Summary
Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.
Abstract
Aquí presentamos un enfoque integrador para probar la eficacia de las terapias dirigidas que combina la próxima generación de tecnolo-gies de secuenciación, análisis de diana terapéutica y monitoreo de la respuesta a fármacos utilizando xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Esta estrategia fue validada utilizando tumores ováricos como ejemplo. El protocolo de secuenciación de próxima generación (MPseq) de pareja de relaciones de posición se utilizó para identificar alteraciones estructurales y siguió el análisis de alteraciones potencialmente objetivos. Los tumores humanos cultivados en ratones inmunocomprometidos fueron tratados con medicamentos seleccionados en base a los análisis genómicos. Los resultados demostraron una buena correlación entre las respuestas predichas y las observadas en el modelo PDX. El enfoque presentado se puede utilizar para probar la eficacia de los tratamientos combinados y ayudar a un tratamiento personalizado para pacientes con cáncer recurrente, específicamente en los casos en que la terapia estándar falla y hay una necesidad de usar medicamentos fuera de etiqueta.
Introduction
Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), que se generan a partir de la implantación de piezas tumorales de pacientes en ratones inmunodeficientes, han surgido como un potente modelo preclínico para ayudar a la atención personalizada contra el cáncer. Los modelos PDX han sido desarrollados con éxito para una variedad de neoplasias malignas humanas. Estos incluyen cáncer de mama y ovario, melanoma maligno, cáncer colorrectal, adenocarcinoma pancreático, y cáncer de pulmón de células no pequeñas1,,2,3,4,5. El tejido tumoral se puede implantar ortotópica o heterotópicamente. El primero, considerado más preciso pero técnicamente difícil, implica el trasplante directamente en el órgano de origen tumoral. Se cree que este tipo de modelos imitan con precisión la histología del tumor original debido al microambiente "natural" para el tumor6,,7. Por ejemplo, el trasplante ortotópico en la bursa del ovario de ratón dio lugar a la diseminación del tumor en la cavidad peritoneal y la producción de ascitis, típica del cáncer de ovario8. Del mismo modo, la inyección de tumores de mama en el torácico en lugar de la glándula mamaria abdominal afectó la tasa de éxito y el comportamiento de LA PDX9. Sin embargo, los modelos ortotópicos requieren sofisticados sistemas de diagnóstico por imágenes para monitorear el crecimiento tumoral. La implantación heterotópica del tumor sólido se realiza típicamente mediante la implantación de tejido en el flanco subcutáneo de un ratón que permite una monitorización más fácil del crecimiento tumoral y es menos costosa y consume mucho tiempo7. Sin embargo, los tumores crecidos por vía subcutánea rara vez metástasis a diferencia de como se observó en el caso de la implantación ortotópica10.
Se ha demostrado que la tasa de éxito del injerto varía y depende en gran medida del tipo de tumor. Se informó que los tumores más agresivos y los muestras de tejido que contenían un porcentaje más alto de células tumorales tenían mejores tasas de éxito12,,13. De acuerdo con esto, se demostró que los tumores derivados de sitios metastásicos se injertaban a frecuencias de 50-80%, mientras que los de sitios primarios ingrafales a frecuencias tan bajas como 14%12. Por el contrario, el tejido que contiene células necróticas y menos células tumorales viables injerta mal. El crecimiento tumoral también se puede promover mediante la adición de proteínas de matriz de membrana sótano en la mezcla de tejido en el momento de la inyección en ratones14 sin comprometer las propiedades del tumor original. También se encontró que el tamaño y el número de piezas de tejido destinadas a la implantación afectan la tasa de éxito del injerto. Se notificaron mayores tasas de toma de tumor para la implantación en la cápsula subrre renal en comparación con la implantación subcutánea debido a la capacidad de la cápsula subrre renal para mantener el estroma tumoral original y proporcionar las células estromales del huésped, así15.
La mayoría de los estudios utilizan ratones inmunodeficientes NOD/SCID, que carecen de células asesinas naturales16 y se ha demostrado que aumentan el injerto tumoral, el crecimiento y la metástasis en comparación con otras cepas14. Sin embargo, se requiere un monitoreo adicional, ya que pueden desarrollar linfomas timicos tan pronto como 3-4 mes de edad13. En los trasplantes de tumores ováricos cultivados en ratones SCID, el crecimiento de las células B fue inhibido con éxito por rituximab, impidiendo el desarrollo de linfomas pero sin afectar el injerto de tumores ováricos17.
Más recientemente, NSG (NOD. Los ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ), portadores de una mutación nula en el gen que codifica la cadena gamma del receptor18de interleucina 2, se convirtieron en una cepa utilizada con frecuencia para la generación de modelos PDX. Se informa que los tumores de los modelos PDX establecidos a las generaciones futuras de ratones conservan propiedades histológicas y moleculares de 3 a 6 generaciones19,,20. Numerosos estudios han demostrado que los resultados del tratamiento en los modelos PDX imitan a los de sus pacientes correspondientes2,,3,4,21,22,23. La tasa de respuesta a la quimioterapia en los modelos PDX para el cáncer de pulmón no pequeño y los carcinomas colorrectales fue similar a la de los ensayos clínicos para los mismos fármacos24,,25. Los estudios realizados en modelos PDX, desarrollados para pacientes inscritos en ensayos clínicos, demostraron respuestas a fármacos probados similares a los observados clínicamente en pacientes correspondientes2,,3,,4.
Los análisis genómicos de alto rendimiento de un tumor de paciente junto con los modelos PDX proporcionan una poderosa herramienta para estudiar correlaciones entre alteraciones genómicas específicas y una respuesta terapéutica. Estos se han descrito en algunas publicaciones26,27. Por ejemplo, las respuestas terapéuticas al inhibidor del EGFR cetuximab en un conjunto de modelos de PDX colorrectal que llevan amplificación de EGFR, respuestas clínicas paralelas a cetuximab en pacientes28.
Hay algunos desafíos asociados con el desarrollo y la aplicación de modelos PDX. Entre ellos se encuentra la heterogeneidad tumoral29,30 que puede comprometer la precisión de la interpretación de la respuesta al tratamiento como un clon de una sola célula con mayor capacidad proliferativa dentro de un PDX puede superar a los otros31,lo que resulta en una pérdida de heterogeneidad. Además, cuando se utilizan biopsias de un solo tumor para desarrollar PDX, algunas de las poblaciones celulares pueden perderse y no estarán representadas en el injerto final. Se recomiendan varias muestras del mismo tumor para que la implantación resuelva este problema. Aunque los tumores PDX tienden a contener todos los tipos celulares del tumor donante original, estas células se sustituyen gradualmente por las de origen murino3. La interacción entre el estroma murino y las células tumorales humanas en los modelos PDX no se entiende bien. Sin embargo, se demostró que las células estromales recapitulan el microambiente tumoral33.
A pesar de estas limitaciones, los modelos PDX siguen siendo una de las herramientas más valiosas para la investigación traslacional, así como la medicina personalizada para seleccionar terapias para pacientes. Las principales aplicaciones de los PDX incluyen el descubrimiento de biomarcadores y las pruebas de drogas. Los modelos PDX también se utilizan con éxito para estudiar los mecanismos de resistencia a los medicamentos e identificar estrategias para superar la resistencia a los medicamentos34,,35. El enfoque descrito en el presente manuscrito permite al investigador identificar posibles dianas terapéuticas en tumores humanos y evaluar la eficacia de los fármacos correspondientes invivo, en ratones que albergan tumores injertados que inicialmente se caracterizaron genómicamente. El protocolo utiliza tumores ováricos injertados por vía intraperitoneal, pero es aplicable a cualquier tipo de tumor lo suficientemente agresivo para crecer en ratones2,3,12.
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Protocol
En el momento de la cirugía de desbultar según un protocolo aprobado por mayo Clinic Institutional Review Board (IRB), se recogieron tejidos frescos de pacientes que consienten el cáncer de ovario. Todos los procedimientos y tratamientos con animales utilizados en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic y siguieron las pautas de cuidado animal.
1. Secuenciación y análisis de pares de relaciones
NOTA: El tejido congelado fresco o flash debe utilizarse para la secuenciación de pares de relaciones de posición (MPseq). El material incrustado de parafina no es adecuado porque contiene ADN fragmentado.
- Aísle el ADN del tejido tumoral congelado. Utilice la muestra humana original obtenida a partir de material quirúrgico o biopsia36.
- Utilice 1000 ng de ADN para crear bibliotecas MPseq y secuenciar como 2 muestras por carril en el secuenciador de próxima generación (ver Tabla de Materiales)36.
- Analizar datos utilizando un conjunto de algoritmos para detectar grandes aberraciones cromosómicas (eliminaciones, inserciones, amplificaciones, inversiones y translocaciones) como se describió anteriormente36,,37.
2. Selección de dianas terapéuticas
- Utilice la herramienta Panda de acceso abierto (Camino y anotación) o una herramienta análoga para identificar alteraciones específicas (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- Haga una lista de genes identificados por MSeq como alterados, como un simple archivo delimitado por tabulaciones, utilizando símbolos genéticos aceptados estándar.
NOTA: El ejemplo incluido presenta el análisis de amplificaciones y ganancias. - Agregue un signo de "-" a la línea de encabezado de la lista para asegurarse de que el encabezado de la tabla se transfiere a la vista de nivel de ruta del software.
- Cargue el archivo haciendo clic en la pestaña de navegación Cargar conjunto de anotaciones.
- Asigne un solo icono del menú para representar los datos subyacentes haciendo clic en el icono de su elección y, a continuación, haciendo clic en la pestaña Finalizar.
- Después de cargar los archivos de anotación, identifique una columna que muestre el número de genes anotados por ruta. Esta es la última columna a la derecha.
- Utilice Filtro de ruta en la parte superior izquierda de la ventana principal para mostrar las vías que contienen genes de interés.
- Identificar vías que tienen más genes anotados de lo que se espera por casualidad. Utilice la función situada en la pestaña Enriquecimiento.
- Seleccione una base de datos para mostrar genes potencialmente farmacológicas de Preset Annotation comprobando un icono apropiado a la izquierda de la ventana principal (por ejemplo, DGIdb, PharmGKB).
- Seleccione la ruta para la visualización haciendo clic en su nombre que se muestra en la página Visor de rutas.
NOTA: Los iconos que representan cada conjunto de anotaciones se muestran junto al gen asociado. Haga clic en el gen de interés para abrir la página web de GeneCards correspondiente. - Seleccione las vías que mostraron los genes anotados de interés (es decir, alterados en un tumor dado) y "hits" para fármacos potenciales para su análisis posterior.
- Haga una lista de genes identificados por MSeq como alterados, como un simple archivo delimitado por tabulaciones, utilizando símbolos genéticos aceptados estándar.
- Utilizar una base de datos que contenga medicamentos aprobados para aplicación clínica (https://clinicaltrials.gov/) para cotejar los objetivos identificados.
- Priorice las alteraciones dirigidas para realizar más pruebas en modelos PDX realizando una revisión de la literatura (por ejemplo, PubMed) para confirmar la relevancia para la biología de un tipo particular de tumor.
3. Validación de reordenamientos genómicos por PCR y secuenciación de Sanger
- Diseñe imprimaciones utilizando lecturas de secuenciación obtenidas a partir de datos MPseq.
- Seleccione una unión de interés para la validación (es decir, la meta terapéutica potencial) basada en análisis MPseq.
- Diseñe imprimaciones direccionalmente de tal manera que el amplicon contenga la unión. Diseño 2 imprimaciones a cada lado de la unión, para un total de 4, para aumentar las posibilidades de amplificar la unión.
NOTA: Nombre las imprimaciones según la ubicación del caso y del cromosoma. - Utilice parámetros PCR estándar para el diseño de imprimación y un software de elección. Seleccione la temperatura de fusión (60-62 oC) y el contenido de GC (40-60%). Asegúrese de que la secuencia de imprimación no forma dimers de imprimación, palíndromos o bucles de horquilla.
- Confirme que la secuencia de imprimación carece de homología en otras áreas del genoma humano comprobándola usando BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- Ejecute un PCR para amplificar la unión de interés.
- Diluir las imprimaciones con agua a 10 mM y combinar 10 ml de cada imprimación para que cada imprimación hacia adelante se empareje con cada imprimación inversa en una mezcla de imprimación.
NOTA: Las secuencias para las imprimaciones para el ejemplo seleccionado se muestran en la Tabla 1. - Etiquete los tubos de tira de 0,2 ml como: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 y T4 donde C-control adn genómico humano (comercial), ADN T-tumor, aislado del paciente o tumor PDX, y el número indica la mezcla de imprimación.
- Agregue 1 ml de cada mezcla de imprimación en sus tubos etiquetados.
- Preparar la mezcla maestra Taq combinando los reactivos enumerados en la Tabla 2,dejando la enzima en el congelador hasta que sea necesario, añadiéndola a la mezcla al final.
- Hacer 2 mezclas maestras, una para cada plantilla de ADN, controlar el ADN humano y el ADN tumoral. Agregue 24 ml de cada mezcla maestra de Taq a su respectivo tubo de tira. El volumen total de reacción es de 25 ml. Vórtice muy brevemente y luego gire el tubo de tira hacia abajo.
- Ejecute un PCR en un termociclador. Utilice los parámetros que se muestran en la Tabla 3. Ajuste la temperatura de recocido de modo que esté al menos 1 oC más fría que la temperatura de fusión de las imprimaciones.
- Almacene el producto de PCR completo a -20 oC (a largo plazo) o refrigerado a 4 oC (a corto plazo) hasta que sea necesario.
- Realizar electroforesis a 1-5 V/cm para visualizar el producto PCR utilizando un gel de agarosa del 1,5%. Dejar 2 ml de alícuota del producto que se utilizará para la secuenciación de Sanger.
- Diluir las imprimaciones con agua a 10 mM y combinar 10 ml de cada imprimación para que cada imprimación hacia adelante se empareje con cada imprimación inversa en una mezcla de imprimación.
- Realice la secuenciación de Sanger para confirmar el cruce e identificar el punto de interrupción exacto38.
- Utilice el producto PCR si el PCR generó un solo producto (banda). Alternativamente, cortar la banda de gel, purificar y someter para la secuenciación de Sanger junto con la imprimación utilizada para la amplificación.
NOTA: Los tumores para los que se realizaron análisis genómicos se utilizan para la implantación en ratones.
- Utilice el producto PCR si el PCR generó un solo producto (banda). Alternativamente, cortar la banda de gel, purificar y someter para la secuenciación de Sanger junto con la imprimación utilizada para la amplificación.
4. Injerto y mantenimiento de tumores
- Configure preparaciones para injerto de tumores en modelos de ratón PDX. Seleccione para tumores de injerto para los que se realizarán o se han realizado análisis genómicos.
- Asegúrese de que existe una infraestructura de apoyo en el momento del inicio del desarrollo de cualquier modelo PDX, incluidas instalaciones especializadas en laboratorio y animales, personal técnico cualificado y procedimientos operativos estándar detallados.
- Asegúrese de que el transporte y procesamiento rápido de las muestras, ya que la velocidad es crucial para la viabilidad celular y el injerto exitoso.
- Utilice un ambiente estéril para reducir la contaminación bacteriana y fúngica para procesar e injerer muestras.
- Manejar especímenes humanos con precaución, de acuerdo con las políticas institucionales relativas a los materiales potencialmente biopeligrosos, ya que pueden albergar patógenos transmitidos por la sangre.
- Preparar el tejido (0,5-0,7 cm3 de tamaño) para el injerto mediante la colocación de la muestra quirúrgica en un tubo pre-refrigerado de 50 ml con 20 ml de medios de cultivo de tejido.
NOTA: El tejido tumoral puede ser fresco o recuperado del material previamente crioconservado5. - Confirme el contenido del tumor en la muestra consultando a un patólogo.
- Coloque el tejido tumoral en un plato que contenga 10-15 ml de PBS frío, o medios de cultivo de tejidos como RPMI 1640 o DMEM que contengan antibióticos (1% penicilina y estreptomicina).
- Identificar y aislar material tumoral viable del tejido normal y necrótico adyacente con la ayuda de un patólogo. Utilice fórceps estériles y bisturí para eliminar el material necrótico señalado por un patólogo.
NOTA: El tumor se puede implantar por vía intraperitoneal o subcutánea en los ratones. Siga el paso 4.2 para realizar una implantación intraperitoneal o vaya al paso 4.3 para realizar un injerto subcutáneo. En este estudio, se probaron terapias dirigidas seleccionadas basadas en análisis genómicos en una serie de modelos PDX para el cáncer de ovario seroso de alto grado con implantación intraperitoneal.
- Preparar el tejido para la implantación intraperitoneal (IP) que pica el tejido con fórceps estériles y un bisturí sobre hielo para hacer piezas de aproximadamente 1-1,5 mm3 de tamaño y mezclar con medio de cultivo frío. Inyectar de 0,3 a 0,5 ml de lodos tumorales con una aguja de calibre 16-17.
NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan mediante técnicas asépticas. Se utilizaron guantes estériles, instrumentos estériles, suministros y materiales implantados para reducir la probabilidad de infección.- Mezclar las piezas 1:1 con un medio de cultivo helado e inyectar 100 ml intraperitonealmente en al menos tres ratones SCID hembras.
- Corte el tejido tumoral para el injerto subcutáneo usando fórceps estériles, bisturí o tijeras quirúrgicas en pequeños fragmentos, de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm de tamaño, y transfiera los tejidos fragmentados a una placa de Petri pre-refrigerada sobre hielo.
- Agregue la matriz de membrana sótano fría en el plato con el tejido fragmentado (aproximadamente 200 ml por cada 10 trozos de tejido), mezcle bien y deje que los fragmentos de tejido se empapen en la matriz de membrana fría del sótano durante 10 minutos.
- Anesthetize 5 ratones hembra NOD/SCID para prepararlos para el injerto.
- Inyectar cada ratón por vía intraperitoneal con ketamina (150 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) combinada.
- Confirme que el ratón está correctamente anestesiado pellizcando la punta de la cola con fórceps atraumáticos.
- Retire suavemente completamente el ratón anestesiado de la cámara y ponga en el ratón un cono de nariz que tenga entrada del vaporizador y la salida del sistema de barrido de gases de desecho.
- Ponga la pomada veterinaria en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Prepare el área donde se realizará la cirugía. Utilice una técnica aséptica para realizar la cirugía.
- Asegúrese de que la superficie en la que se va a tomar la cirugía no es porosa, sella y se desinfecta antes de la cirugía.
- Comience la cirugía con instrumentos estériles (por autoclave, gas o esterilización química).
- Utilice guantes para manejar instrumentos y mantener la esterilidad de las puntas del instrumento durante todo el procedimiento sumergiéndolos en etanol entre los pasos de la cirugía.
- Esterilice el sitio quirúrgico aplicando 3 exfoliantes alternos de yodo y alcohol. Utilice tijeras quirúrgicas estériles y fórceps para hacer una incisión vertical de la piel de 5-10 mm en ambos flancos de un ratón.
- Inserte los fórceps rectos suavemente en el espacio subcutáneo para crear un bolsillo lo suficientemente grande como para que un fragmento de tumor se coloque debajo de la almohadilla de grasa.
- Utilice los fórceps rectos estériles para insertar fragmentos de tumor en el bolsillo previamente preparado en cada uno de los 5 ratones.
NOTA: Coloque 3-4 pedazos de tejido tumoral en un bolsillo. - Cierre las incisiones de la piel usando pegamento tisú.
- Inyectar intraperitonealmente cada ratón con 100 ml de Rituximab después de la implantación para inhibir la proliferación de linfocitos.
- Coloque el ratón en una jaula debajo de una lámpara de calor durante aproximadamente 20 minutos hasta que se recupere de la anestesia. Monitoree los signos vitales del ratón y asegure su hidratación suficiente.
- Devolver el ratón a la compañía de otros ratones después de que se recuperó de la anestesia y comenzó a tener alimentos y agua. Proporcionar atención postoperatoria y monitoreo de acuerdo con las pautas institucionales. Compruebe si hay signos de dolor y angustia diariamente durante 3 días consecutivos después de la cirugía.
NOTA: Los criterios para el dolor o la angustia incluyen necrosis o ulceración, puntuación de pérdida de peso/condición corporal, signos conductuales como el nivel de actividad, la función motora y la postura. - Revise rutinariamente los ratones para la formación de tumores quincenalmente hasta que los tumores alcancen el tamaño de 0,5 cm de diámetro medido por una pinza.
- Evalúe la puntuación de salud de cada ratón como se deriva de la apariencia, el comportamiento y la condición corporal39. Utilice decenas de 6 n.o 6 como criterio para que los ratones moribundos sean sacrificados por inhalación de dióxido de carbono.
5. Prueba de respuestas a objetivos identificados genómicamente en modelos PDX
- Iniciar los tratamientos dirigidos seleccionados cuando los tumores son palpables y alcanzan 0,5 cm3 medidos por una ecografía.
- Antes de realizar una ecografía del abdomen, retire el pelaje abdominal del ratón y aplique lubricante de jalea estéril.
- Utilice una máquina de ultrasonido con un transductor para obtener imágenes con el tumor colocado en sección transversal. Haga 3 mediciones por sesión para cada animal y promede el valor para una evaluación más precisa del tamaño del tumor.
- Analice las imágenes utilizando el software disponible40.
- Administrar quimioterapia consistente en una mezcla de carboplatino a 51 mg/kg y paclitaxel a 15 mg/kg por vía intraperitoneal (IP) una vez a la semana para una duración total del tratamiento de 4-6 semanas. Asegúrese de que el volumen total de inyección no exceda de 0,2 ml.
- Haga una solución en stock MK-220641 en 30% de ciclodextrina (por ejemplo, Captisol) y entregue por vía oral a 120 mg/kg al día durante 4 semanas consecutivas.
- Prepare el ratón para el gavage oral sosteniéndolo pellizcando la piel de la espalda y clavándola hacia atrás, de modo que la cabeza y las extremidades del ratón estén inmovilizadas.
- Inserte la sonda gavage por la parte posterior de la garganta del ratón hasta que la sonda llegue al esófago. Asegúrese de que la sonda no se inserta demasiado lejos, ya que los pulmones del ratón pueden perforarse, causando la muerte.
- Haga una solución de stock MK-866942 en etanol a 25 mg/ml. Diluirlo en un vehículo que contenga 5,2% de Tween 80, 5,2% PEG400 en agua estéril para inyecciones IP a 10 mg/kg durante 5 días cada dos semanas, con una duración total del tratamiento de 4 semanas.
NOTA: El volumen inyectado en ratones debe ser de 50-120 ml, dependiendo del peso del animal. - Utilice 7-8 ratones por grupo de tratamiento para tener suficiente potencia estadística para detectar diferencias43,44.
- Evaluar el peso corporal y el estado general de los ratones en terapia diariamente. Retenga los medicamentos si el peso de un animal cae un 20% o más de su peso inicial.
- Evalúe el tamaño del tumor semanalmente mediante la exploración por ultrasonido. Asegúrese de que la persona que realiza el seguimiento del crecimiento tumoral esté cegada al tratamiento para asegurar la puntuación imparcial de las respuestas.
NOTA: Los laboratorios más pequeños pueden emplear a 2 personas diferentes para administrar el tratamiento y la monitorización por ultrasonido.
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Representative Results
El tejido de los tumores ováricos resecados en el momento de las cirugías de desbultadas se recogió de acuerdo con la guía del IRB y se utilizó para 1) caracterización genómica y 2) injerto en ratones inmunocomprometidos (Figura 1). El protocolo de secuenciación de pares de mate36,37 se utilizó para identificar alteraciones estructurales en el ADN, incluidas las pérdidas, ganancias y amplificaciones. En la Figura 2se muestra una gráfica representativa del genoma que ilustra un paisaje de cambios genómicos en un tumor (designado como OC101). Típico de tumores serosos de alto grado, se encontraron múltiples ganancias (líneas azules) y deleciones (líneas rojas), lo que indica altos niveles de inestabilidad genómica, así como pérdidas y ganancias cromosómicas, indicativas de la aneuploidía. En un promedio 300-700 alteraciones totales se identifican en tumores serosos de alto grado subtipo45. Los análisis posteriores revelaron algunas alteraciones del ADN que eran potencialmente dirigidas con fármacos clínicamente relevantes. La alteración mejor clasificada para la intervención terapéutica en el tumor OC101 fue una amplificación en el cromosoma 17 en el que participaron ERBB2(Figura 2 y Figura 3A). ERBB2 es un gen que codifica para el receptor HER2 que se conoce al dimerización con EGFR, HER3 o HER4 para activar las vías de señalización RAS/ERK y PI3K/AKT y promover el crecimiento celular, la migración celular y la invasión. Los inhibidores de HER2 (p. ej., anticuerpos monoclonales pertuzumab y trastuzumab) son eficaces en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama cuando los tumores sobreexpresen la proteína HER2. Sin embargo, la terapia anti-HER2 para el cáncer de ovario no está aprobada por la FDA.
La comparación del perfil genómico del tumor de los pacientes donantes (Figura 1) con el de un modelo PDX correspondiente (no mostrado) reveló una similitud sorprendente, consistente con todos los estudios anteriores que informaban de la cercanía molecular de los tumores originales a sus derivados PDX.
Para validar los resultados de MPseq a nivel de ADN, se diseñaron varios conjuntos de imprimaciones específicas para los bordes de la región amplificada que contienen el gen ERBB2, y la PCR se llevó a cabo utilizando ADN aislado del tumor original, así como de un tumor propagado durante varias generaciones en los ratones. En la Figura 3Bse muestra una imagen de gel representativa de productos amplificados utilizando dos conjuntos diferentes de imprimaciones. No se detectó ninguna banda cuando se amplificó el ADN genómico agrupado normal (designado como C), que no contenía amplificación del locus del ERBB. La purificación de los productos a partir del gel y la secuenciación de Sanger (no mostrado) confirmó aún más la alteración pronosticada por MPseq. Se realizó una mayor validación examinando la expresión de la proteína HER2 en el tumor PDX correspondiente mediante inmunoblotting. El análisis reveló un alto nivel de proteína HER2 (no se muestra el resultado), consistente con la amplificación observada del gen ERBB2.
En el ADN de un tumor ovárico diferente (designado T14) se observaron numerosas ganancias regionales. Entre ellos se incluían los genes AKT2 y RICTOR(Figura 3C). Ambos fueron de gran interés desde una perspectiva terapéutica como inhibidores de AKT2 y mTOR, con los que RICTOR se asocia, están disponibles y actualmente en ensayos clínicos. Puesto que no había lecturas de pareja de relaciones de posición que abarcaran las proximidades de cualquiera de los genes, no fue posible validar la ganancia como la detectada por MPseq. Por lo tanto, probamos el nivel de expresión de las proteínas correspondientes mediante inmunobloqueo. Se observaron altos niveles de AKT y RICTOR (Figura 3D) que sugieren que el tratamiento con medicamentos dirigidos está justificado.
Para probar la sensibilidad de este tumor a los inhibidores de AKT y mTOR, los ratones PDX con tumor T14 implantado intraperitonealmente se ampliaron y aleatorizaron para recibir únicamente quimioterapia (carboplatino/paclitaxel) o una combinación de quimioterapia con inhibidor pan-AKT MK-220641 o inhibidor de mTOR MK-866942. Se dio quimioterapia a ratones en el brazo combinado durante 2 semanas antes de la adición del tratamiento dirigido (Figura 4). Las mediciones por ultrasonido se tomaron semanalmente para monitorear la regresión/crecimiento del tumor.
Cada brazo de tratamiento contenía no menos de 7 ratones. Este número fue suficiente para observar las diferencias en las respuestas entre los grupos, manteniendo los costos del estudio en una marca considerablemente más baja. Se pueden utilizar menos ratones (tres a cuatro) en el grupo de control no tratado, ya que las variaciones individuales en la tasa de crecimiento tumoral son insignificantes y el crecimiento se normaliza a un tamaño de tumor al que comienza el tratamiento en otros brazos.
No se observó diferencia entre los grupos quimiotrazados y no tratados en las primeras 3 semanas de observación (no mostrados). Se observó una reducción significativa de la carga tumoral (58% mediana) en el grupo tratado con quimioterapia al final de la semana 6. Se observó un beneficio adicional sobre la quimioterapia solo en grupos que recibieron una combinación de quimioterapia con terapias dirigidas. La diferencia se hizo evidente en las semanas 4 y 3 para MK-8669 (Figura 4A) y MK-2206 (Figura 4B) respectivamente.
Los animales fueron eutanasiados y se recogió tejido tumoral para análisis moleculares de la respuesta al tratamiento al final del ensayo de tratamiento en la semana 7. A tal fin, las cantidades de quinasa S6 total y fosforilada (Figura 5A,B), AKT y mTOR (Figura 5C,D) se determinaron utilizando inmunoblotting. La proteína ribosomal S6 quinasa es un mensajero aguas abajo de la vía AKT-mTOR, conocida por ser regulada y fosforilada tras la estimulación del eje AKT-mTOR por factores de crecimiento para promover la supervivencia y el crecimiento celular. La comparación de los niveles de estas proteínas en tumores PDX no tratados o tratados con quimioterapia con ratones que recibieron inhibidores de AKT o mTOR mostró una marcada disminución en estas dos últimas(Figura 5),lo que indica la eficacia del tratamiento dirigido a nivel molecular. Los ajustes en el regimiento de tratamiento, en cuanto a los plazos de aplicación para los medicamentos combinados y la duración de la terapia, deben hacerse y probarse para lograr mejores respuestas.
| Primer Nombre | Secuencia | Mezcla de primer | Primers combinados | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 y R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTAGTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 y R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 y R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 y R2 | ||
Tabla 1: Primers utilizados para la validación de la alteración del cromosoma 17.
| Reactivo | Cantidad a añadir para 1 reacción (L) | Cantidad a añadir para 4 reacciones (L). [Multiplicar por 4.3 para hacer suficiente para cada mezcla de imprimación (4)] |
| Agua sin nucleasas | 20.45 | 89.94 |
| 10x buffer (Fácil A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTP 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| ADN de la plantilla (concentración >10 ng/L) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymerasa | 0.25 | 1.08 |
Tabla 2: Configuración de PCR para validar un cruce.
| Temp (C) | Hora | |
| 94 | 5 min | |
| 94 | 40 s | 35 ciclos |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 min | |
| 72 | 5 min | |
| 4 | Mantener |
Tabla 3: Condiciones de ciclismo para que la PCR valide un cruce.
Figura 1: Representación esquemática de la estrategia para las pruebas de terapia guiada genómica utilizando modelos PDX para carcinoma ovárico seroso. Se muestra tinción H&E del tumor ovárico (arriba). Barra de escala 100 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización genómica de tumores ováricos mediante MPseq. Gráfica del genoma que muestra el panorama de las alteraciones estructurales y los cambios de número de copia detectados por MPseq. El eje X abarca la longitud del cromosoma con el número de posición del cromosoma mostrado. Cada cromosoma se indica en el eje Y derecho e izquierdo. La altura de las trazas horizontales para cada cromosoma indica el número de lecturas detectadas para ventanas de par base de 30k. Los números de copia de ADN se indican por color, con gris que representa el estado de copia 2N normal, rojo correspondiente a eliminaciones y ganancias de azul a. La conexión de líneas negras corresponde a reordenamientos cromosómicos. Se representan las alteraciones en el locus de ERBB2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Selección de alteraciones específicas y su validación. (A) Un segmento de primer plano de la gráfica del genoma que se muestra en la Fig.1 que ilustra una amplificación del gen ERBB2 en el cromosoma 17 (en azul). Los números cromosómicas son los indicados. (B) Análisis de validación de puntos de interrupción en el locus ERBB2 identificado por MPseq mediante amplificación de PCR. C es un control de ADN genómico agrupado, OC101 es ADN del tumor del paciente, M es una escalera de ADN. (C) Un primer plano de los segmentos de la gráfica del genoma para otro tumor ovárico que muestra ganancias (indicadas por la línea azul) en el locus AKT (arriba) y en el gen RICTOR (abajo). Los cromosomas son los indicados. (D) Se utilizaron análisis de validación de la expresión de proteínas de la vía AKT/mTOR mediante inmunoblotting utilizando tejido tumoral de PDX (T14), alteraciones genómicas que se representan en C. 30 mg de proteína total y anticuerpos específicos a AKT, RICTOR, p-mTOR. MAPK sirvió como un control de carga. Pos con es un tumor independiente utilizado como control positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La comparación de las respuestas a la quimioterapia sola y combinada con la terapia dirigida en los aumentos de los tumores en los genes AKT2 y RICTOR con los fármacos correspondientes. Respuestas al tratamiento a una combinación de quimioterapia y fármaco anti-mTOR MK-8669 (A) o inhibidor de pan-AKT MK2206 (B) frente a la quimioterapia sola. El tiempo de administración de cada tratamiento y la duración se muestran mediante las flechas. Los volúmenes se expresan como porcentaje del volumen inicial al inicio del tratamiento como media +/- La quimioterapia es quimioterapia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comparación de los cambios moleculares provocados por cada tratamiento según lo determinado por el análisis de inmunoblotting. (A) Se muestran los niveles de S6 y fosfo-S6, el efector aguas abajo de la vía AKT-mTOR. Se utilizaron 30 mg de proteína total y anticuerpos específicos a S6 y p-S6. GAPDH se utilizó como control de carga. La cuantificación de los niveles de proteínas normalizadas al nivel GAPDH se muestra en (B) (C) Niveles de mTOR, p-mTOR, AKT y p-AKT detectados por inmunoblotting. GAPDH se utilizó como control de carga. (D) Cuantificación de los niveles de proteínas normalizadas al nivel GAPDH. No se trata NT, la quimioterapia es quimioterapia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos el enfoque y los protocolos que utilizamos para llevar a cabo un "ensayo clínico" en modelos PDX que aprovecha las características moleculares del tumor obtenidas por el perfil genómico para determinar la mejor elección de fármacos para las pruebas. Actualmente se utilizan múltiples plataformas de secuenciación para la caracterización genómica de tumores primarios, incluida la secuenciación del genoma completo, RNAseq y paneles genéticos personalizados. Para el carcinoma ovárico seroso de alto grado, MPseq para identificar alteraciones estructurales, reordenamientos del ADN y cambios en el número de copia, es particularmente útil debido al alto grado de inestabilidad genómica observado en este tipo de tumor. La segunda ventaja de la plataforma MPseq es que cubre todo el genoma, pero cuesta significativamente menos que otras tecnologías de secuenciación integrales. MPseq, sin embargo, no es adecuado para la detección de mutaciones puntuales, ya que la cobertura base no es suficiente, alcanzando sólo 8-10x. Una de las limitaciones del uso de MPseq solo para la caracterización genómica de un tumor es la presencia de complejos reordenamientos cromosómicos agrupados, cuyo análisis no predice la expresión de genes de interés impactados. Una unión detectada por MPseq predicho para crear un gen de fusión putativa que valida en el ADN por PCR puede no expresarse debido a un cambio de trama o pequeñas deleciones e inserciones en la región promotora. Del mismo modo, las ganancias y amplificaciones cromosómicas para posibles dianas terapéuticas deben evaluarse y validarse cuidadosamente a nivel de ARN o proteína para garantizar la expresión del gen de interés.
Aunque, la composición molecular del tumor se preserva en gran medida después de la propagación en ratones durante varias generaciones, los cambios en los niveles de expresión de genes clave pueden ocurrir con el tiempo, ya sea reflejando la evolución tumoral, la selección clonal o la respuesta adaptativa al ambiente murino. Por lo tanto, la validación de una alteración destinada a la intervención terapéutica tanto en el tumor original del donante como en el tumor PDX es fundamental. Para el tumor aislado de los modelos PDX, tanto el ARN como la proteína se pueden utilizar para interrogar el nivel de expresión a medida que el material es abundante. Cualquiera de los dos puede ser elegido para cotejar la expresión en el tumor original, dependiendo de la disponibilidad y el tipo del tejido almacenado, y la disponibilidad de anticuerpos para la detección de proteínas correspondiente. El modelo PDX es específicamente invaluable en las terapias combinadas de prueba, ya que el ajuste in vivo permite el monitoreo de efectos adversos, así como ajustes de dosis o duración en el régimen de tratamiento.
La elección entre el enjerto ortotópico y el injerto subcutáneo se puede hacer dependiendo de las preguntas específicas que se abordan en el estudio. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la sensibilidad de los tumores xenoinjertados a las terapias puede ser modulada por el sitio de implantación46. Por otro lado, todavía no se ha informado de ninguna evidencia sobre el descubrimiento de fármacos que muestren una respuesta terapéutica en modelos ortotópicos pero ausentes en PDX9implantado por vía subcutánea.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Individualizada (CIM) de Mayo Clinic, Dr. Lin Yang y Faye R. Harris, MS, por la ayuda en la realización de experimentos. Este trabajo fue apoyado por el Regalo del Sr. y la Sra. Neil E. Eckles al Centro de Medicina Individualizada (CIM) de Mayo Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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