הצביע על ידי הפתולוג.
הערה: הגידול יכול להיות מושתל או intraperitoneally או תת-עורי לתוך העכברים. בצע את השלבים 4.2 כדי לבצע השרשה הצפק או דלג לשלב 4.3 לביצוע החרט תת עורי. במחקר זה, טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס ניתוחים גנומים נבדקו בסדרה של מודלים pdx לסרטן השחלות נסיובי גבוה בכיתה עם השרשה הצפק.
- הכן את הרקמה עבור השרטת הצפק (IP) לערבב את הרקמה עם מלקחיים סטרילית אזמל על הקרח כדי ליצור חתיכות כ 1-1.5 מ"מ3 בגודל וערבוב עם מדיום התרבות הקרה. הכנס 0.3 – 0.5 מ ל של שאיפה הגידול באמצעות מחט 16-17 למדוד.
הערה: כל ההליכים המנתחים מתבצעים באמצעות טכניקות אספטיות. כפפות סטרילי, מכשירים סטריליים, אספקה, חומרים מושתלים שימשו כדי להפחית את הסבירות של זיהום.- מערבבים את החלקים 1:1 עם בינונית התרבות קרח קר להזריק 100 mL intraperitoneally לפחות שלוש עכברים SCID נקבה.
- חותכים את רקמת הגידול עבור חרט תת עורית באמצעות מלקחיים סטרילי, אזמל, או מספריים כירורגיים לתוך שברים קטנים, בערך 2 x 2 x 2 מ"מ בגודל, ולהעביר את הרקמות מפוצל לצלחת פטרי מראש מקורר על קרח.
- הוסף את מטריצת הממברנה הקרה במרתף לתוך המנה עם רקמת מפוצל (כ 200 mL לכל 10 חתיכות של רקמה), לערבב היטב, ולתת את שברי הרקמה להשרות מטריקס קר קרום המרתף עבור 10 דקות.
- כיצד להכין את העכברים לצורך הכנת הראש.
- להזריק כל עכבר intraperitoneally עם קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) שילוב.
- אשר את העכבר מורדם כראוי על ידי צובט את קצה הזנב עם מלקחיים atraumatic.
- הסרת עכבר בעדינות מורדם לחלוטין מן התא ולשים על העכבר חרוט אף אשר יש קלט מ אידוי ופלט ממערכת ניקוי גז פסולת.
- לשים משחה וטרינר על העיניים העכבר כדי למנוע יובש בזמן הרדמה. הכינו את האזור בו הניתוח יבוצע. השתמש בטכניקה אספטי כדי לבצע את הניתוח.
- ודא כי המשטח שבו הניתוח הולך לקחת הוא לא נקבובי, אטום וחוטא לפני הניתוח.
- להתחיל לנתח עם סטרילי (על ידי החיטוי, גז או עיקור כימיים) כלים.
- השתמש בכפפות כדי לטפל במכשירים ולשמור על עקרות של טיפים המכשיר במהלך ההליך על ידי מיזוג אותם באתנול בין שלבי הניתוח.
- לחטא את האתר כירורגי ידי החלת 3 לסירוגין מקרצף של יוד ואלכוהול. השתמש מספריים ניתוח סטרילי מלקחיים לעשות חיתוך עור אנכי 5-10 מ"מ בשני האגפים של העכבר.
- הכנס מלקחיים ישר בעדינות לתוך החלל התת עורי כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי רסיס הגידול להיות ממוקם תחת פד שומן.
- השתמש מלקחיים ישר סטרילי להוסיף שברי הגידול לתוך כיס שהוכן בעבר בכל אחד 5 עכברים.
הערה: מקום 3-4 חתיכות של רקמת הגידול בכיס אחד. - סגרו את החתכים בעור באמצעות דבק רקמות.
- Intraperitoneally להזריק כל עכבר עם 100 mL של Rituximab לאחר השרשה כדי לעכב את התפשטות הימפוציט.
- למקם את העכבר לתוך כלוב תחת מנורת חום במשך כ 20 דקות עד התאושש מן ההרדמה. לנטר את הסימנים החיוניים לעכבר ולהבטיח מחות מספיקה.
- להחזיר את העכבר לחברה של עכברים אחרים לאחר שהוא התאושש מהרדמה והחל לאכול ומים. לספק טיפול פוסט-פעיל וניטור בהתאם להנחיות המוסדיים. בדקו סימנים של כאב ומצוקה מדי יום למשך 3 ימים רצופים לאחר הניתוח.
הערה: קריטריונים של כאב או מצוקה כוללים נמק או כיבית, הרזיה/מצב גוף הבקיע, סימני התנהגות כגון רמת הפעילות, תפקוד מנוע ויציבה. - בדוק באופן שגרתי את העכברים עבור היווצרות הגידול bi-שבועי עד הגידולים להגיע לגודל של 0.5 ס מ קוטר כפי שנמדד על ידי caliper.
- להעריך את תוצאת הבריאות של כל עכבר כפי שנגזר מן המראה, התנהגות, ואת מצב הגוף39. השימוש עשרות ≤ 6 כקריטריון עבור עכברים מוריקה להיות הקריב על ידי פחמן דו חמצני שאיפת.
5. בדיקת תגובות genomically מטרות שזוהו בדגמי PDX
- הפעל את הטיפולים הייעודיים שנבחרו כאשר הגידולים הם מוחשי ולהגיע 0.5 ס"מ3 כפי שנמדד על ידי סריקת אולטרסאונד.
- לפני ביצוע סריקת אולטרסאונד של הבטן להסיר את פרוות הבטן העכבר ולהחיל חומר סיכה סטרילי ג'לי.
- השתמש במכונת אולטרה סאונד עם מתמר כדי להשיג תמונות עם הגידול ממוקם בחתך רוחב. לבצע 3 מדידות לכל הפעלה עבור כל בעל חיים והממוצע ערך עבור הערכה מדויקת יותר של גודל הגידול.
- לנתח את התמונות באמצעות תוכנה זמינה40.
- ניהול כימותרפיה המורכבת של תערובת של קראופלטין ב 51 מ"ג/ק"ג ו פקליטקסל ב 15 מ"ג/ק"ג intraperitoneally (IP) פעם בשבוע עבור משך הטיפול הכולל של 4-6 שבועות. ודא כי אמצעי האחסון הכולל להזרקה אינו עולה על 0.2 mL.
- הפוך את MK-220641 מניות פתרון ב 30% cyclodextrin (למשל, Captisol) ולספק דרך הפה gavage ב 120 מ"ג/ק"ג מדי יום עבור 4 שבועות רצופים.
- להכין את העכבר לgavage אוראלי על ידי להחזיק אותו על ידי צובט את העור בגב והצמדת אותו בחזרה, כך הראש והגפיים של העכבר הם ללא קיבוע.
- הכנס את gavage לחקור לאורך החלק האחורי של הגרון של העכבר עד הגשוש מגיע הוושט. ודא כי המכשיר אינו מוכנס רחוק מדי, כמו הריאות של העכבר עשוי לנקב, גרימת מוות.
- לבצע a MK-866942 פתרון המניה באתנול ב 25 מ"ג/mL. לדלל אותו ברכב המכיל 5.2% רצף 80, 5.2% PEG400 במים סטרילי עבור זריקות IP ב 10 מ"ג/ק"ג עבור 5 ימים בכל שבוע אחר, עם משך כולל של הטיפול של 4 שבועות.
הערה: נפח מוזרק לעכברים צריך להיות 50-120 mL, בהתאם למשקל של בעל החיים. - השתמש 7-8 עכברים לכל קבוצת טיפול יש מספיק כוח סטטיסטי כדי לזהות43הבדלים 43,44.
- להעריך את משקל הגוף ואת המצב הכללי של העכברים בטיפול מדי יום. למנוע סמים אם משקל החיה צונח 20% או יותר ממשקלם הראשון.
- להעריך את גודל הגידול שבועי באמצעות סריקת אולטרסאונד. ודא כי הפרט ביצוע הניטור של צמיחת הגידול הוא עיוור לטיפול כדי להבטיח את הניקוד משוחדת של תגובות.
הערה: מעבדות קטנות יותר עשויות להעסיק 2 אנשים שונים כדי לנהל את ניטור הטיפול והאולטרסאונד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רקמות מפני גידולים השחלות מחדש בזמן של ניתוחים debulking נאספו בהתאם הדרכה IRB ומשמש 1) האפיון גנומית ו 2) חרט עכברים החיסונית (איור 1). 36,37 שימש לזיהוי שינויים מבניים ב-DNA כולל הפסדים, רווחים והגברה. מגרש הגנום נציג הממחישות נוף של שינויים גנומית בגידול אחד (המיועדים כ OC101) מוצג באיור 2. אופייני לגידולים ברמה גבוהה נסיובי סוג, רווחי מרובים (קווים כחולים) ומחיקות (קווים אדומים) נמצאו, המציין רמות גבוהות של חוסר יציבות גנומית, כמו גם הפסדים כרומוקטיביים ורווחי, מעיד על aneuploidy נצפו. על הממוצע 300-700 הכולל שינויים מזוהים ברמה גבוהה נסיובי המשנה גידולים45. הניתוחים הבאים חשפו כמה שינויים DNA כי היו שולחן פוטנציאלי עם סמים רלוונטיים קלינית. שינוי מדורגת העליון עבור התערבות טיפולית בגידול OC101 היה הגברה על כרומוזום 17 מעורבים ERBB2 (איור 2 ואיור 3a). ERBB2 הוא גן אשר קודים עבור HER2 קולטן אשר ידוע על dimerization עם EGFR, HER3 או HER4 להפעיל RAS/טיפשה ו-PI3K/AKT איתות מסלולים ולקדם צמיחת תאים, תא הגירה ופלישה. HER2 מעכבי (למשל, נוגדנים חד שבטיים pertuzumab ו trastuzumab) הם יעילים בטיפול בחולי סרטן השד כאשר גידולים overexpress החלבון HER2. Anti-HER2 טיפול לסרטן השחלות, עם זאת, הוא לא אישר ה-FDA.
השוואה של פרופיל גנומית של הגידול של חולי התורם (איור 1) זה של מודל pdx המתאים (לא מוצג) חשף דמיון מרשים, עקבי עם כל המחקרים הקודמים המדווחים על הקירבה המולקולרית של גידולים מקוריים של נגזרות pdx שלהם.
כדי לאמת את התוצאות MPseq ברמת ה-DNA, כמה סטים של התחל הספציפי עוצבו עבור הקצוות של אזור מוגבר המכיל את הגן ERBB2, ו-PCR בוצע באמצעות DNA בודד מן הגידול המקורי, כמו גם מגידול הופץ במשך מספר דורות בעכברים. תמונה של ג'ל מייצג של מוצרים מוגבר באמצעות שתי סדרות שונות של התחל מוצג באיור 3B. אף להקה לא זוהתה כאשר במאגר נורמלי DNA גנומית (שנקבעו כ C), כי לא מכיל הגברה של לוקוס ERBB, היה הוגדל. טיהור של המוצרים מן הג ו-שינוי רצף (לא מוצג) עוד אישר את השינוי החזוי על ידי MPseq. אימות נוסף נערך על ידי בחינת הביטוי של חלבון HER2 בגידול PDX המקביל באמצעות החיסונית. הניתוח חשף רמה גבוהה של חלבון HER2 (התוצאה אינה מוצגת), העקבית עם הגברה נצפתה של הגן ERBB2.
ב-DNA של גידול שחלות שונות (ייעודי T14) רווחים אזוריים רבים נצפו. אלה כללו AKT2 ו-ריצ'ור גנים (איור 3C). שניהם היו עניין רב מנקודת מבט טיפולית כמו מעכבי של AKT2 ו mTOR, אשר שותפים ריצ'ור עם, זמינים וכרגע בניסויים קליניים. מכיוון שלא היו זוג זוגות מספרים המשתרעים על הסביבה של כל אחד מהגנים, אימות PCR פשוט של הרווח כפי שזוהה על-ידי MPseq לא היה אפשרי. אנו, לפיכך, בחנו את רמת הביטוי של חלבונים המתאימים על ידי החיסונית. רמות גבוהות של AKT ו-ריצ'ור נצפו (איור 3D) רומז כי הטיפול בתרופות ממוקדות מוצדקת.
כדי לבדוק את הרגישות של הגידול הזה מעכבי של AKT ו mTOR, העכברים PDX עם intraperitoneally מושתל T14 הגידול היו מורחבים אקראי כדי לקבל רק כימותרפיה (קראופליטיני/paclitaxel) או שילוב של כימותרפיה עם מעכבי פאן-AKT MK-220641 או mtor מעכבי mk-866942. כימותרפיה ניתנה לעכברים בזרוע המשולבת במשך שבועיים לפני הוספת טיפול ייעודי (איור 4). מדידות אולטרסאונד נלקחו שבועי כדי לפקח על רגרסיה/צמיחה גידול.
כל זרוע טיפול הכיל לא פחות מ -7 עכברים. מספר זה היה מספיק כדי להתבונן בהבדלים בין הקבוצות תוך שמירה על עלויות המחקר בסימן נמוך במידה ניכרת. פחות עכברים (שלושה עד ארבעה) ניתן להשתמש בקבוצה ללא טיפול בשליטה, כמו וריאציות בודדות בשיעור גידול הגידול הם זניחים וצמיחה הוא מנורמל לגודל הגידול שבו הטיפול בזרועות אחרות מתחיל.
לא נצפתה הבדל בין קבוצות שטופלו כימותרפיה וארגונים לא מטופלים בשלושת השבועות הראשונים של התבוננות (לא מוצג). הפחתה משמעותית של נטל הגידול (58% חציון) נצפתה בקבוצה כימותרפיה שטופלו עד סוף שבוע 6. יתרון נוסף על פני כימותרפיה בלבד נצפתה בקבוצות שקיבלו שילוב של כימותרפיה עם טיפולים ייעודיים. ההבדל נעשה ברור בשבוע 4 ו 3 עבור MK-8669 (איור 4A) ו MK-2206 (איור 4a) בהתאמה.
בעלי חיים היו מורדמים ורקמת הגידול נאסף לניתוח מולקולרי של תגובת הטיפול בסוף המשפט טיפול בשבוע 7. למטרה זו, כמויות הסכום הכולל והזרחמות S6 קינאז (איור 5A,B), Akt ו-Mtor (איור 5a,D) נקבעו באמצעות מימוש חיסוני. הריבוזומבית חלבון S6 קינאז הוא שליח במורד הזרם של AKT-mTOR מסלול, ידוע להיות מוסדר ו זרחתית על גירוי של הציר AKT-mTOR על ידי גורמי הצמיחה כדי לקדם את ההישרדות והצמיחה של התאים. השוואה בין רמות של חלבונים אלה בטיפול או מטופלים עם גידולים PDX כימותרפיה לעכברים שהתקבלו AKT או מעכבי mTOR הראו ירידה מסומנת בשני האחרונים (איור 5), המציין את האפקטיביות של טיפול ייעודי ברמה המולקולרית. התאמות לגדוד הטיפול, ככל שהתזמון של האפליקציה לתרופות המשולבות ולמשך הטיפול, יש לעשות ולבדוק כדי להשיג תגובות טובות יותר.
| שם תחל | רצף | פריימר מיקס | צבעי יסוד משולבים | ||
| OC101 17a-17a R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 ו R1 | ||
| OC101 17a-17a R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTAGTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 ו-R2 | ||
| OC101 17b-17b F1 | הובלה מג | 3 | OC101 F2 ו R1 | ||
| OC101 17b-17b F2 | מיכל שטאור | 4 | OC101 F2 ו-R2 | ||
שולחן 1: השימוש התחל לאימות של OC101chromosome 17 שינוי.
| ריאגנט | כמות להוספה עבור תגובה 1 (μL) | כמות להוספה עבור 4 תגובות (μL). [כפל ב 4.3 לעשות מספיק עבור כל שילוב פריימר (4)] |
| Nuclease-מים ללא תשלום | 20.45 | 89.94 |
| מאגר 10x (קל A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 מ"מ | 0.5 | 2.15 |
| תבנית דנ א (ריכוז > 10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| טייב פולימראז | 0.25 | 1.08 |
שולחן 2: התקנת PCR כדי לאמת צומת.
| טמפ ' (C) | זמן | |
| 94 | 5 דקות | |
| 94 | 40 ס | 35 מחזורים |
| 59 | 40 ס | |
| 72 | 2 דקות | |
| 72 | 5 דקות | |
| 4 | החזיק |
שולחן 3: תנאי רכיבה על אופניים ל-PCR כדי לאמת צומת.
איור 1: ייצוג סכמטי של האסטרטגיה עבור בדיקות טיפול מודרך genomically באמצעות מודלים pdx עבור קרצינומה של השחלות נסיובי. H & E כתמים של גידול בשחלות מוצג (למעלה). סרגל קנה מידה = 100 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון גנומית של גידולים בשחלות באמצעות MPseq. מגרש הגנום מראה את הנוף של שינויים מבניים והעתק מספר השינויים כפי שזוהה על-ידי MPseq. ציר X משתרע על אורך הכרומוזום עם מספר מיקום כרומוזום מוצג. כל כרומוזום מצוין בציר Y הימני והשמאלי. גובה העקבות האופקיים עבור כל כרומוזום מציין את מספר הקריאות שזוהו עבור חלונות זוג בסיס של 30k. מספרי העתקת DNA מצוינים על-ידי צבע, עם אפור המייצג את מצב ההעתקה הרגיל של 2N, אדום המתאים למחיקות ולרווחים כחולים. חיבור קווים שחורים מתאימים לסידור מחדש של כרומוזומלית. שינויים ב ERBB2 לוקוס מתוארים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הבחירה של שינויים בשולחן היעד ואת האימות שלהם. (א) קטע תקריב של העלילה הגנום המוצגת תאנה .1 המדגימה הגברה של הגן ERBB2 על כרומוזום 17 (בכחול). . מספרי הכרומוזום מצוינים (ב) ניתוח אימות של נקודות עצירה בERBB2 לוקוס כפי שזוהה על-ידי mpseq באמצעות הגברה של PCR. C הוא בקרת DNA גנומית במאגר, OC101 הוא DNA מגידול החולה, M הוא סולם DNA. (ג) תקריב של קטעים של מגרש הגנום עבור גידול בשחלות אחר מראה רווחים (מצוין על ידי קו כחול) במקום akt (למעלה) ו-להגן על ריצ'ור (למטה). . כרומוזומים מצוינים (ד) ניתוח ואלידציה של ביטוי של חלבונים של מסלול Akt/mtor על-ידי בלוק חיסוני באמצעות רקמת הגידול מ pdx (T14), שינויים גנומית אשר מתוארים ב-30 מ"ג של חלבון מוחלט ונוגדנים ספציפיים ל AKT, ריצ'טור, p-mtor שימשו. MAPK שימש כבקרת העמסה. הונאה Pos היא גידול עצמאי המשמש כשליטה חיובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואת התגובות כימותרפיה בלבד ובשילוב עם טיפול ממוקד בגידול רווחים מחסה ב AKT2 ו-ריצ'ור גנים עם תרופות תואמות. התגובות טיפול שילוב של כימותרפיה ו anti-mTOR תרופה MK-8669 (a) או מעכבי של פאן-AKT MK2206 (ב) לעומת כימותרפיה בלבד. זמן הניהול של כל טיפול והמשך מוצגים על ידי החיצים. אמצעי אחסון מבוטאים כאחוזים מאמצעי האחסון ההתחלתי בתחילת הטיפול כממוצע +/-SD.. הכימותרפיה היא כימותרפיה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואת השינויים המולקולריים המבוצעים על ידי כל טיפול שנקבע על ידי ניתוח מערכת חיסונית. (A) רמות של S6 ו-פוספהו-S6, הזרם המורד של מסלול Akt-mtor מוצגים. 30 מ ג של חלבון מוחלט נוגדן מסוים S6 ו p-S6 שימשו. השימוש ב-העברת שימוש כבקרת טעינה. הקוונפיקציה של רמות החלבון מנורמלת ברמה של הסדר מוצג ב (ב) (C) רמות של mtor, p-mtor, akt ו-p-akt כפי שזוהה על ידי החיסונית. השימוש ב-העברת שימוש כבקרת טעינה. (ד) קוונפיקציה של רמות החלבון מנורמלת לרמת הסדר. NT אינו מטופל, הכימותרפיה היא כימותרפיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים את הגישה ואת הפרוטוקולים השתמשנו לבצע "ניסוי קליני" ב PDX מודלים שלוקח את היתרון של מאפיינים מולקולריים של הגידול כפי שהושג על ידי יצירת פרופיל גנומית כדי לקבוע את הבחירה הטובה ביותר של תרופות לבדיקה. פלטפורמות רצף מרובות משמשות כעת עבור אפיון גנומית של גידולים ראשוניים כולל רצף הגנום השלם, RNAseq ולוחות גנים מותאמים אישית. עבור קרצינומה של השחלות נסיובי בדרגה גבוהה, mpseq לזיהוי שינויים מבניים, DNA הסדרים מחדש והעתק מספר שינויים, שימושי במיוחד בגלל הרמה הגבוהה של אי-יציבות גנומית נצפתה בסוג זה של הגידול. היתרון השני של פלטפורמת MPseq היא שהיא מכסה את הגנום כולו, אך עלויות באופן משמעותי פחות מאשר בטכנולוגיות אחרות רצף מקיף. MPseq, עם זאת, אינו מתאים לזיהוי מוטציה נקודה כמו כיסוי הבסיס אינו מספיק, להגיע רק 8-10x. אחת המגבלות של שימוש ב-MPseq בלבד לאפיון גנומית של גידול היא נוכחות של הסדרים מורכבים של כרומוזום באשכולות, ניתוח שאינו מנבא את הביטוי של גנים מושפעים של עניין. הצומת זוהה על ידי MPseq החזוי כדי ליצור גן פיוז'ן היתוך המאמת ב-DNA על ידי PCR לא יכול להתבטא בשל משמרת מסגרת או מחיקות קטנות והוספות באזור המקדם. באופן דומה, רווחים כרומוזום והגברה על מטרות טיפוליות פוטנציאליות יש להעריך בקפידה מאומת על RNA או ברמת החלבון כדי להבטיח ביטוי של הגן של עניין.
למרות, האיפור המולקולרי של הגידול הוא נשמר במידה רבה לאחר התפשטות עכברים במשך דורות מספר, שינויים ברמות הביטוי של גנים מרכזיים עלול להתרחש לאורך זמן או השתקפות האבולוציה הגידול, בחירת שבטים או תגובה מסתגלת לסביבה murine. כך, ואלידציה של שינוי המיועד להתערבות טיפולית הן גידול התורם המקורי וגידול PDX הוא קריטי. עבור הגידול מבודד מודלים PDX הן RNA ו חלבון ניתן להשתמש כדי לחקור את רמת הביטוי כמו החומר הוא שופע. ניתן לבחור להצליב את הביטוי בגידול המקורי, בהתאם לזמינות ולסוג הרקמה המאוחסנת, והזמינות של הנוגדן לגילוי החלבון המתאים. מודל PDX הוא יסולא בפז במיוחד בבדיקת טיפולים שילוב כמו בהגדרה vivo מאפשר ניטור של תופעות לוואי, כמו גם מינון או התאמות משך הטיפול משטר.
ניתן לעשות זאת בהתאם לשאלות הספציפיות המטופלות במחקר. עם זאת, חשוב לזכור כי הרגישות של גידולים xtherapeutics מושתל יכול להיות מאופנן על ידי האתר של השרשה46. מצד שני, לא דווח עדיין על גילוי תרופות המציגות תגובה טיפולית במודלים אורתוטופית, אך נעדרים ב-PDX9תת-עורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי מרכז המרפאה של מאיו עבור הרפואה האישית (CIM) ד ר. לין יאנג ופיי R. האריס, MS, על העזרה בביצוע ניסויים. העבודה הזאת נתמכת על ידי מר וגברת ניל א ' מתנה למרכז הקליניקה של מאיו לרפואה אישית (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
