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Genetics

RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

여기에 제시된 RNA-seq 분석에 의한 분자 수준에서의 특성화에 의해 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포의 체외 분화를 위한 단계별 절차이다.

Abstract

인간 1 차 각질 세포는 표피 분화 및 관련 질병에 대한 연구를위한 시험관 내 모델로 자주 사용됩니다. 다양한 유도 조건을 이용하여 2차원(2D) 침수 된 매너로 배양된 각질 세포의 체외 분화를 위한 방법이 보고되었다. 여기에 기재된 시험관내 각질 세포 분화 방법에 대한 절차는 RNA-seq에 의한 접촉 억제 및 후속 분자 특성화에 의한 것입니다. 간단히 말해서, 각질 세포는 완전히 수렴될 때까지 성장 요인으로 보충되는 정의된 각질 세포 배지에서 재배됩니다. 분화는 각질 세포 사이의 긴밀한 접촉에 의해 유도되고 매체에서 성장 인자를 배제함으로써 더욱 자극된다. RNA-seq 분석을 사용하여, 1) 분화된 각질 세포는 분화 도중 뚜렷한 분자 서명을 나타내고 2) 동적 유전자 발현 패턴은 표피 계층화 도중 세포를 크게 닮은 것으로 나타났다. 일반적인 각질 세포 분화에 비교하는 것과 관해서는, 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포는 그들의 분화 결함과 일치하여 변경된 형태학 및 분자 서명을 나타낸다. 결론적으로, 이 프로토콜은 RNA-seq 데이터의 생물정보 분석에 중점을 두고 2D 내 각질 세포 분화 및 분자 특성화를 위한 단계를 자세히 설명합니다. RNA 추출 및 RNA-seq 절차는 잘 문서화되었기 때문에, 이 프로토콜의 초점이 아닙니다. 체외 각막 세포 분화 및 생물 정보 분석 파이프 라인의 실험 절차는 건강하고 병이 있는 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Introduction

인간의 피부에서 유래된 인간 1차 각질세포는 표피1,2,3,4의생물학을 연구하기 위해 세포 모델로 자주 사용된다. 표피의 계층화는 2D 침수 단층 패션 또는 3D 공기 리프트 organotypic 모델2,3,5,6,7에서각질 세포 분화에 의해 모델링 될 수 있습니다. 3D 모델은 표피 구조와 기능을 평가하는 것이 점점 더 중요해지고 있지만, 2D 분화 모델은 여전히 널리 사용되고 있습니다.

혈청, 고농도 칼슘, 저온 및 표피 성장 인자 수용체2,3의억제를 포함하여 2D에서 각질 세포 분화를 유도하는 다양한 조건이 적용되었다. 이들 각각의 방법은 다수의 각질 세포 분화 마커 유전자에 의해 검증되었으며 병리학적 조건 하에서 케라틴 세포 분화를 평가하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 유도 조건은 마커 유전자의 특정 패널이검사될때 그들의 분화 효율 및 운동학에 있는 다름을2,3를보여줍니다.

이러한 방법 중 하나는 배양 배지8에서성장 인자의 각질 세포 접촉 억제 및 고갈을 포함한다. 세포가 전체 밀도에 도달할 때 각질 세포가 자발적으로 분화할 수 있음을 보여주었습니다.  배양 배지의 성장 요인을 제외하면 차별화를 더욱 향상시킬 수 있습니다. 접촉 억제 및 고갈성장 인자를 결합하는 방법은 여러 표피 마커3을사용할 때 정상 계층화 표피와 유사한 유전자 발현 패턴과 분화된 각질 세포체를 생성하는 것으로 나타났으며, 이 모델은 정상 각질 세포 분화를 연구하는 데 적합하다는 것을 시사한다. 최근에는 본 모델을 이용한 각질 세포 분화의 2개의 포괄적인 유전자 발현 분석이9,10으로보고되었다. 연구원은 분자 수준에서 이 모형을 확인하고 정상및 병은 각질 세포 분화를 공부하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다.

이 프로토콜은 RNA-seq를 사용하여 분화 된 세포의 체외 분화 방법 및 분자 분석에 대한 절차를 설명합니다. 또한 분화일 0(증식 단계), 2일차, 4일, 7일(각각 조기, 중, 후기 분화)에 대한 세포의 전사의 특성화를 보여 준다. 분화 된 각질 세포가 표피 계층화 중에 세포를 크게 닮은 유전자 발현 패턴을 표시하는 것으로 나타났습니다. 이 방법이 피부 병리학을 연구하는 데 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 동일한 실험 및 분석 파이프 라인을 적용하여 방황, 이장 물 분비증 및 갈라진 입술 / 미각 증후군 (EEC) 증후군11,12를가진 환자로부터 파생된 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포를 조사했습니다. 이 프로토콜은 각질 세포의 체외 분화뿐만 아니라 RNA-seq의 후속 생물 정보 분석에 초점을 맞추고 있습니다. RNA 추출, RNA-seq 샘플 준비 및 라이브러리 구조와 같은 완전한 절차의 다른 단계는 잘 문서화되어 있으며 특히 일반적으로 사용되는 많은 상용 키트를 사용할 때 쉽게 따를 수 있습니다. 따라서 이러한 단계는 프로토콜에 간단히 설명됩니다. 데이터는 이 파이프라인이 건강하고 병에 걸린 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다.

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Protocol

피부 생검은 건강한 자원 봉사자 또는 p63 돌연변이를 가진 환자의 트렁크에서 취하여 1 차적인 각질 세포 문화를 설정했습니다. 인간 1 차 각질 세포 확립에 관한 모든 절차는 Radboud 대학 Nijmegen 의료 센터의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). 정보에 입각한 동의가 얻어졌습니다.

1. 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포 분화

  1. 필요한 경우 각질 세포 성장 배지(KGM)를 케라틴세포유저(재료표)로부터준비한다.
  2. 미리 준비된 주식을 사용하여 500mL 확산 배지를 만듭니다(KGM-pro; 표 1참조).
  3. 500mL 분화 매체를 만듭니다(KGM-dif; 표 2참조).
    참고: 보충제를 갖춘 KGM은 2주 동안 4°C로 보관할 수 있습니다. 더 긴 저장을 위해 -20°C에서 알리인용 및 저장될 수 있습니다.
  4. 세포 증식 능력에 따라 5.0-20 x 103 세포/cm2의밀도에서 1 차 각질 세포를 종자. 세포를 커버하기에 충분한 KGM-프로 배지를 추가합니다.
    참고 : 1) KGM 배지 내의 일반 세포 배양에 대한 자세한 내용은 Lonza13의웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 2) 종자 밀도는 각 세포주에 대해 테스트되어야합니다. 예를 들어, 정상 1차 각질세포선은 5.0 x103 세포/cm2의밀도로 종자될 수 있는 반면, 전사 인자 p63에서 돌연변이를 운반하는 선은 20 x 103 세포/cm2의 밀도로 시드되어야 한다. 3) 실험 설정에 따라 여러 가지 요리 또는 셀 우물을 시드하여 복제본에서 다른 분화 일에 샘플을 수집할 수 있습니다.
  5. 시드 후 2일 동안 KGM-프로 배지로 셀을 새로 고침합니다(0일째에 파종, 3일째1st 시간 동안 상쾌함). 그 후, KGM-프로 매체로 격일로 새로 고침. 정기적으로 세포를 확인, 적어도 격일로.
  6. 세포가 KGM-dif로 배지를 변경하여 90% 이상 수렴될 때 세포 분화를 유도한다. 중간크기에서 KGM-dif로 변경하는 날은 분화일 0으로 정의됩니다. DPBS로 2배 를 먼저 세척하여 추가 RNA 분석을 위해 세포를 수집하고, 그 후 용해 완충제(RNA 추출 키트에서)에 추가합니다.
    참고: 위에서 언급한 시드 밀도를 사용하면 세포가 7-10일 이내에 합류에 도달해야 합니다. 세포는 더 빨리 합류에 도달하기 위하여 더 높은 초기 조밀도로 종자할 수 있습니다. 세포가 증식하지 않는 경우에, 더 이상 기다리는 것은 완전히 응수 세포를 초래하지 않을 수 있습니다. 더 높은 파종 밀도가 필요할 수 있습니다.
  7. 매일 KGM-dif 배지로 세포를 새로 고치고 분화일 2, 4일에 세포를 수집합니다. 및 7추가 RNA 추출을 위한 것입니다.

2. RNA 추출

  1. 총 RNA를 분리합니다. 이는 상업용 RNA 절연 키트(예: Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA)를 사용하거나페놀(14)을사용하여 수행될 수 있다. 그러나, DNAse 처리를 포함하는 격리 키트는 DNA 오염 및 페놀을 방지하기 위하여 RNA-seq 견본을 위해 적극 추천됩니다. 상업용 RNA 절연 키트의 예는 재료의 표에 주어진다.
  2. 분광계로 RNA 농도를 측정합니다. DNA와 RNA 둘 다 260 nm에서 흡수 피크가 있습니다.
    참고: 1) 260 nm와 280 nm에서 흡광도 사이의 비율은 RNA의 순도를 평가하는 데 사용된다. 약 2.0의 비율은 일반적으로 '순수한' RNA로 받아들여진다. 비율이 2.0보다 실질적으로 낮은 경우에, 견본은 단백질, 페놀, 또는 그밖 물질과 같은 280 nm에서 흡수하는 오염물질로 오염될 수 있습니다. 2) 260 nm와 230 nm에서 흡수사이의 비율은 핵산 순도를 측정합니다. 2.0에서 2.2 사이의 비율이 예상됩니다. 비율이 실질적으로 낮은 경우에, 견본은 EDTA, 에탄올, 또는 그밖 물질과 같은 230 nm에서 흡수하는 오염물질로 오염될 수 있습니다.

3. RNA 품질 검사

  1. RNA 무결성 수(RIN)를 정량적으로 검증하기 위해 생체 분석기 RNA 피코 칩또는 질적 측정을 위해 젤로 RNA를 실행합니다. 일반적으로 적어도 8 의 RIN은 매우 좋습니다. 그러나, 조직으로부터 RNA를 추출할 때 RIN은 더 낮을 수 있다.
    참고: 선택적으로, 품질 관리는 RNA 물질에 qPCR에 의해 수행될 수 있다.

4. RNA-seq 라이브러리 준비

참고: RNA-seq 라이브러리 준비는 상용 키트 또는 상업적 설정하에서 종종 수행됩니다. 설명된 프로토콜은 상용 키트, RiboErase (일루미나)를 가진 KAPA RNA 하이퍼프렙 키트에서 적응되며, 모든 필수 단계에 대한 간략한 설명과 함께: 오리고 혼성화를 인간 리보소말 RNA로, RNA 단편화, 첫 번째 가닥 합성 및 A-tailing, 및 각단계 15후 정화. 다른 라이브러리 준비 키트도 이 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 생성된 cDNA 라이브러리의 품질이 더 일관되기 때문에 시판되는 키트를 사용하여 이 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 2) 다음 단계는 1x 라이브러리 준비에 대해 설명됩니다. 여러 샘플을 준비하는 경우 마스터 믹스를 10% 추가 볼륨으로 만듭니다.

  1. 올리고 혼성화 및 rRNA 고갈
    1. 올리고 하이브리드화 마스터 믹스(총 = 11 μL, 하이브리드화 버퍼 4.4 μL, 하이브리드화 올리고의 4.4 μL, RNase-free water의 2.2 μL) 및 고갈 마스터 믹스(총 = 5.5 μL, 고갈 완충제 3.3μL 및 RNas H.2 μL)를 준비한다.
    2. 열순환기에서 PCR 반응 프로그램을 설정: 2 분 동안 95 °C; -0.1°C/s에서 45°C까지 경사로; 45 °C 일시 정지; 30 분 동안 45 °C; 영원히 4 °C.
      참고: 증폭에 필요한 것보다 RNA의 양이 두 배로 시작하는 것을 고려하십시오. 첫 번째 시도에서 금액의 절반을 사용하여 다음 단계를 계속합니다. 이는 증폭주기가 불충분하거나 과잉 증폭된 것으로 판명되는 경우, 다른 수의 사이클(단계 4.7.2 참조)으로 이러한 단계를 반복하는 재질이 여전히 있는지 확인하는 것입니다.
    3. RNA가 없는 물 10μL에 총 RNA의 25 ng와 1 μg 사이를 사용하고, 올리고 혼성화 마스터 믹스의 10 μL을 추가합니다. 미리 프로그래밍된 써모사이클러에 샘플을 배치하고 프로그램을 시작합니다.
    4. 프로그램이 45°C에서 일시 정지 단계에 도달하면 열사이클러에서 제거하지 않고 20 μL 혼성화 반응에 5 μL의 고갈 마스터 믹스를 추가합니다. 여러 번 위아래로 파이프를 통해 완전히 섞습니다.
    5. 고갈 단계(30분 동안 45°C)를 계속하기 위해 열순환기 프로그램을 재개한다.
      참고: 1) 프로토콜의 다음 부분에 대한 고갈 단계 동안 rRNA 고갈(예를 들어, KAPA 순수 구슬)을 실온(RT)에 비드를 놓는다. 2) RRNA 고갈 정화 후 시약이 직접 필요하기 때문에 DNase 소화 마스터 믹스 (섹션 4.2)를 준비하는 것이 좋습니다.
    6. 2.2배 구슬계 KAPA 퓨어 비즈 정리를 수행한다: RNA 믹스(25 μL)와 KAPA 퓨어 비즈(55 μL)를 결합하여 RNA 믹스의 구슬을 여러 번 배펫팅하여 철저히 재보선한다.
    7. RT에서 5분 동안 배양하여 RNA를 구슬에 결합할 수 있도록 하고, 액체가 맑을 때까지 구슬을 포획하기 위해 자석 랙에 튜브를 배치하고, 60 μL의 상골들을 조심스럽게 제거하고 폐기한다.
    8. 튜브를 자석에 보관하고, ≥30s용 에탄올로 구슬을 인큐베이팅하여 80% 에탄올의 200 μL로 2배 세척하고 에탄올을 폐기한다. 두 번째 세척 후 구슬을 방해하지 않고 모든 잔류 에탄올을 제거하십시오.
    9. RT에서 3-5분 동안 또는 모든 에탄올이 증발할 때까지 구슬을 건조시다.
      참고: 비드를 과도하게 건조하면 수율이 감소할 수 있습니다.
  2. DNase 소화
    1. DNase 소화 마스터 믹스를 준비하십시오 (총 = 22 μL, DNase 버퍼2.2 μL, DNase 2 μL 및 RNase가없는 물의 17.8 μL)를 준비하십시오.
    2. DNAse 소화 마스터 믹스 (20 μL)에서 구슬을 여러 번 위아래로 피펫하여 재연하십시오. 튜브를 RT에서 3분 동안 배양하여 RNA를 구슬에서 떼어냅니다.
    3. 튜브를 자석 랙에 놓고 액체가 맑을 때까지 구슬을 캡처하고 20 μL의 상류체를 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮기십시오.
    4. 37°C에서 30분 동안 상수로 튜브를 배양합니다.
      참고: DNase 소화 정리 후에 시약이 직접 필요하기 때문에 RNA 용출, 단편화 및 프라이밍 마스터 믹스(섹션 4.3의 경우)를 준비하는 것이 좋습니다.
    5. 4.1.6-4.1.9를 따라 2.2배 구비드 기반 정리를 수행합니다.
  3. RNA 용출, 단편화 및 프라이밍
    1. 파편, 프라임 및 엘루트 버퍼(1x) 마스터 믹스를 11μL의 조각, 프라임 및 엘루트 버퍼(2x) 및 RNase 가 없는 물의 11μL로 준비합니다.
    2. 22 μL의 단편화, 프라임 및 엘루트 버퍼(1x)에서 여러 번 배관하여 구슬을 정제된 DNase 처리 RNA로 철저히 재중단합니다.
    3. 실온에서 3분 동안 비드s에서 RNA를 엘로트한 다음, 액체가 맑을 때까지 구슬을 포획하기 위해 자석에 튜브를 놓습니다.
    4. 조심스럽게 튜브에 상류체의 20 μL을 전송합니다. 튜브를 구슬로 버리십시오.
      참고: 샘플이 ≤24h의 경우 -20°C로 저장할 수 있기 때문에 안전한 정지 지점입니다.
    5. 튜브를 열순환기에 놓고 6분 동안 94°C에서 조각화 및 프라이밍을 수행합니다. 약 200-300 bp 긴 조각의 결과.
      참고: 100-200 bp 조각에 대한 94 °C에서 8 분 동안 배양하십시오. 부분적으로 저하된 RNA를 사용하는 경우, 분해의 심각도에 따라 85°C에서 1-6분 사이의 단편.
    6. 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 첫 번째 가닥 합성으로 진행합니다.
  4. 첫 번째 가닥 합성
    1. 첫 번째 가닥 합성 마스터 믹스를 준비하십시오 (총 = 12 μL, 첫 번째 가닥 합성 버퍼의 11 μL 및 KAPA 스크립트1 μL)을 준비하십시오.
    2. 열순환기에서 PCR 반응 프로그램을 설정: 10분 동안 25°C; 15 분 동안 42 °C; 70 °C 15 분; 영원히 4 °C.
    3. 얼음에, 첫 번째 가닥 합성 마스터 믹스의 10 μL와 단편화된 프라이밍 RNA의 20 μL을 결합합니다. 튜브를 얼음 위에 두어 반응을 여러 번 부드럽게 피펫하여 철저히 섞습니다.
    4. 미리 프로그래밍된 열순환기에 튜브를 배치하고 프로그램을 시작합니다.
  5. 두 번째 가닥 합성 및 A-테일링
    1. 얼음에 두 번째 가닥 합성 및 A-tailing 마스터 믹스를 준비 (총 = 33 μL, 두 번째 가닥 합성 버퍼의 31 μL과 두 번째 가닥 합성 및 A-tailing 효소 믹스의 2 μL).
    2. 열순환기에서 PCR 반응 프로그램을 설정: 30분 동안 16°C; 62 °C 10 분; 영원히 4 °C.
    3. 제1가닥 합성 제품 30 μL과 2위 가닥 합성 및 A-tailing 마스터 믹스의 30 μL을 결합하고 얼음 위를 여러 번 피펫하여 철저히 섞습니다.
    4. 미리 프로그래밍된 열순환기에 튜브를 배치하고 프로그램을 시작합니다.
  6. 어댑터 리세이션 및 리차레이션 후 정리
    1. RNase 가 없는 물에서 주식 어댑터(NEXTflex DNA 바코드, 25 μM) 3.57x에서 7μM까지 희석합니다.
    2. 어댑터 리기션 마스터 믹스준비(총 = 50 μL, 결찰 버퍼 40μL, DNA 리개세 10 μL)을 준비한다.
    3. 제2 가닥 합성 제품 60 μL, 어댑터 리딩 마스터 믹스 45 μL, 희석어 5μL을 결합합니다. 얼음 위에 여러 번 파이프를 올려다 두어 철저히 섞습니다.
    4. 튜브를 20°C에서 15분 동안 배양하고 첫 번째 포스트 결찰 정리를 즉시 계속합니다.
    5. 어댑터 리게팅 DNA(110 μL)와 KAPA 순수 비드(70 μL)를 결합하여 0.63배의 비드 기반 정리를 수행한 다음 DNA 믹스의 구슬을 여러 번 배관하여 철저히 재보선보냅니다.
    6. 4.1.7-4.1.9 단계를 반복합니다.
    7. 자석에서 튜브를 제거합니다. 10m Tris HCL(pH = 8.0-8.5)의 50 μL에서 구슬을 철저히 재연하고 RT에서 2분 동안 구슬을 배양합니다.
    8. 자석에 접시를 놓고 액체가 맑을 때까지 기다립니다. 명확한 상체체의 50 μL을 새로운 튜브로 옮기십시오.
      참고: 4°C에서 24시간 미만의 안전한 정지 지점.
    9. 50 μL의 구슬과 정제어 리게팅 DNA를 PEG/NaCL 용액의 35 μL과 결합하여 0.7배 의 구슬 기반 정리를 수행합니다. 소용돌이에 의해 철저하게 섞으세요.
    10. 정리 단계 4.1.7-4.1.9를 수행합니다. 10m Tris HCL(pH = 8.0-8.5)의 20 μL에서 구슬을 철저히 재보중단하고 RT에서 2분 동안 구슬을 배양합니다.
    11. 접시를 자석위에 놓는다. 액체가 맑을 때까지 기다립니다. 명확한 상체체의 20 μL을 새 튜브로 옮기고 4.7절로 진행합니다.
      참고: -20°C에서 4°C 또는 1개월 미만의 안전한 정지 지점.
  7. 도서관 증폭 및 정리
    1. 라이브러리 증폭 마스터 믹스준비(총 = 33 μL, 2배 KAPA HiFi HotStart ReadyMix 27.5 μL, 10x 라이브러리 증폭 프라이머 믹스 5.5 μL).
    2. 다음 매개 변수를 사용하여 열순환기에서 PCR 반응 프로그램을 설정합니다. 45s용 98°C; N 사이클 (아래 참고 참조) : 15 s에 대한 98 °C; 30s용 60°C; 30s용 72°C; 72 °C 1 분; 그리고 4 °C 영원히.
      참고: 라이브러리 증폭의 주기는 입력 재질에 따라 달라집니다. 그것은 대략 RNA = 25-100 ng, N = 11-15 주기로 시작하는 것과 같이 추정될 수 있습니다; 100-250 ng, N = 9-12 사이클; 250-500 ng, N = 7-10 사이클.
    3. 증폭된 라이브러리 DNA(50 μL)와 KAPA 순수 비드(40 μL)를 결합하여 0.8배 의 비드 기반 정리를 수행한 다음 DNA 믹스의 구슬을 여러 번 배관하여 철저히 재보습한다.
    4. 정리 단계 4.1.7-4.1.9를 수행합니다. 10m Tris HCL(pH = 8.0-8.5)의 50 μL에서 구슬을 철저히 재연하고 RT에서 2분 동안 구슬을 배양합니다.
    5. 클리어 상체의 50 μL을 새로운 튜브로 옮기고 두 번째 라이브러리 증폭 정화로 진행합니다.
    6. 증폭된 라이브러리 DNA(50 μL)와 KAPA 순수 구슬(50 μL)을 결합하여 1배 의 비드 기반 정리를 수행한 다음 DNA 믹스의 구슬을 여러 번 배펫으로 재보선다.
    7. 정리 단계 4.1.7-4.1.9를 수행합니다. 10m Tris HCL(pH = 8.0-8.5)의 22 μL에서 구슬을 철저히 재보선하고 RT에서 2분 동안 구슬을 배양합니다.
    8. 명확한 상체체의 20 μL을 새로운 튜브로 전송하여 Qbit 및 생체 분석기 측정으로 진행합니다.
  8. 농도 및 단편화 크기
    1. 샘플의 DNA 농도를 측정합니다. 고감도 형광염 계키트(예: Denovix Qbit, 재료 표참조) 또는 농도가 0.5 ng/μL 미만인 것으로 보이는 경우, 보다 민감한 qPCR 접근법을 사용하여 다시 정량화(예: Kappa 정량화, 재료표참조).
    2. 고감성 전기포고증(예를 들어, 생체 분석기)을 사용하여 라이브러리의 단편 크기를 결정합니다.
      참고: 선택적으로, qPCR에 의한 품질 관리는 cDNA 대신 희석된 준비된 라이브러리를 사용하여 시퀀싱(부록) 전에 수행될 수 있다.
  9. 시퀀싱
    1. 시퀀싱을 위해 라이브러리를 보냅니다. RNA-seq 차동 유전자 발현 분석을 위해, 시료 당 10-25백만 사이의 판독의 시퀀싱 깊이는 일반적으로 충분하다.

5. 데이터 사전 처리

  1. 품질 검사 Fastq 파일
    1. 다운로드 및 설치 Trimgalore16 낮은 품질의 기본 쌍과 Fastq 파일 내에서 빈 읽기를 제거합니다.
      참고 : 1) 여기에 언급 된 대부분의 소프트웨어는 리눅스에서만 작동합니다. Windows 컴퓨터로 제한되는 경우 소프트웨어 MobaXterm 또는 퍼티를 사용하여 Linux 서버에서 분석을 실행할 수 있습니다. 게놈색인싱의 경우 많은 무작위 액세스 메모리(RAM)가 필요합니다(약 64GB). 2) 콘다 환경에 필요한 모든 소프트웨어를 설치하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 소프트웨어 설치 및 패키지 관리가 용이합니다. 콘다에 대한 자세한 내용은 방문 및 https://docs.conda.io>.
    2. 폴더 'RNA_seq_KC_diff'과 같은 데이터에 대한 디렉터리(폴더)를 만듭니다. "cd/홈/사용자/RNA_seq_KC_diff/"를 입력하여 작업 디렉터리로 설정합니다.
      참고: 폴더 구조에 대한 개요는 추가 코딩 파일의 'folder_structure.txt'을 참조하십시오.
    3. 작업 디렉토리에 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', '스크립트', '매핑' 등의 특정 이름으로 여러 폴더를 만듭니다.
    4. 시퀀스된 데이터의 fasta 파일을 fastq 폴더로 이동합니다. 또는 디스크 공간을 절약하기 위해 Fastq 파일에 "ln–s 홈/사용자/old_location_fastq/FastqFile 홈/사용자/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile"이라는 명령을 사용하여 소프트 링크를 생성합니다.
    5. Fastq 파일에서 트림 트림을 실행, 코드가 강타로 붙여 넣기를 복사할 수 있도록 TrimGalore.txt 파일을 참조하십시오. 필요한 경우 명령 내에서 폴더 이름과 설정을 변경합니다.
  2. 매핑
    1. 예를 들어, hg38 ensembl 릴리스 97 (마스크되지 않은 버전)에 읽기를 매핑하는 게놈을 다운로드 ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz : 및 해당 유전자 부기 파일: hg 38 유전자 부조 ensembl 릴리스 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. 두 파일을 CRCh38_fasta 폴더로 전송한다.
      참고: 대안적으로 다른 버전의 게놈을 사용하, 예를 들어, Hg38의 UCSC 버전은 유전자 ID가 아닌 전사성 아이디에 매핑하는 것이 바람직하다.
    2. 설치 STAR 2.7.117.
    3. 생성 게놈 스크립트에 의해 STAR 2.7.1을 사용하여 사내 기준 게놈을 생성합니다(보충 코딩 파일참조). 스레드 양을 처리자가 가지고 있는 내용으로 변경합니다(--runThreadN X). 필요한 경우 이 스크립트의 폴더 이름과 설정을 변경합니다. 복사/붙여넣기로 실행합니다.
    4. bam 파일과 gzip을 인덱싱하기 위한 samtools 1.918을 설치하여 흔들리는 파일을 압축합니다.
    5. TRIM Galore 검증된 시퀀싱 판독을 STAR 2.7.1을 사용하여 인간 게놈 어셈블리 hg38(ensembl release 97)에 정렬한 다음 삼툴과 지퍼를 사용하여 인덱싱합니다. 스크립트 map_fastq.txt 사용하여 수행해야 합니다(추가 코딩 파일참조). 필요한 경우 이 스크립트의 폴더 이름과 설정을 변경합니다. 복사/붙여넣기로 실행합니다.
      참고: STAR 매핑은 Bam 파일, 흔들기 파일 및 Read counts 테이블 *_ReadsPerGene.out.tab을 포함하여 여러 출력 파일을 생성하며, 이는 R에서 직접 사용하여 Deseq2의 입력으로 사용할 수 있습니다.
  3. 게놈 브라우저 시각화
    1. UCSC 게놈 브라우저 도구에서 wigToBigWig를 설치하여 big2bw 스크립트19로빅위그 파일을 생성합니다.
    2. 추가 코딩 파일에서 작업 디렉터리의 폴더 '스크립트'로 파일을 'convertBigWigChroms.py'과 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt'로 전송합니다.
    3. convertBigWigChroms.py 실행 가능하게 합니다(명령을 사용하셔도: 리눅스 컴퓨터에서 'chmod +x 스크립트/변환BigWigChroms.py').
    4. 스크립트 wig2bw를 사용하여 흔들기 파일에서 bigWig 파일을 생성.txt(보충 코딩 파일참조). 복사/붙여넣기로 실행합니다.
    5. 시각화를 위해 UCSC 게놈 브라우저 또는 통합 유전체학 뷰어(IGV)에 BigWig 파일을 입력합니다.

6. RNA-seq 데이터 분석

  1. 데세q2에 샘플 데이터 입력
    1. Rstudio(버전 1.1.456) 및 R(버전 3.6)을 다운로드하고 설치합니다.
    2. 필요한 모든 R 패키지를 설치합니다(보충 코딩 파일 참조).
      참고: 모든 프로그래밍 코드 와 출력을 보여주는 자세한 R-마크다운 파일의 경우 첨부된 파일인 "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html"과 "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html"을 참조하세요. 모든 단계에 대한 일반적인 설명은 다음과 같습니다.
    3. ReadsPerGene.out.tab 파일에서 카운트 테이블을 생성합니다.
    4. 모든 파일 이름, 차별화 일 및 기타 관련 샘플 데이터가 포함된 샘플 데이터 파일을 작성합니다. 예제 샘플 파일의 경우 추가 코딩 파일에서"sample_data_example.csv"을 참조하십시오.
    5. 카운트 테이블 및 샘플 데이터를 사용하여 카운트 가능한 데이터와 샘플 데이터를 모두 포함하는 Deseq220 개체를 생성합니다.
  2. 유전자 발현 정규화, 샘플 거리 및 PCA
    1. Deseq2 rld 또는 vst 정규화를 사용하여 Deseq2 개체의 카운트 테이블을 정규화합니다. Rld 정규화는 바람직하지만 샘플이 많기 때문에 vst 정규화속도가 훨씬 빠릅니다.
    2. R에서"dist"함수를 사용하여 정규화된 판독 수 강도를 기반으로 샘플 거리를 플롯하고 샘플 거리에 따라"hclust"클러스터링을 수행합니다. 내열도 패키지를 사용하여 히트맵 자체를 플롯합니다.
    3. Deseq2의 플롯PCA 함수를 사용하여 정규화된 읽기 수 강도의 PCA 플롯을 생성합니다.
      참고: PCA는 탐색 데이터 분석의 도구로 사용되며 서로 다른 샘플 간의 거리와 관련성을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 차등/고가변 유전자 발현 분석
    1. Deseq2 결과 기능을 사용하여 차동 유전자를 계산합니다. 그러나 쌍별 비교가 적용되지 않는 여러 시점에서 변경 사항을 평가할 때 매우 가변적인 유전자를 사용합니다. 이 경우, rowVars 기능을 가진 다른 시간점에서 샘플 사이의 분산에 주문을 통해 상위 500 개의 매우 가변적인 유전자를 추출한다.
      참고: 우리의 분석에서, 대조군 견본을 위해, 상위 500의 고가변 유전자 (분화의 일 동안 그들의 정규화된 강렬의 최고 표준 편차를 가진 유전자)는 추가 분석을 위해 이용되었습니다. 그러나, 질병 대 대조분석을 위해 시간이 지남에 따라 질병과 건강한 대조군 사이의 유전자를 분화하여 다중 시험을 사용하여 1 x10-4의 p-값을 컷오프로 계산했다. 또 다른 가능한 필터링 단계는 특정 접이식 변화 차단보다 적게 변화하는 차동 유전자를 배제하는 것입니다.
    2. 다른 발현 패턴에 의해 클러스터링하는 차동 또는 매우 가변적인 유전자에 kmeans 클러스터링을 수행합니다.
    3. pheatmap 패키지를 사용하여 히트맵에서 차동 또는 매우 가변적인 유전자를 시각화합니다. 히트맵에 플롯된 강도는 중앙값과 함께 Deseq2 정규화된 강도입니다.
  4. 유전자 종양학 (GO) 별표 농축 분석
    1. 단일 샘플에서 10 개 이상의 카운트를 가진 모든 유전자를 취하여 표현된 배경 유전자의 목록을 생성합니다.
    2. GOrilla21과같은 온라인 도구를 사용하여 GO 분석을 수행합니다. 클러스터의 차동/매우 가변적인 유전자 목록을 "유전자 목록"으로 사용하고 배경 유전자를 비교의 배경으로 사용합니다.
      참고: 고급 R-사용자는 패키지 클러스터Profiler22를 사용하여 이동 기간 농축 분석을 자동화할 수 있습니다.

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Representative Results

정상적인 각질 세포 분화 및 RNA-seq 분석
이 실험에서, 5명의 개인에게서 유래된 각질 세포 라인은 분화 및 RNA-seq 분석을 위해 사용되었다. 도 1은 분화 및 RNA-seq 분석 결과의 실험 적 절차를 요약한다. 분화 시 정상적인 각질 세포 및 세포 형태 변화의 체외 분화 절차의 개요는 도 1A에도시된다. 원리 성분 분석(PCA)은 분화를 겪고 있는 각질 세포가 연결되었지만 뚜렷한 전반적인 유전자 발현프로파일(도 1B)을보였다. 고가변 유전자는 분화(도1C)동안유전자 발현 역학 및 패턴을 시각화하기 위해 kmeans에 의해 클러스터되었다.

유전자의 각 클러스터는 각질 세포 분화 특징 유전자 (예를 들어, 증식을 위한 KRT5, KRT1 및 KRT10 초기 및 중간 분화에 대 한, 그리고 늦은 분화를 위한 IVL/LOR/FLG)에 의해 표현되었다. 유전자 종양학(GO) 고가변 유전자 클러스터(도1C)의유전자 기능 분석(예를 들어, 분화의 중간 단계에서 각질화; 및 표피 세포 분화, 각질 세포 분화, 및 펩타이드 의 후기 에 대한 교차 연결; 그림 1D). 여러 분화 마커의 단백질 발현은 서양 블로팅(도1E)에의해 측정되었다.

P63 돌연변이 각질 세포 분화 및 RNA-seq 분석:
두 번째 실험에서, 세포 형태와 유전자 발현 차이는 건강한 대조군으로부터 각질세포와 p63 돌연변이(돌연변이R204W, R279H 및 R304W)를 운반하는 환자에서 유래한 3개의 선 사이에서 비교되었다. 도 2A는 분화 절차 및 세포 형태 변경에 대한 개요를 보여 주어집니다. 돌연변이 각질 세포는 접시의 표면에 평평하게 남아 있었고 7 일째에 제어 각질 세포로 붐비거나 겹치지 않았습니다.

PCA 분석에서, 대조군 세포주 명확하게 도 1B에비해 분화 패턴을 따랐다. 그러나, 분화 도중 돌연변이 세포의 유전자 발현의 패턴은 증식/미분화 세포의 것과 크게 유사하게 유지됩니다. 3개의 돌연변이 선 중, R279 샘플을 분화하는 것은 PC1과 PC2를 어느 정도 움직였으며, 이는 R204W 및 R304W에 비해 그 분화가 덜 손상되었음을 나타냅니다.

군집분석(도 2C)에서,대조군 세포(cluster 1)에서 조절된 유전자는 R204W 및 R279W에서 부분적으로 다운조절되었지만, 그들의 유전자 발현은 R304W에서 크게 변하지 않았다. 이러한 유전자는 GO 성서(그림2D)에의해 도시된 바와 같이 세포 증식에서 역할을 할 가능성이 높습니다. 클러스터2(도 2C)에서유전자는 먼저 유도되었고 그 후 대조군 세포에서 다운조절하였다. 이러한 유전자는 표피 분화 및 각질화 기능이 이 클러스터유전자(도 2D)를위해 높게 농축되었기 때문에 각질 세포 분화에 관여할 가능성이 높습니다. 이 유전자는 R204W 및 R304W에서 유도되지 않았습니다, R279H 세포에서 반면, 이 유전자는 유도되었지만 대조군 세포만큼 다운규제되지 않았습니다.

클러스터 3의 유전자는 대조군 세포에서 분화의 끝에서만 유도하였다(도2D). 이와 일치, 이러한 유전자는 외부 자극과 염증(도 2D)에반응하는 것으로 나타났기 때문에 표피의 외부 대부분의 층에 있는 역할을 할 수 있습니다. 이 유전자의 발현 패턴은 3개의 돌연변이 세포주 모두에 있는 많은 것을 바꾸지 않았습니다. 대조군과 돌연변이 세포 사이의 유전자 발현 패턴의 눈에 띄는 차이는 돌연변이 세포가 이러한 체외 분화 모델에서 제대로 분화 할 수 없음을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 각막 세포 분화 및 분석. (A) 각질 세포 분화 프로토콜 및 세포 형태에 대한 개요. 스케일 바 = 100 μm. (B) 분화 제어 각질 세포의 원리 성분 분석. (C) 각질 세포 분화 중 상위 500개의 매우 가변적인 유전자의 히트맵. 유전자는 kmean 클러스터링을 사용하여 3개의 클러스터에 군집됩니다. 각 유전자 클러스터에 대한 대표적인 분화 마커 유전자는 측면에 표시된다. (D) 모든 발현 유전자의 배경과 비교하여 매우 가변적인 유전자 클러스터에서 유전자에 대한 과대대표 기능의 GO 용어 농축 분석(>10의 개수). 고릴라는 농축 시험에 사용되었다. (E) 분화 시 각질 세포 분화 마커의 서쪽 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 제어 및 p63 돌연변이 각질 세포의 비교. (A) 각질 세포 분화 프로토콜 및 제어 및 p63 돌연변이 각질 세포의 세포 형태에 대한 개요. 스케일 = 100 μm. (B) 분화 제어 및 환자 (R204W, R279H 및 R304W) 각질 세포의 원리 성분 분석. (C) 대조군과 돌연변이 각질 세포 사이의 차동 유전자의 히트맵. 유전자는 kmean 클러스터링을 사용하여 3개의 클러스터에 군집됩니다. 각 유전자 클러스터에 대한 대표적인 분화 마커 유전자가 표시된다. (D) 모든 발현 유전자의 배경과 비교하여 매우 가변적인 유전자 클러스터에서 유전자에 대한 과대대표 기능의 GO 용어 농축 분석(>10의 개수). 고릴라는 농축 시험에 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

KGM 컴포넌트 주식 보통 볼륨
KBM 500 mL
펜/스트렙 100,000대/mL 100대/mL 5 mL
Bpe ~13 mg/mL 0.4% 2 mL
에타놀라민 0.1 M 0.1 mM 500 μL
오인포에탄 0.1 M 0.1 mM 500 μL
하이드로코르티손 0.5 mg/mL 0.5 μg/mL 500 μL
인슐린 5 mg/mL 5 μg/mL 500 μL
Egf 10 μg/mL 10 ng/mL 500 μL

표 1. KGM-프로 중간 보충.

KGM 컴포넌트 주식 보통 볼륨
KBM 500 mL
펜/스트렙 100,000대/mL 100대/mL 5 mL
에타놀라민 0.1 M 0.1 mM 500 μL
오인포에탄 0.1 M 0.1 mM 500 μL

표 2. KGM-diff 중간 보충.

추가 코딩 파일: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; 트림갈로레.txt; 와 위그2bw.txt. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 작품은 RNA-seq 분석을 사용하여 인간 각질 세포 분화 및 후속 특성화를 유도하는 방법을 설명합니다. 현재 문헌에서는, 인간 각질세포분화에 대한 많은 연구가 2,3,23의분화를 유도하는 방법으로높은 칼슘 농도 또는 혈청을 사용하는 두 가지 다른 방법을 사용한다. 이전 보고서는 이 세 가지 다른 방법3을 신중하게 비교하고 이러한 방법이 각질 세포 분화의 뚜렷한 생물학을 나타낼 수 있음을 보여 주었다. 이 같은 보고서에서, 저자는 혈청에 의해 유도된 분화세포가 건선 피부에서 발현되지만 정상 표피에서는 발현되지 않는 KRT16 및 SKALP/PI3와 같은 높은 증식 전위 및 발현 유전자를 가지고 있으며, 따라서 혈청 유도 분화 모델을 건선을 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다. 대조적으로, 접촉 억제 및 성장 인자 배제방법은 KRT1 및 KRT10을 유도할 수 있으며, 이는 일반적으로 표피로 표현되고 정상 각질 세포 분화를 닮았다. 높은 칼슘 유도는 혈청 유도와 접촉 억제 사이의 유전자 발현 프로파일을 발생시키는데, 이는 최소한의 특정 방법으로서. 분화 중 RNA-seq 분석을 이용한 분석은 접촉 억제 및 성장 인자 배제 방법이 표피 분화에 예상되는 것과 유사한 유전자 발현 프로파일을 가진 분화 각질 세포(예를 들어, KRT5, KRT1 및 KRT10의 초기 분화 유도에서, 및 LOR 및 FLG의 후기에 다른) 결과임을 확인했습니다. 그림 1C).

이러한 연구 결과는 이 분화 기술이 각질 세포 분화를 연구하기 쉬운 사용및 신뢰할 수 있는 방법임을 보여줍니다. 더욱이, p63 돌연변이 각질 세포에서 유래된 각질 세포에 대한 이 연구는 또한 질병조건 하에서 영향을 받는 각질 세포 분화를 연구하기 위하여 방법을 사용할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 시험관 내 분화 접근법에서, 론자에서 구입한 KGM은 이 매체가 일관된 결과를 산출하기 때문에 사용됩니다. 원칙적으로, 열피셔 과학의 각질 세포 혈청 프리 배지(KSFM)와 같은 유사한 조성물을 가진 다른 표피 매체도 적합할 수 있지만, 이를 테스트해야 합니다.

이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 접촉 억제에 기초하기 때문에 세포 밀도의 결합이 요구된다. p63 돌연변이 각질 세포를 가진 우리의 실험에서, 더 높은 초기 파종 조밀도는 세포가 합류에 도달하기 위하여 지키기 위하여 필요했습니다. 또한 세포가 동일한 속도로 성장하지 않을 때는 다른 날에 분화가 유도되기도 합니다. 이러한 고려 사항은 실험을 설정할 때 고려해야 합니다. 세포가 동시에 유도되어야 하는 실험 환경에서는 혈청, 고농도의 칼슘, 표피 성장 인자 수용체2,3의억제를 포함한 다른 분화 방법을 고려해야 한다. 그럼에도 불구하고, 모든 체외 분화 방법은 프로와 단점을 가지며, 생체 내 피부 발달2에서존재하는 부분 분화 유도 신호를 나타낼 수 있기 때문에.

이러한 다른 방법을 비교하는 포괄적인 분자 분석은 매우 유익할 것이고 생물학 프로세스에 대한 다른 연구 결과에 가장 적합한 방법의 선택을 지시할 수 있습니다. 또한, 전사 수준에서 측정된 변경 사항을 검증하는 것은 예를 들어, 서양 블로팅 또는 프로테오믹 분석을 통해 매우 권장됩니다. 더욱이, 체외 데이터는 주의해서 사용해야 하며, 이러한 모델의 결론은 생체 내에서, 바람직하게는 인간의 피부 발달에서 검증되어야 한다.

RNA 추출 및 RNA-seq 라이브러리 제제의 기본 원리는 이전에24,25,26,27,28로잘 기술되었다. 이 프로토콜에서 RNA 추출 및 RNA-seq 라이브러리 준비 절차는 시판되는 키트의 워크플로우를 기반으로 합니다. 원칙적으로 RNA 추출을 위한 다른 방법은 RNA 품질이 양호한 경우 RNA-seq 분석에 큰 영향을 미치지 않아야 한다. RNA 품질이 좋지 않은 경우(즉, RNA가 포르말린 고정 파라핀-임베디드 조직을 추출할 때), RNA-seq는 여전히 수행될 수 있습니다. 그러나 RNA 단편화 단계를 조정해야 한다. RNA-seq 라이브러리 제제는 리보소말 RNA(rRNA) 제거에서 시퀀싱을 위한 cDNA 라이브러리 시공까지 다룹니다. 주요 절차는 다양한 키트를 사용하거나 개별 효소 및 수제완충제(29,30,31, 32)를사용하여 수행될 수 있다. RNA-seq 분석이 다른 기본 원리(예를 들어, 폴리T 올리고에 혼성화에 의한 리보소말 RNA 고갈 또는 폴리A mRNA 농축)를 사용하여 수행되는 경우 RNA-seq 분석의 결과가 다를 수 있다는 점에 유의해야 한다. 더욱이, 이 프로토콜은 인간, 마우스 및 쥐 rRNA에 DNA 올리고의 혼성화에 의한 리보소말 RNA 제거를 이용한다. 다른 종으로 작업 할 때, 대체 올리고 세트를 고용해야합니다.

생성된 라이브러리의 시퀀싱은 조각의 양쪽 끝(쌍단)이나 조각의 한쪽 끝(단일 끝)에서 수행될 수 있다. 일반적으로 페어링된 엔드 시퀀싱은 mappability를 크게 향상시키고 성적증명서 변형에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 그러나, 여기에 설명된 바와 같이 비교적 간단한 차동 유전자 분석을 위해, 단단 염기 시퀀싱은 또한 충분한 정보를 제공할 수 있다.

데이터 분석의 중요한 단계에 대해, 패스트크 파일의 품질 관리를 위한 비교적 간단한 방법이 설명되고, 그 다음에 는 게놈에 대한 매핑 판독이 뒤따릅니다. 제공된 bash 코드는 이상적인 확장성을 가지고 있지 않지만 투명성의 장점이 있습니다. 수행 단계인 소프트웨어와 데이터 전처리 중에 사용되는 게놈의 버전은 모두 문서화해야 하는 비사소한 단계이며 반복성에 필수적입니다.

고급 사용자의 경우, 자동화된 파이프라인을 사용하여 fastQ 파일 품질 검사, 어댑터 트리밍 및 매핑, 예: ARMOR 스네이크 제작 워크플로우33 또는 반 헤링겐랩(34)의'RNA-seq' 스네이크메이크 워크플로우단계를 수행할 수 있다. 그러나 이러한 완전히 자동화된 파이프라인은 투명하지 못하고 변경하기가 더 어렵습니다. 이러한 도구를 사용하는 경우 이러한 자동화된 파이프라인 내의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 프로토콜은 시간이 지남에 따라 가변 유전자 발현에 중점을 둔 RNA-seq 데이터 분석을 포함한다. 가변 유전자 발현은 분화와 같은 여러 시간점을 가진 프로세스를 볼 때 쌍별 차동 검사보다 선호된다. 결론적으로, 이 분석 파이프라인은 RNAseq 데이터의 생물정보 분석을 위한 관련 도구를 소개합니다. 여기에는 정상 및 질병 조건 하에서 각질 세포 분화를 철저히 평가할 수 있는 도구가 포함되어 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 과학 연구를위한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO / ALW / MEERVOUD / 836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/오픈 대회/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); 라드부 드 대학 펠로우십 (H.Z.); 중국장학원 교부금 201406330059(J.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

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References

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유전학 문제 159 인간 기본 각질 세포 2D 침수 배양 체외 분화 RNA-seq 생물 정보학 분석 p63
RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화
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Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues,… More

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

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