Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering af In Vitro Differentiering af humane primære Keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en trinvis procedure for in vitro differentiering af menneskelige primære keratinocytter ved kontakt hæmning efterfulgt af karakterisering på molekylært niveau ved RNA-seq analyse.

Abstract

Menneskelige primære keratinocytter bruges ofte som in vitro modeller for undersøgelser af epidermal differentiering og relaterede sygdomme. Metoder er blevet rapporteret for in vitro differentiering af keratinocytter dyrket i to-dimensionelle (2D) neddykket manerer ved hjælp af forskellige induktion betingelser. Beskrevet her er en procedure for 2D in vitro keratinocyt differentieringsmetode ved kontakt hæmning og efterfølgende molekylær karakterisering af RNA-seq. Kort sagt dyrkes keratinocytter i defineret keratinocytmedium suppleret med vækstfaktorer, indtil de er fuldt sammenflydende. Differentiering er induceret af tætte kontakter mellem keratinocytter og yderligere stimuleres ved at udelukke vækstfaktorer i mediet. Ved hjælp af RNA-seq-analyser viser det sig, at begge 1) differentierede keratinocytter udviser forskellige molekylære signaturer under differentiering, og 2) det dynamiske genekspressionsmønster ligner stort set celler under epidermal stratificering. Med hensyn til sammenligning med normal keratinocyt differentiering, keratinocytter regnskabsmæssige mutationer af transskription faktor p63 udviser ændret morfologi og molekylære signaturer, i overensstemmelse med deres differentiering defekter. Afslutningsvis beskriver denne protokol trinene for 2D in vitro keratinocyt differentiering og dens molekylære karakterisering, med vægt på bioinformatisk analyse af RNA-seq data. Da RNA-ekstraktion og RNA-seq-procedurer er veldokumenterede, er det ikke fokus for denne protokol. Den eksperimentelle procedure for in vitro keratinocyt differentiering og bioinformatik analyse rørledning kan bruges til at studere molekylære hændelser under epidermal differentiering i raske og syge keratinocytter.

Introduction

Menneskelige primære keratinocytter stammer fra den menneskelige hud bruges ofte som en cellulær model til at studere biologi i epidermis1,2,3,4. Stratificeringen af epidermis kan modelleres ved keratinocyt differentiering, enten i en 2D neddykket monolag mode eller 3D luft-lift organotypic model2,3,5,6,7. Selv om 3D-modeller er blevet stadig vigtigere at vurdere den epidermale struktur og funktion, 2D differentiering modeller er stadig meget udbredt, på grund af deres bekvemmelighed og muligheden for at generere et stort antal celler til analyse.

Der er anvendt forskellige betingelser for at fremkalde keratinocytdifferentiering i 2D, herunder tilsætning af serum, høj koncentration af calcium, lavere temperatur og hæmning af epidermal vækstfaktorreceptorer2,3. Hver af disse metoder er blevet valideret af en række keratinocyt differentiering markør gener og vist sig at være effektiv til at vurdere keratinocyt differentiering, herunder under patologiske forhold. Disse induktionsbetingelser viser imidlertid også forskelle i deres differentieringseffektivitet og kinetik, når specifikke paneler af markørgener undersøges2,3.

En af disse metoder indebærer keratinocyt kontakt hæmning og udtømning af vækstfaktorer i kulturen medium8. Det er blevet påvist, at keratinocytter kan skelne spontant, når cellerne når fuld tæthed.  Hvis vækstfaktorerne i kulturmediet udelukkes, kan det yderligere øge differentieringen. Metoden, der kombinerer kontakthæmning og nedbrydende vækstfaktorer, har vist sig at generere differentierede keratinocytter med genekspressionsmønstre svarende til den normale lagdelte epidermis, når du bruger flere epidermalemarkører 3,hvilket tyder på, at denne model er egnet til at studere normal keratinocytdifferentiering. For nylig er der rapporteret om to omfattende genudtryksanalyser af keratinocytdifferentiering ved hjælp af denne model9,10. Forskere valideret denne model på det molekylære niveau og viste, at det kan bruges til at studere normal og syg keratinocyt differentiering.

Denne protokol beskriver proceduren for in vitro differentieringsmetode og molekylær analyse af differentierede celler ved hjælp af RNA-seq. Det illustrerer også karakterisering af transskription af celler på differentiering dag 0 (spredning fase), dag 2, dag 4, og dag 7 (tidlig, midterste og sen differentiering, henholdsvis). Det er vist, at differentierede keratinocytter viser genekspressionsmønstre, der stort set ligner celler under epidermal stratificering. For at undersøge, om denne metode kan bruges til at studere hudpatologi, vi anvendt den samme eksperimentelle og analyse pipeline til at undersøge keratinocytter regnskabsmæssige mutationer af transskription faktor p63, der er afledt af patienter med ectrodactyly, ectodermal displaasia og cleft læbe / gane (EØF) syndrom11,12. Denne protokol fokuserer på in vitro differentiering af keratinocytter samt efterfølgende bioinformatisk analyse af RNA-seq. Andre trin i den komplette procedure såsom RNA ekstraktion, RNA-seq prøve forberedelse og bibliotek konstruktion, er veldokumenteret og kan nemt følges, især når du bruger mange almindeligt anvendte kommercielle kits. Disse trin er derfor kun kort beskrevet i protokollen. Dataene viser, at denne rørledning er egnet til at studere molekylære hændelser under epidermal differentiering hos sunde og syge keratinocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hudbiopsier blev taget fra stammen af raske frivillige eller patienter med p63 mutationer, at oprette den primære keratinocyt kultur. Alle procedurer vedrørende etablering af menneskelige primære keratinocytter blev godkendt af det etiske udvalg af Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Der blev indhentet informeret samtykke.

1. Human primær keratinocyt differentiering ved kontakthæmning

  1. Forbered keratinocyt vækstmedium (KGM) fra Keratinocyte Basal Medium (Tabel over Materialer) når det er nødvendigt.
  2. Lav 500 mL spredningsmedium ved hjælp af præfabrikerende lagre (KGM-pro; se tabel 1).
  3. Lav 500 ml differentieringsmedium (KGM-dif; se tabel 2).
    BEMÆRK: KGM med kosttilskud kan opbevares ved 4 °C i to uger. Ved længere opbevaring kan den aliquoteres og opbevares ved -20°C.
  4. Frø primære keratinocytter i tætheden af 5,0-20 x 103 celler / cm2,afhængigt af cellen proliferativ kapacitet. Tilsæt tilstrækkeligt KGM-pro medium til at dække celler.
    BEMÆRK: 1) Nærmere oplysninger om regelmæssig cellekultur inden for KGM medium kan findes på hjemmesiden for Lonza13. 2) Såningstætheden skal testes for hver cellelinje. For eksempel kan en normal primær keratinocyt linje sås med en massetæthed på 5,0 x 103 celler / cm2, mens en linje, der transporterer mutationer i transskriptionsfaktoren p63, der er mindre proliferative bør sås ved en massevisitet på 20 x 103 celler / cm2. 3) Afhængigt af den eksperimentelle opsætning, bør flere retter eller brønde af celler være sået til at tillade indsamling af prøver på forskellige differentiering dage i replikaer.
  5. Cellerne opdateres med KGM-pro-mediet i to dage efter såning (såning på dag 0, forfriskende for1. gang på dag 3). Derefter opdateres med KGM-pro medium hver anden dag. Kontroller celler regelmæssigt, mindst hver anden dag.
  6. Fremkalde celledifferentiering, når cellerne er mere end 90% sammenløb ved at ændre mediet til KGM-dif. Dagen for skift medium til KGM-dif er defineret som differentiering dag 0. Cellerne indsamles til yderligere RNA-analyser ved første vask af 2x med DPBS, hvor der derefter tilsættes lysisbuffer (fra et RNA-ekstraktionssæt).
    BEMÆRK: Med ovennævnte såningstæthed, celler bør nå sammenløb inden for 7-10 dage. Celler kan være seedet med en højere indledende tæthed for at nå sammenløbet hurtigere. Hvis cellerne ikke prolifereres, kan længere ventetid ikke give anledning til fuldt sammenløb celler. Der kan være behov for en højere såningstæthed.
  7. Opdater celler med KGM-dif-mediet hver dag og indsamle celler på differentieringsdagen 2, 4. og 7 for yderligere RNA-ekstraktion.

2. RNA-udvinding

  1. Isoler det samlede RNA. Dette kan udføres ved hjælp af et kommercielt RNA-isolationssæt(f.eks. Et isolationssæt, der indeholder en DNAse-behandling, anbefales dog på det kraftigste til RNA-seq-prøver for at forhindre DNA-kontaminering og fenol. Et eksempel på et kommercielt RNA-isolationssæt findes i materialetabellen.
  2. RNA-koncentrationen måles med et spektrometer. Både DNA og RNA har en absorptionstop ved 260 nm.
    BEMÆRK: 1) Forholdet mellem absorbansene ved 260 nm og 280 nm anvendes til at vurdere renheden af RNA' et. Et forhold på omkring 2,0 er generelt accepteret som 'ren' RNA. Hvis forholdet er væsentligt lavere end 2,0, kan prøven være forurenet med forurenende stoffer, der absorberer ved 280 nm, såsom proteiner, fenoler eller andre stoffer. 2) Forholdet mellem absorbans ved 260 nm og 230 nm måler nukleinsyre renhed. Der forventes et forhold mellem 2,0 og 2,2. Hvis forholdet er væsentligt lavere, kan prøven være forurenet med forurenende stoffer, der absorberer ved 230 nm, såsom EDTA, ethanol eller andre stoffer.

3. RNA-kvalitetstjek

  1. Kør RNA enten på en bioanalyzer RNA Pico chip for at validere RNA Integrity Number (RIN) kvantitativt, eller på en gel for en kvalitativ foranstaltning. Generelt er en RIN på mindst otte meget tilrådeligt. Men, når udvinding RNA fra væv RIN kan være lavere.
    BEMÆRK: Eventuelt kan kvalitetskontrol udføres af qPCR på RNA-materialet.

4. Forberedelse af RNA-seq bibliotek

BEMÆRK: RNA-seq bibliotek forberedelse udføres ofte med et kommercielt kit eller under kommercielle indstillinger. Den beskrevne protokol er tilpasset fra en kommerciel kit, KAPA RNA HyperPrep Kit med RiboErase (Illumina), med en kort beskrivelse af alle nødvendige trin: rRNA udtømning med oligo hybridisering til menneskelige ribosomal RNAAs, RNA fragmentering, første-streng syntese, anden-strand syntese og A-tailing, og oprydning efter hvert trin15. Andre biblioteksforberedelsessæt kan også bruges til dette formål. Det anbefales at udføre dette trin ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, da kvaliteten af genereret cDNA-bibliotek ofte er mere ensartet. 2) Følgende trin er beskrevet for 1x bibliotek forberedelse. Hvis der tilberedes flere prøver, skal du lave masterblandinger med 10% ekstra volumen.

  1. Oligo hybridisering og rRNA udtømning
    1. Der forberedes oligo hybridiseringsmasterblanding (i alt = 11 μL, med 4,4 μL hybridiseringsbuffer, 4,4 μL hybridiseringsbuigos og 2,2 μL RNase-frit vand) og nedbrydningsmasterblanding (i alt = 5,5 μL, med 3,3 μL udtømningsbuffer og 2,2 μL RNase H).
    2. Konfigurer PCR-reaktionsprogrammet på en termocykator: 95 °C i 2 min. rampen ned til 45 °C ved -0,1 °C/s 45 °C pause; 45 °C i 30 min. 4 °C for evigt.
      BEMÆRK: Overvej at starte med dobbelt så meget RNA end nødvendigt for forstærkning. I det første forsøg skal du bruge halvdelen af beløbet til at fortsætte med følgende trin. Dette er for at sikre, at der stadig er materiale til at gentage disse trin med et andet antal cyklusser (se trin 4.7.2), hvis cyklusser af forstærkning viser sig at være utilstrækkelig eller overamplified.
    3. Brug mellem 25 ng og 1 μg total RNA i 10 μL RNAse-frit vand, tilsættes 10 μL oligo hybridiseringsmasterblanding. Placer prøver i den forprogrammerede termocykstyring, og start programmet.
    4. Når programmet når pause trin ved 45 °C, tilsættes 5 μL udtynding master mix til 20 μL hybridisering reaktion uden at fjerne det fra termocykry. Bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange.
    5. Genoptag termocykrprogrammet for at fortsætte med udtyndingstrinnet (45 °C i 30 min.).
      BEMÆRK: 1) Sæt perlerne til rRNA udtømning (f.eks KAPA rene perler) ved stuetemperatur (RT) under udtyndingstrinnet for den næste del af protokollen. 2) Overvej at forberede DNase digestion master mix (for punkt 4.2), da reagenserne er nødvendige direkte efter rRNA udtømning oprydning.
    6. Udfør en 2,2 x perlebaseret KAPA Pure Beads oprydning: kombiner RNA-blandingen (25 μL) og KAPA Pure Beads (55 μL), ved grundigt at resuspendere perlerne i RNA-blandingen ved at pipettere op og ned flere gange.
    7. Inkuber ved RT i 5 min. for at tillade RNA-binding til perlerne, og anstå rørene på en magnetholder for at fange perlerne, indtil væsken er klar, og fjern og kassér forsigtigt 60 μL supernatant.
    8. Røret(-erne) på magneten vaskes 2x med 200 μL ethanol på 80 % ved at inkubere perlerne med ethanol i ≥30 s og kassere ethanolen. Prøv at fjerne alle resterende ethanol uden at forstyrre perlerne efter den anden vask.
    9. Tør perlerne på RT i 3-5 min eller indtil al ethanol er fordampet.
      BEMÆRK: Overtørring af perlerne kan resultere i nedsat udbytte.
  2. DNase fordøjelse
    1. Der forberedes et DNase-nedbrydningsmastermix (i alt = 22 μL med 2,2 μL DNase-buffer, 2 μL DNase og 17,8 μL RNase-frit vand).
    2. Resuspend perlerne i DNAse fordøjelse master mix (20 μL) ved pipettering op og ned flere gange. Inkuber røret(e) ved RT i 3 min. for at elute RNA'et fra perlerne.
    3. Rørret på en magnetholder for at fange perlerne, indtil væsken er klar, og overfør forsigtigt 20 μL supernatant til et rent rør.
    4. Røret(-erne) inkuberes med supernatant ved 37 °C i 30 min.
      BEMÆRK: Overvej at forberede RNA-elutions-, fragmenterings- og priming masterblandingerne (i punkt 4.3), da reagenserne er direkte nødvendige efter DNase-fordøjelsesoprydningen.
    5. Udfør en 2,2 x perlebaseret oprydning ved at følge 4.1.6–4.1.9.
  3. RNA-ation, fragmentering og priming
    1. Opbered masterblandingen af fragment, prime og elute buffer (1x) med 11 μL fragment, prime og elute buffer (2x) og 11 μL RNase-frit vand.
    2. Resuspend perlerne med renset, DNase-behandlet RNA i 22 μL fragmentering, Prime og Elute Buffer (1x) ved pipettering op og ned flere gange.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min til elute RNA fra perles, derefter placere rørene (e) på en magnet til at fange perlerne, indtil væsken er klar.
    4. Overfør forsigtigt 20 μL supernatant i et eller flere rør. Kassér røret med perler.
      BEMÆRK: Dette er et sikkert stoppested, da prøver kan opbevares ved -20 °C i ≤24 timer.
    5. Rørene anbringes i en termocykator, og fragmenteringen og primingen udføres ved 94 °C i 6 min. Resulterer i omtrentlige 200-300 bp lange fragmenter.
      BEMÆRK: Inkuber i 8 min ved 94 °C for 100-200 bp fragmenter. Ved brug af delvist nedbrudt RNA fragmenteres mellem 1-6 min. ved 85 °C afhængigt af nedbrydningens sværhedsgrad.
    6. Anl.
  4. Første streng syntese
    1. Der forbered første strengsyntesemasterblanding (i alt = 12 μL, med 11 μL første strengsyntesebuffer og 1 μL KAPA-script).
    2. Konfigurer PCR-reaktionsprogrammet på en termocykator: 25 °C i 10 min. 42 °C i 15 min. 70 °C i 15 min. 4 °C for evigt.
    3. På is kombineres 20 μL fragmenteret primet RNA med 10 μL første strengsyntesemasterblanding. Hold rørene på is, bland grundigt ved forsigtigt at pipettere reaktionen op og ned flere gange.
    4. Anlækningsrøret/rørene anbringes i den forprogrammerede termoncykator, og start programmet.
  5. Anden streng syntese og A-tailing
    1. Der forbered anden strengsyntese og A-tailing master mix på is (i alt = 33 μL, med 31 μL anden strengsyntesebuffer og 2 μL anden strengsyntese og A-tailing enzymblanding).
    2. Konfigurer PCR-reaktionsprogrammet på en termocykator: 16 °C i 30 min. 62 °C i 10 min. 4 °C for evigt.
    3. Kombiner 30 μL første streng syntese produkt med 30 μL af anden streng syntese og A-tailing master mix, og bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange på is.
    4. Anlækningsrøret/rørene anbringes i den forprogrammerede termoncykator, og start programmet.
  6. Oprydning af adapter ligation og oprydning efter ligation
    1. Fortyndet stock adaptere (NEXTflex DNA stregkoder, 25 μM) 3,57x i RNase-frit vand til 7 μM.
    2. Der forberedes blanding af adapterligationsmaster (i alt = 50 μL, med 40 μL ligationsbuffer og 10 μL DNA-ligase).
    3. Kombiner 60 μL andet strengsynteseprodukt, 45 μL blanding af adapter ligationsmaster og 5 μL fortyndede adaptere. Bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange på is.
    4. Slangerne inkuberes ved 20 °C i 15 min. og fortsæt straks med den første oprydning efter ligation.
    5. Udfør en 0,63 x perlebaseret oprydning ved at kombinere adapter-ligatet DNA (110 μL) og KAPA rene perler (70 μL), derefter grundigt resuspenderede perlerne i DNA-blandingen ved pipettering op og ned flere gange.
    6. Gentag trin 4.1.7-4.1.9.
    7. Fjern rørene fra magneten. Opslæmmet perlerne grundigt i 50 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5) og inkuber perlerne ved RT i 2 min.
    8. Anst samme plade på magneten, og vent, indtil væsken er klar. 50 μL af den klare supernatant overføres til et nyt rør.
      BEMÆRK: Sikkert stoppested i mindre end 24 timer ved 4 °C.
    9. Udfør en 0,7 x perlebaseret oprydning ved at kombinere 50 μL perler med renset adapter-ligatet DNA med 35 μL PEG/NaCL-opløsning. Bland grundigt ved vortexing.
    10. Udfør oprydningstrinnene 4.1.7–4.1.9. Opslæmmet perlerne grundigt i 20 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), og inkuber perlerne ved RT i 2 min.
    11. Ans placeres pladen på magneten. vente, indtil væsken er klar. 20 μL af den klare supernatant overføres til et nyt rør, og videre til punkt 4.7.
      BEMÆRK: Sikkert stoppested i mindre end 1 uge ved 4 °C eller mindre end 1 måned ved -20 °C.
  7. Biblioteksforstærkning og oprydning
    1. Forbered biblioteksforstærkningsmastermix (i alt = 33 μL, med 27,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix og 5,5 μL 10x biblioteksforstærkningsprimer mix).
    2. Konfigurer PCR-reaktionsprogrammet på en termocyr ved hjælp af følgende parametre. 98 °C til 45 s; N cyklusser (se nedenstående bemærkning) på: 98 °C for 15 s; 60 °C i 30 s; 72 °C til 30 s; 72 °C i 1 min. og 4 °C for evigt.
      BEMÆRK: Cyklusserne for biblioteksforstærkningen afhænger af indgangsmaterialet. Det kan groft anslåes som sådan: startende med RNA = 25-100 ng, N = 11-15 cykler; 100–250 ng, N = 9-12 cyklusser; 250-500 ng, N = 7-10 cyklusser.
    3. Udfør en 0,8 x perlebaseret oprydning ved at kombinere forstærket biblioteks-DNA (50 μL) og KAPA rene perler (40 μL), hvorefter perlerne i DNA-blandingen reduceres grundigt ved at pipettere op og ned flere gange.
    4. Udfør oprydningstrinnene 4.1.7–4.1.9. Opslæmmet perlerne grundigt i 50 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), og inkuber perlerne ved RT i 2 min.
    5. Overfør 50 μL af den klare supernatant til et nyt rør og fortsæt til den anden forstærkningsoprydning i biblioteket.
    6. Udfør en 1x perlebaseret oprydning ved at kombinere forstærket biblioteks-DNA (50 μL) og KAPA rene perler (50 μL), hvorefter perlerne i DNA-blandingen reduceres grundigt ved at pipettere op og ned flere gange.
    7. Udfør oprydningstrinnene 4.1.7–4.1.9. Resalpend perlerne skal opslæmmes grundigt i 22 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), og perlerne inkuberes ved RT i 2 min.
    8. Overfør 20 μL af den klare supernatant til et nyt rør videre til Qbit og bioanalyser målinger.
  8. Koncentrations- og fragmenteringsstørrelse
    1. Mål DNA-koncentrationerne af prøverne. Ved hjælp af et meget følsomt fluorescerende farvestofbaseret sæt (f.eks.
    2. Bibliotekets fragmentstørrelse bestemmes ved hjælp af højfølsom elektroforese (f.eks. en bioanalyser).
      BEMÆRK: Eventuelt kan kvalitetskontrol af qPCR udføres før sekvensering (tillæg) ved hjælp af et fortyndet forberedt bibliotek i stedet for cDNA.
  9. Sekventering
    1. Send biblioteket til sekvensering. For RNA-seq differentiale genekspressionsanalyse er en sekvenseringsdybde af læsninger mellem 10-25 millioner pr. prøve generelt tilstrækkelig.

5. Forbehandling af data

  1. Kvalitetskontrol Fastq-filer
    1. Download og installer Trimgalore16 for at fjerne basispar af lav kvalitet og tomme læsninger i Fastq-filerne.
      BEMÆRK: 1) De fleste software, der er nævnt her virker kun i Linux. Hvis begrænset til en Windows-computer, er det muligt at køre analyser på en Linux-server ved hjælp af softwaren MobaXterm eller Putty. Husk, at for genom indeksering en masse random-access hukommelse (RAM) er påkrævet (omkring 64 GB). 2) Installation af al nødvendig software i et conda miljø anbefales stærkt. Dette vil gøre det nemt software installation og pakkehåndtering. Du kan finde flere oplysninger om conda på .
    2. Opret en mappe (mappe) til dataene, f.RNA_seq_KC_diff.eks. Angiv dette som arbejdsmappen ved at skrive: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      BEMÆRK: Du kan få en oversigt over mappestrukturen under folder_structure.txt' i de supplerende kodningsfiler.
    3. Opret flere mapper i arbejdsmappen med de specifikke navne: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' og 'Mapping'.
    4. Flyt fasta-filerne i de sekvenserede data til fastq-mappen. Alternativt kan du generere bløde links ved hjælp af kommandoen: "ln-s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" til Fastq-filerne for at spare diskplads.
    5. Kør Trim massevis på Fastq filer, se TrimGalore.txt for koden til at kopiere indsætte i bash. Skift mappenavne og -indstillinger i kommandoen, hvor det er nødvendigt.
  2. Kortlægning
    1. Download et genom til at kortlægge læser til, fx hg38 ensembl release 97 (afsløret version): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; og den tilsvarende genanmærkningsfil: hg 38 genanmærkning ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Overfør begge filer til CRCh38_fasta mappe.
      BEMÆRK: Alternativt bruge en anden version af genomet, for eksempel UCSC version af hg38, hvis kortlægning til udskrift id'er i stedet for gen-id'er foretrækkes.
    2. Installer STAR 2.7.117.
    3. Generer et internt referencegenom ved hjælp af STAR 2.7.1 ved at generere genomscriptet (se Supplerende kodningsfiler). Skift mængden af tråde til, hvad processer har (--runThreadN X). Skift mappenavne og -indstillinger i dette script, hvor det er nødvendigt. Kør det ved at kopiere / indsætte i bash.
    4. Installer samtools 1,918 for indeksering af bam filer og gzip at komprimere vrikke filer.
    5. Juster Trim Galore valideret sekvensering læser til det menneskelige genom samling hg38 (ensembl release 97) ved hjælp af STAR 2.7.1 efterfulgt af indeksering ved hjælp af samtools og gzip. Dette bør udføres ved hjælp af scriptet map_fastq.txt (se Supplerende kodningsfiler). Rediger mappenavnene og -indstillingerne i dette script, hvor det er nødvendigt. Kør det ved at kopiere / indsætte i bash.
      BEMÆRK: STAR kortlægning genererer flere output-filer, herunder en bam-fil, en vrikke fil, og læse tæller tabel med navnet * _ReadsPerGene.out.tab, som direkte kan bruges sammenkædt af R til brug som input til Deseq2.
  3. Visualisering af genombrowser
    1. Installer wigToBigWig fra UCSC genom browser værktøjer til at generere bigwig filer med big2bw script19.
    2. Overfør filerne »convertBigWigChroms.py« og »CRCH38_ensembl2UCSC.txt« fra de supplerende kodningsfiler til en mappe med »scripts« i arbejdsmappen.
    3. Gør den convertBigWigChroms.py eksekverbare (ved hjælp af kommandoen: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' på en Linux-maskine).
    4. Generer bigWig filer fra Wiggle filer, ved hjælp af scriptet wig2bw.txt (se Supplerende Kodning Filer). Kør det ved at kopiere / indsætte i bash.
    5. Indtast BigWig-filerne i UCSC-genombrowseren eller Integrativ Genomics Viewer (IGV) til visualisering.

6. RNA-seq dataanalyse

  1. Input af eksempeldata i Deseq2
    1. Hent og installer Rstudio (version 1.1.456) og R (version 3.6).
    2. Installer alle de nødvendige R-pakker (se Supplerende kodningsfiler).
      BEMÆRK: For en detaljeret R-markdown fil, der viser alle programmering kode og output, se de vedhæftede filer: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" og "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". En generel beskrivelse af alle trin er inkluderet nedenfor.
    3. Opret en optællingstabel fra filerne ReadsPerGene.out.tab.
    4. Skriv en eksempeldatafil, der indeholder alle filnavne, differentieringsdagen og andre relevante eksempeldata. Du kan se et eksempel på en eksempelfil under "sample_data_example.csv" i de supplerende kodningsfiler.
    5. Brug optællingstabellen og eksempeldataene til at generere et Deseq220-objekt, der indeholder både tællelige data og eksempeldata.
  2. Normalisering af genekspression, prøveafstand og PCA
    1. Normaliser optællingstabellen i Objektet Deseq2 ved hjælp af enten Deseq2 rld eller vst-normalisering. Rld normalisering foretrækkes, men med mange prøver, vst normalisering er meget hurtigere.
    2. Prøveafstand baseret på de normaliserede læsetalintensiteter ved hjælp af "dist" funktionen i R og efterfølgende udførelse af "hclust" klyngedannelse baseret på prøveafstand. Plot selve heatmap ved hjælp af pheatmap pakken.
    3. Generer et PCA-plot af de normaliserede læsetalintensiteter ved hjælp af plotPCA-funktionen af Deseq2.
      BEMÆRK: PCA fungerer som et værktøj i sonderende dataanalyse og kan bruges til at visualisere afstand og relation mellem forskellige prøver.
  3. Differential/meget varierende genudtryksanalyse
    1. Beregn enten differentialegener ved hjælp af Deseq2 resultatfunktionen. Ved vurderingen af ændringer over flere tidspunkter, hvor parvise sammenligninger ikke er gældende, skal du dog bruge meget variable gener. I dette tilfælde udtrækkes de 500 meget variable gener via bestilling på variansen mellem prøverne fra forskellige tidspunkter med funktionen rækkeVars.
      BEMÆRK: I vores analyse blev de 500 meget variable gener (de gener med den højeste standardafvigelse af deres normaliserede intensitet på tværs af differentieringsdage) anvendt til yderligere analyse for kontrolprøverne. Men for den syge vs kontrol analyse differentieret udtrykt gener mellem sygdom og sund kontrol over tid blev beregnet af Deseq2 ved hjælp af en flere test korrigeret p-værdi på 1 x 10-4 som en cutoff. Et andet muligt filtreringstrin er at udelukke differensgener, der ændrer sig mindre end en bestemt fold ændring cutoff.
    2. Udfør kmeans klyngedannelse på differentiale eller meget variable gener til at gruppere dem ved forskellige udtryksmønstre.
    3. Visualiser differentiale eller meget variable gener i et heatmap ved hjælp af pheatmap-pakken. Intensiteten afbildet i heatmap er Deseq2 normaliseret intensitet med medianværdien trukket fra.
  4. Analyse af gene ontologi (GO)
    1. Generer en liste over udtrykte baggrundsgener ved at tage alle gener med mere end 10 tællinger i en enkelt prøve.
    2. Udfør GO analyse ved hjælp af online-værktøjer såsom GOrilla21. Brug listerne over differentiale/meget variable gener i klynger som "genliste" og baggrundsgenerene som baggrund til sammenligning.
      BEMÆRK: Mere avancerede R-brugere kan bruge pakkeklyngenProfiler22 til at automatisere Go-termberigelsesanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal keratinocytdifferentiering og RNA-seq-analyse
I dette eksperiment blev keratinocytlinjer fra fem individer anvendt til differentiering og RNA-seq-analyser. Figur 1 opsummerer forsøgsproceduren for differentiering og RNA-seq-analyseresultater. En oversigt over in vitrodifferentieringsprocedurer for normale keratinocytter og cellemorfologiændringer under differentiering illustreres i figur 1A. Analyse af principkomponenter (PCA) viste, at keratinocytter, der gennemgik differentiering, havde forbundne, men særskilte overordnede genudfoldelsesprofiler (Figur 1B). Meget variable gener blev grupperet af kmeans for at visualisere genudfoldelsesdynamik og -mønstre under differentiering (Figur 1C).

Hver klynge af gener var repræsenteret ved keratinocyt differentieringssmærkegener (f.eks. Gen ontologi (GO) anmærkningsanalyse af meget variable genklynger (Figur 1C) viste en klar forskel i genfunktionerne i disse genklynger (f.eks. keratinisering i mellemstadiet af differentiering og epidermal celledifferentiering, keratinocytdifferentiering og peptid, der forbinder i de sene stadier; Figur 1D). Proteinudtryk af flere differentiemarkører blev målt ved vestlig blotting (figur 1E).

P63 mutant keratinocytdifferentiering og RNA-seq-analyse:
I det andet eksperiment blev forskelle i cellemorfologi og genekspression sammenlignet mellem keratinocytter fra sunde kontroller og tre linjer fra patienter med p63-mutationer (mutanter R204W, R279H og R304W). Figur 2A viser en oversigt over differentieringsprocedurer og cellemorfologiændringer. Mutant keratinocytter forblev fladt på overfladen af skålen og ikke bliver overfyldt eller overlapper vækst som kontrol keratinocytter på dag 7.

I PCA-analysen fulgte kontrolcellelinjerne klart et differentieringsmønster sammenlignet med figur 1B. Men mønstret for genekspression af mutantceller under differentiering forbliver stort set det samme som ved prolifererende/udifferentierede celler. Blandt de tre mutantlinjer bevægede differentieringen af R279-prøver sig til en vis grad langs PC1 og PC2, hvilket indikerer, at dens differentiering var mindre forringet sammenlignet med R204W og R304W.

I klyngeanalysen (figur 2C) blev gener, der var nedreguleret i kontrolceller (klynge 1), delvist nedreguleret i R204W og R279W, men deres genekspression blev ikke ændret drastisk i R304W. Disse gener spiller sandsynligvis roller i celleproliferation, som det fremgår af GO-anmærkningen (Figur 2D). I klynge 2 (figur 2C)blev generne først induceret og efterfølgende nedreguleret i kontrolceller. Disse gener er sandsynligvis involveret i keratinocyt differentiering, som epidermal differentiering og keratinisering funktioner var stærkt beriget for denne klynge gener (Figur 2D). Disse gener blev ikke induceret i R204W og R304W, mens disse gener i R279H-celler blev induceret, men ikke nedreguleret så meget som kontrolcellerne.

Gener i klynge 3 blev først fremkaldt ved afslutningen af differentiering i kontrolceller (Figur 2D). I overensstemmelse med dette, disse gener kan have en rolle i det ydre mest lag af epidermis, da de har vist sig at være lydhøre over for eksterne stimuli og betændelse (Figur 2D). Ekspressionsmønsteret for disse gener ændrede sig ikke meget i alle tre mutantcellelinjer. De synlige forskelle i genekspressionsmønstre mellem kontrol- og mutantceller viser, at mutantceller ikke kan skelne ordentligt i disse in vitro-differentieringsmodeller.

Figure 1
Figur 1: Keratinocyt differentiering og analyse. (A) Oversigt over keratinocytdifferentieringsprotokollen og cellemorfologien. Skalabar = 100 μm. (B) Principkomponentanalyse af differentiering af kontrol keratinocytter. (C) Heatmap af top 500 meget variable gener under keratinocyt differentiering. Gener er grupperet i tre klynger ved hjælp af kmean klyngedannelse. Repræsentative differentieringsmarkørgener for hver genklynge er angivet ved siden. D) GO-termberigelsesanalyse af overrepræsenterede funktioner for gener i de meget variable genklynger sammenlignet med en baggrund af alle udtrykte gener (optællinger på >10). GOrilla blev anvendt til tilsætningstesten. (E) Western blot af keratinocyt differentieringsmarkører under differentiering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af kontrol og p63 mutant keratinocytter. A) Oversigt over keratinocytdifferentieringsprotokollen og cellemorfologien for kontrol og p63 mutant keratinocytter. Skala = 100 μm. (B) Principkomponentanalyse af differentieringskontrol og patient (R204W, R279H & R304W) keratinocytter. C) Heatmap af differensgener mellem kontrol og mutant keratinocytter. Gener er grupperet i tre klynger ved hjælp af kmean klyngedannelse. Repræsentative differentieringsmarkørgener for hver genklynge er indiceret. D) GO-termberigelsesanalyse af overrepræsenterede funktioner for gener i de meget variable genklynger sammenlignet med en baggrund af alle udtrykte gener (optællinger på >10). GOrilla blev anvendt til tilsætningstesten. Klik her for at se en større version af dette tal.

KGM-komponent Lager Medium Volumen
KBM 500 ml
Pen/Strep 100.000 enheder/ml 100 enheder/ml 5 mL
BPE ~13 mg/ml 0.4% 2 ml
Ethanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosphoethanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
Hydrocortison 0,5 mg/ml 0,5 μg/ml 500 μL
Insulin 5 mg/ml 5 μg/ml 500 μL
Globaliseringsfonden 10 μg/ml 10 ng/ml 500 μL

Tabel 1. KGM-pro medium kosttilskud.

KGM-komponent Lager Medium Volumen
KBM 500 ml
Pen/Strep 100.000 enheder/ml 100 enheder/ml 5 mL
Ethanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosphoethanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL

Tabel 2. KGM-diff medium kosttilskud.

Supplerende kodningsfiler: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; og Wig2bw.txt. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbejde beskriver en metode til at fremkalde menneskelig keratinocyt differentiering og efterfølgende karakterisering ved hjælp af RNA-seq analyser. I den nuværende litteratur anvender mange undersøgelser af differentiering af humant keratinocyt to andre metoder, med en høj calciumkoncentration eller med serum som metoder til at fremkaldedifferentiering 2,3,23. En tidligere rapport nøje sammenlignet disse tre forskellige metoder3 og viste, at disse metoder kan repræsentere forskellige biologi keratinocyt differentiering. I samme rapport viste forfatterne, at differentierede celler fremkaldt af serum har et højt spredningspotentiale og udtrykker gener som KRT16 og SKALP/ PI3, der udtrykkes i psoriasishuden, men ikke i normal epidermis, og at derfor kan seruminduceret differentieringsmodel bruges til at studere psoriasis. I modsætning hertil kan metoden til kontakthæmning plus udelukkelse af vækstfaktor fremkalde KRT1 og KRT10, som normalt udtrykkes i epidermis og ligner normal keratinocytdifferentiering. Høj calcium induktion giver anledning til et genekspression profil, der er mellem serum induktion og kontakt hæmning, som den mindst specifikke metode. Analyserne ved hjælp af RNA-seq-analyser under differentiering bekræftede, at metoden med kontakthæmning plus udelukkelse af vækstfaktor resulterer i differentierede keratinocytter med lignende genekspressionsprofiler som dem, der forventes for epidermal differentiering (f.eks. KRT5 i prolifererende celler, KRT1 og KRT10 i tidlig differentiering og LOR og FLG i sendifferentiering; Figur 1C).

Disse resultater viser, at denne differentieringsteknik er en brugervenlig og pålidelig metode til at studere keratinocytdifferentiering. Endvidere viser dette arbejde med keratinocytter fra p63 mutant keratinocytter også, at metoden kan anvendes til at studere påvirket keratinocytdifferentiering under syge forhold. I denne in vitro differentiering tilgang, KGM købt fra Lonza anvendes, da dette medium giver ensartede resultater. I princippet er andet epidermalt medium med lignende sammensætning såsom keratinocyt serumfrit medium (KSFM) fra Thermo Fisher Scientific sandsynligvis også egnet, selv om dette skal testes.

Det skal bemærkes, at denne metode har nogle begrænsninger. Da det er baseret på kontakt hæmning, sammenløbet af celletæthed er påkrævet. I vores eksperimenter med p63 mutant keratinocytter har en højere indledende såningstæthed været nødvendig for at sikre, at cellerne kan nå sammenløbet. Desuden, når celler ikke vokser med samme hastighed, differentiering undertiden skal induceres på forskellige dage. Disse overvejelser bør tages i betragtning ved opsætningen af forsøg. I forsøgsmiljøer, hvor celler skal induceres på samme tid, bør andre differentieringsmetoder overvejes, herunder tilsætning af serum, høje koncentrationer af calcium og hæmning af epidermale vækstfaktorreceptorer2,3. Ikke desto mindre har alle in vitro differentieringsmetoder fordele og ulemper, da de sandsynligvis repræsenterer delvis differentiering induktion signaler, der er til stede under in vivo hud udvikling2.

En omfattende molekylær analyse, der sammenligner disse forskellige metoder vil være meget informativ og kan instruere valget af metode, der passer bedst til forskellige undersøgelser af biologiske processer. Desuden anbefales det kraftigt at validere ændringer målt på transskriptomniveau, f.eks. Desuden bør in vitro-data anvendes med forsigtighed, og konklusioner fra disse modeller bør valideres in vivo, helst i udviklingen af menneskers hud.

De grundlæggende principper for RNA-udvinding og RNA-seq bibliotekspræparat er blevet godtbeskrevet tidligere 24,25,26,27,28. I denne protokol er RNA-udtræknings- og RNA-seq-biblioteksforberedelsesprocedurerne baseret på arbejdsgange i kommercielt tilgængelige sæt. I princippet bør forskellige metoder til RNA-ekstraktion ikke have større indflydelse på RNA-seq-analyser, hvis RNA-kvaliteten er god. I tilfælde, hvor RNA-kvaliteten er dårlig (dvs. når RNA udvindes formalinfaste paraffininddete væv), kan RNA-seq stadig udføres; RNA-fragmenteringstrinnet skal dog justeres. RNA-seq bibliotek forberedelse dækker fra ribosomal RNA (rRNA) fjernelse til cDNA bibliotek konstruktion til sekventering. De vigtigste procedurer kan udføres ved hjælp af forskellige kits eller ved hjælp af individuelle enzymer og hjemmelavede buffere29,30,31,32. Det skal bemærkes, at hvis RNA-seq-analysen udføres ved hjælp af forskellige grundlæggende principper (f.eks. enten ribosomal RNA-udtømning eller polyA mRNA-berigelse ved hybridisering til polyT oligos), kan resultatet af RNA-seq-analyser variere. Endvidere, protokollen udnytter ribosomal RNA fjernelse ved hybridisering af DNA oligos til mennesker, mus, og rotte rRNA. Når du arbejder med forskellige arter, bør der anvendes et alternativt oligo-sæt.

Sekvensering af det genererede bibliotek kan udføres enten i begge ender af fragmenterne (parret ende) eller i den ene ende af fragmentet (enkelt ende). Generelt parrede ende sekvensering langt forbedrer mappability og giver mere information om udskrift varianter. Men for en forholdsvis simpel differentialgenanalyse som beskrevet her kan enkelt endesekvensering også give tilstrækkelige oplysninger.

For det vigtige trin i dataanalyse, en forholdsvis enkel metode til kvalitetskontrol af fastq filer er beskrevet, efterfulgt af kortlægning læser til genomet. Selvom den medfølgende bash-kode ikke har den ideelle skalerbarhed, har den fordelen ved gennemsigtighed. Valget af software, hvilke trin den udfører, og version af genomet, der anvendes under forbehandling af data, er alle ikke-livsbestemte trin, der skal være veldokumenterede, hvilket er afgørende for repeterbarheden.

For mere avancerede brugere, kan en automatiseret pipeline bruges til at udføre trinene i fastQ fil kvalitetskontrol, adapter trimning og kortlægning, fx ARMOR snakemake workflow33 eller 'RNA-seq' Snakemake workflow fra van Heeringen lab34. Disse fuldstændig automatiserede rørledninger er imidlertid mindre gennemsigtige og vanskeligere at ændre. Når du bruger disse værktøjer, er det vigtigt at forstå funktionerne i disse automatiserede rørledninger. Endelig omfatter protokollen RNA-seq dataanalyse med vægt på variabelt genekspression over tid. Variabelt genekspression foretrækkes frem for differentialtest, når man ser på processer med flere tidspunkter, f.eks. Det kan konkluderes, at denne analysepipeline indfører relevante værktøjer til bioinformatikanalyse af RNAseq-data. Den indeholder værktøjer, der grundigt kan vurdere keratinocyt differentiering, både under normale og syge forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.) Radboud Universitetsstipendi (H.Z.); og kinesisk stipendium råd tilskud 201406330059 (JQ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).
  13. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019).
  14. Doyle, K. aM. Protocols and applications guide. , Promega Corporation. Madison. (1996).
  15. Roche. Hyperprep Kit. , Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019).
  16. Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019).
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. Soneson, C. ARMOR. , Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019).
  34. Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019).

Tags

Genetik menneskelige primære keratinocytter 2D nedsænkning kultur in vitro differentiering RNA-seq bioinformatik analyse p63
Karakterisering af In Vitro Differentiering af humane primære Keratinocytter ved RNA-Seq Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues,… More

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter