Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.

Abstract

Menselijke primaire keratinocyten worden vaak gebruikt als in vitro modellen voor studies over epidermale differentiatie en aanverwante ziekten. Methoden zijn gemeld voor in vitro differentiatie van keratinocyten gekweekt in tweedimensionale (2D) ondergedompelde manieren met behulp van verschillende inductie voorwaarden. Hier beschreven is een procedure voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie methode door contactremming en latere moleculaire karakterisering door RNA-seq. Kortom, keratinocyten worden geteeld in gedefinieerd keratinocyten medium aangevuld met groeifactoren totdat ze volledig samenvloeien. Differentiatie wordt veroorzaakt door nauwe contacten tussen de keratinocyten en verder gestimuleerd door het uitsluiten van groeifactoren in het medium. Aan de hand van RNA-seq-analyses wordt aangetoond dat beide 1) gedifferentieerde keratinocyten verschillende moleculaire kenmerken vertonen tijdens differentiatie en 2) het dynamische genexpressiepatroon lijkt grotendeels op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Wat de vergelijking met normale keratinocyten differentiatie, keratinocyten dragen mutaties van de transcriptie factor p63 vertonen veranderde morfologie en moleculaire handtekeningen, in overeenstemming met hun differentiatie gebreken. Tot slot beschrijft dit protocol de stappen voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie en de moleculaire karakterisering ervan, met de nadruk op bio-informatica analyse van RNA-seq gegevens. Omdat RNA extractie en RNA-seq procedures zijn goed gedocumenteerd, het is niet de focus van dit protocol. De experimentele procedure van in vitro keratinocyten differentiatie en bio-informatica analyse pijplijn kan worden gebruikt om moleculaire gebeurtenissen te bestuderen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.

Introduction

Menselijke primaire keratinocyten afgeleid van de menselijke huid worden vaak gebruikt als een cellulair model om de biologie van de opperhuid1,2,3,4te bestuderen . De gelaagdheid van de opperhuid kan worden gemodelleerd door keratinocyten differentiatie, hetzij in een 2D ondergedompeld monolayer mode of 3D lucht-lift organotypic model2,3,5,6,7. Hoewel 3D-modellen steeds belangrijker zijn geworden om de epidermale structuur en functie te beoordelen, worden 2D-differentiatiemodellen nog steeds veel gebruikt, vanwege hun gemak en de mogelijkheid om grote aantallen cellen voor analyses te genereren.

Er zijn verschillende voorwaarden toegepast voor het induceren van keratinocytendifferentiatie in 2D, waaronder toevoeging van serum, hoge concentratie calcium, lagere temperatuur en remming van epidermale groeifactorreceptoren2,3. Elk van deze methoden is gevalideerd door een aantal keratinocyten differentiatie marker genen en aangetoond effectief te zijn in de beoordeling van keratinocyten differentiatie, ook onder pathologische omstandigheden. Deze inductieomstandigheden vertonen echter ook verschillen in hun differentiatieefficiëntie en kinetiek wanneer specifieke panelen van markergenen worden onderzocht2,3.

Een van deze methoden omvat keratinocyten contactremming en uitputting van groeifactoren in het cultuurmedium8. Het is aangetoond dat keratinocyten spontaan kunnen differentiëren wanneer cellen de volledige dichtheid bereiken.  Het uitsluiten van groeifactoren in het cultuurmedium kan de differentiatie verder verbeteren. De methode die contactremming combineert en groeifactoren uitputten, is aangetoond dat het gedifferentieerde keratinocyten genereert met genexpressiepatronen die vergelijkbaar zijn met de normale gestratificeerde opperhuid bij het gebruik van verschillende opperhuidmarkeringen3,wat suggereert dat dit model geschikt is voor het bestuderen van normale keratinocytendifferentiatie. Onlangs zijn twee uitgebreide genexpressieanalyses van keratinocytendifferentiatie gerapporteerd met behulp van dit model9,10. Onderzoekers valideerden dit model op moleculair niveau en toonden aan dat het kan worden gebruikt om normale en zieke keratinocytendifferentiatie te bestuderen.

Dit protocol beschrijft de procedure voor de in vitro differentiatie methode en moleculaire analyse van gedifferentieerde cellen met behulp van RNA-seq. Het illustreert ook karakterisering van de transcriptie van cellen op differentiatie dag 0 (proliferatie fase), dag 2, dag 4, en dag 7 (vroeg, midden, en late differentiatie, respectievelijk). Het is aangetoond dat gedifferentieerde keratinocyten genexpressiepatronen vertonen die grotendeels lijken op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Om te onderzoeken of deze methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van huidpathologie, hebben we dezelfde experimentele en analysepijplijn toegepast om keratinocyten te onderzoeken die mutaties dragen van de transcriptiefactor p63 die zijn afgeleid van patiënten met ectrodactyly, ectodermal displasie en gespleten lip/gehemelte (EEG) syndroom11,12. Dit protocol richt zich op de in vitro differentiatie van keratinocyten en de daaropvolgende bio-informatica analyse van RNA-seq. Andere stappen in de volledige procedure, zoals RNA extractie, RNA-seq monster voorbereiding en bibliotheek bouw, zijn goed gedocumenteerd en kan gemakkelijk worden gevolgd, vooral bij het gebruik van vele veelgebruikte commerciële kits. Daarom worden deze stappen slechts kort beschreven in het protocol. De gegevens tonen aan dat deze pijpleiding geschikt is voor het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Huidbiopten werden genomen uit de stam van gezonde vrijwilligers of patiënten met p63 mutaties, om de primaire keratinocytencultuur op te zetten. Alle procedures voor de oprichting van menselijke primaire keratinocyten zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Radboud Universitair Medisch Centrum Nijmegen (Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen). Er werd geïnformeerde toestemming verkregen.

1. Menselijke primaire keratinocytendifferentiatie door contactremming

  1. Bereid keratinocyten groeimedium (KGM) van Keratinocyte Basal Medium (Tabel van materialen) indien nodig.
  2. Maak 500 mL proliferatiemedium met behulp van vooraf bereide voorraden (KGM-pro; zie tabel 1).
  3. Maak 500 mL-differentiatiemedium (KGM-dif; zie tabel 2).
    LET OP: KGM met supplementen kan twee weken op 4 °C worden gehouden. Voor een langere opslag kan het worden opgeslagen en opgeslagen bij -20°C.
  4. Zaad primaire keratinocyten in de dichtheid van 5,0-20 x 103 cellen/cm2, afhankelijk van de celprolifererende capaciteit. Voeg voldoende KGM-pro medium toe om cellen te bedekken.
    LET OP: 1) Details van de reguliere celcultuur binnen KGM medium zijn te vinden op de website van Lonza13. 2) De zaaidichtheid moet voor elke cellijn worden getest. Een normale primaire keratinocytenlijn kan bijvoorbeeld worden gezaaid met een dichtheid van 5,0 x 103 cellen/cm2, terwijl een lijn met mutaties in de transcriptiefactor p63 die minder prolifererend is, moet worden gezaaid bij een dichtheid van 20 x 103 cellen/cm2. 3) Afhankelijk van de experimentele opstelling moeten verschillende schotels of putten van cellen worden gezaaid om monsters op verschillende differentiatiedagen in replica's te kunnen verzamelen.
  5. Vernieuw cellen met het KGM-pro medium gedurende twee dagen na het zaaien (zaaien op dag 0, verfrissend voor de1e keer op dag 3). Daarna, vernieuwen met KGM-pro medium om de andere dag. Controleer cellen regelmatig, ten minste om de andere dag.
  6. Induceer celdifferentiatie wanneer cellen meer dan 90% samenvloeien door het medium te veranderen in KGM-dif. De dag van het veranderen van medium naar KGM-dif wordt gedefinieerd als differentiatiedag 0. Verzamel cellen voor verdere RNA-analyses door eerst 2x te wassen met DPBS, daarna in de lysebuffer (van een RNA-extractiekit) op te nemen.
    OPMERKING: Met de bovengenoemde zaaidichtheid moeten cellen binnen 7-10 dagen samenvloeiing bereiken. Cellen kunnen worden gezaaid met een hogere initiële dichtheid om samenvloeiing sneller te bereiken. Als cellen niet proliferative zijn, kan langer wachten geen aanleiding geven tot volledig samenvloeiende cellen. Een hogere zaaidichtheid kan nodig zijn.
  7. Vernieuw cellen met het KGM-dif medium elke dag en verzamel cellen op differentiatiedag 2, 4. en 7 voor verdere RNA-extractie.

2. RNA-extractie

  1. Isoleer totaal RNA. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van een commerciële RNA isolatie kit (zoals Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA), of met behulp van fenol14. Echter, een isolatie kit met een DNAse behandeling wordt sterk aanbevolen voor RNA-seq monsters om DNA-besmetting en fenol te voorkomen. Een voorbeeld van een commerciële RNA-isolatie kit wordt gegeven in de tabel van materialen.
  2. Meet de RNA-concentratie met een spectrometer. Zowel DNA als RNA hebben een absorptiepiek van 260 nm.
    LET OP: 1) De verhouding tussen de absorpties op 260 nm en 280 nm wordt gebruikt om de zuiverheid van het RNA te beoordelen. Een verhouding van ongeveer 2,0 wordt algemeen aanvaard als 'puur' RNA. Als de verhouding aanzienlijk lager is dan 2,0, kan het monster besmet zijn met verontreinigingen die bij 280 nm absorberen, zoals eiwitten, fenolen of andere stoffen. 2) De verhouding tussen de absorpties op 260 nm en 230 nm meet nucleïnezuur zuiverheid. Er wordt een ratio tussen 2,0 en 2,2 verwacht. Als de verhouding aanzienlijk lager is, kan het monster besmet zijn met verontreinigingen die 230 nm absorberen, zoals EDTA, ethanol of andere stoffen.

3. RNA-kwaliteitscontrole

  1. Voer RNA uit op een bioanalyzer RNA Pico-chip om RNA Integrity Number (RIN) kwantitatief te valideren, of op een gel voor een kwalitatieve maat. In het algemeen is een RIN van ten minste acht zeer aan te raden. Echter, bij het extraheren van RNA uit weefsels de RIN lager kan zijn.
    OPMERKING: Optioneel kan de kwaliteitscontrole worden uitgevoerd door qPCR op het RNA-materiaal.

4. RNA-seq bibliotheekvoorbereiding

LET OP: De RNA-seq bibliotheek voorbereiding wordt vaak uitgevoerd met een commerciële kit of onder commerciële instellingen. Het beschreven protocol is aangepast van een commerciële kit, KAPA RNA HyperPrep Kit met RiboErase (Illumina), met een korte beschrijving van alle vereiste stappen: rRNA uitputting met oligo hybridisatie aan menselijke ribosomale RNAs, RNA fragmentatie, eerste streng synthese, tweede streng synthese en A-tailing, en na het opruimen van elke stap15. Andere bibliotheekvoorbereidingskits kunnen ook voor dit doel worden gebruikt. Het wordt aanbevolen om deze stap uit te voeren met behulp van een commercieel beschikbare kit, omdat de kwaliteit van de gegenereerde cDNA-bibliotheek vaak consistenter is. 2) De volgende stappen worden beschreven voor 1x bibliotheekvoorbereiding. Als u meerdere monsters voorbereidt, maakt u mastermixen met 10% extra volume.

  1. Oligo-hybridisatie en rRNA-uitputting
    1. Oligo hybridisatie master mix voorbereiden (totaal = 11 μL, met 4,4 μL hybridisatiebuffer, 4,4 μL hybridisatie oligo's en 2,2 μL RNase-vrij water) en uitputtingsmastermix (totaal = 5,5 μL, met 3,3 μL uitputtingsbuffer en 2,2 μL RNase H).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler: 95 °C gedurende 2 min; hellingsgedemper tot 45 °C bij -0,1 °C/s; pauze van 45 °C; 45 °C gedurende 30 minuten; 4 °C voor altijd.
      OPMERKING: Overweeg om te beginnen met het dubbele van de hoeveelheid RNA dan nodig is voor versterking. Gebruik in de eerste poging de helft van het bedrag om door te gaan met de volgende stappen. Dit is om ervoor te zorgen dat er nog steeds materiaal is om deze stappen te herhalen met een ander aantal cycli (zie stap 4.7.2), als de cycli van versterking onvoldoende of overgeamplificeerd blijken te zijn.
    3. Gebruik tussen 25 ng en 1 μg totaal RNA in 10 μL RNAse-vrij water, voeg 10 μL oligo hybridisatie master mix toe. Plaats monsters in de voorgeprogrammeerde thermocycler en start het programma.
    4. Wanneer het programma de pauzestap bij 45 °C bereikt, voegt u 5 μL uitputtingsmastermix toe aan de 20 μL-hybridisatiereactie zonder deze uit de thermocycler te verwijderen. Meng grondig door pipetting op en neer meerdere malen.
    5. Hervat het thermocyclerprogramma om door te gaan met de uitputtingsstap (45 °C gedurende 30 min).
      OPMERKING: 1) Zet de kralen voor rRNA-uitputting (bijvoorbeeld KAPA pure kralen) bij kamertemperatuur (RT) tijdens de uitputtingsstap voor het volgende deel van het protocol. 2) Overweeg de DNase spijsverteringsmastermix voor te bereiden (voor sectie 4.2), omdat de reagentia direct na de rRNA-uitputtingsopruiming nodig zijn.
    6. Voer een KAPA Pure Beads-opschoning van 2,2x kraal uit: combineer de RNA-mix (25 μL) en KAPA Pure Beads (55 μL), door de kralen in de RNA-mix grondig te resuspend door meerdere keren op en neer te pipetten.
    7. Broed op RT gedurende 5 minuten om RNA-binding aan de kralen mogelijk te maken en plaats de buis(en) op een magneetrek om de kralen vast te leggen totdat de vloeistof helder is, en verwijder en gooi 60 μL supernatant voorzichtig weg.
    8. Houd de buis(en) op de magneet, was 2x met 200 μL ethanol van 80% door de kralen uit te broeden met de ethanol voor ≥30 s en gooi de ethanol weg. Probeer alle resterende ethanol te verwijderen zonder de kralen te storen na de tweede wasbeurt.
    9. Droog de kralen bij RT gedurende 3-5 min of totdat alle ethanol is verdampt.
      LET OP: Overdrogen van de kralen kan leiden tot een lagere opbrengst.
  2. DNase spijsvertering
    1. Bereid de DNase-verteringsmastermix voor (totaal = 22 μL, met 2,2 μL DNase-buffer, 2 μL DNase en 17,8 μL RNase-vrij water).
    2. Resuspend de kralen in DNAse spijsvertering master mix (20 μL) door pipetting op en neer meerdere malen. Incubeer de buis(en) bij RT gedurende 3 minuten om het RNA van de kralen te halen.
    3. Plaats de buis(en) op een magneetrek om de kralen op te vangen, totdat de vloeistof helder is en breng voorzichtig 20 μL supernatant over in een schone buis.
    4. Incubeer de buis(en) met supernatant op 37 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: Overweeg de RNA-elutie,fragmentatie en priming mastermixen (voor sectie 4.3) voor te bereiden, omdat de reagentia direct nodig zijn na het opruimen van de DNase-spijsvertering.
    5. Voer een opschoning op basis van 2,2 x kraal uit door 4.1.6–4.1.9 te volgen.
  3. RNA-elutie, fragmentatie en priming
    1. Bereid de Mastermix Fragment, Prime en Elute Buffer (1x) voor met 11 μL Fragment, Prime en Elute Buffer (2x) en 11 μL RNase-vrij water.
    2. Grondig resuspend de kralen met gezuiverde, DNase-behandeld RNA in 22 μL fragmentatie, Prime en Elute Buffer (1x) door meerdere keren op en neer te pipezen.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten om RNA van de kraal s teeluteeren en plaats de buis(en) op een magneet om de kralen vast te leggen totdat de vloeistof helder is.
    4. Breng voorzichtig 20 μL supernatant over in een buis(en). Gooi de buis(en) weg met kralen.
      LET OP: Dit is een veilige stopplaats, omdat monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor ≤24 uur.
    5. Plaats de buis(en) in een thermocycler en voer de fragmentatie en priming gedurende 6 minuten uit op 94 °C. Resulterend in ongeveer 200-300 bp lange fragmenten.
      OPMERKING: Incubeer gedurende 8 minuten bij 94 °C voor 100-200 bpfragmenten. Bij het gebruik van gedeeltelijk gedegradeerd RNA, fragment tussen 1-6 min bij 85 °C, afhankelijk van de ernst van de afbraak.
    6. Plaats de buis(en) op ijs en ga onmiddellijk over tot de eerste strengsynthese.
  4. Eerste strengsynthese
    1. Bereid de eerste bundelsynthesemastermix voor (totaal = 12 μL, met 11 μL eerste strengsynthesebuffer en 1 μL KAPA-script).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler: 25 °C gedurende 10 minuten; 42 °C gedurende 15 minuten; 70 °C gedurende 15 minuten; 4 °C voor altijd.
    3. Combineer op ijs 20 μL gefragmenteerd geprimed RNA met 10 μL eerste strengsynthesemastermix. Houd de buis(en) op ijs, meng grondig door de reactie meerdere keren op en neer te pipetten.
    4. Plaats de buis(en) in de voorgeprogrammeerde thermocycler en start het programma.
  5. Tweede strengsynthese en A-tailing
    1. Bereid tweede strengsynthese en A-tailing master mix op ijs voor (totaal = 33 μL, met 31 μL tweede strengsynthesebuffer en 2 μL tweede strengsynthese en A-tailing enzymmix).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler: 16 °C gedurende 30 minuten; 62 °C gedurende 10 minuten; 4 °C voor altijd.
    3. Combineer 30 μL van eerste streng synthese product met 30 μL van tweede streng synthese en A-tailing master mix, en meng grondig door pipetting op en neer meerdere malen op ijs.
    4. Plaats de buis(en) in de voorgeprogrammeerde thermocycler en start het programma.
  6. Adapter ligatie en post-ligation opschoning
    1. Verdun voorraadadapters (NEXTflex DNA barcodes, 25 μM) 3,57x in RNase-vrij water tot 7 μM.
    2. Bereid adapter ligatie master mix (totaal = 50 μL, met 40 μL ligatie buffer en 10 μL van DNA ligase).
    3. Combineer 60 μL tweede streng synthese product, 45 μL adapter ligatie master mix, en 5 μL van verdunde adapters. Meng grondig door pipetting op en neer meerdere malen op ijs.
    4. Incubeer de buizen op 20 °C gedurende 15 minuten en ga onmiddellijk verder met de eerste post ligation cleanup.
    5. Voer een opschonende opschoning van 0,63x kraal uit door het combineren van dna-mix met adapterligated (110 μL) en KAPA pure kralen (70 μL), en vervolgens de kralen in de DNA-mix grondig opnieuw op en neer te zetten door meerdere keren op en neer te pipetten.
    6. Herhaal stap 4.1.7–4.1.9.
    7. Haal de buizen uit de magneet. Resuspend de kralen grondig in 50 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) en de kralen in RT gedurende 2 minuten uitbroeden.
    8. Plaats de plaat op de magneet en wacht tot de vloeistof vrij is. Breng 50 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis.
      LET OP: Veilige stopplaats voor minder dan 24 uur bij 4 °C.
    9. Voer een opschoning op basis van 0,7 x kraal uit door 50 μL kralen te combineren met gezuiverd adapter-gebonden DNA met 35 μL PEG/NaCL-oplossing. Meng grondig door vortexing.
    10. Voer opruimstappen 4.1.7–4.1.9 uit. Grondig resuspend de kralen in 20 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), en de kralen in RT gedurende 2 min uitbroeden.
    11. Leg de plaat op de magneet; wacht tot de vloeistof veilig is. Breng 20 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis en ga naar sectie 4.7.
      LET OP: Veilige stopplaats voor minder dan 1 week bij 4 °C of minder dan 1 maand bij -20 °C.
  7. Versterking en opschoning van de bibliotheek
    1. Bereid de bibliotheekversterkingsmastermix voor (totaal = 33 μL, met 27,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix en 5,5 μL 10x bibliotheekversterkingsprimermix).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler met behulp van de volgende parameters. 98 °C voor 45 s; N cycli (zie de noot hieronder) van: 98 °C voor 15 s; 60 °C voor 30 s; 72 °C voor 30 s; 72 °C gedurende 1 min; en 4 °C voor altijd.
      OPMERKING: De cycli voor de versterking van de bibliotheek zijn afhankelijk van het invoermateriaal. Het kan ruwweg als zodanig worden geschat: te beginnen met RNA = 25-100 ng, N = 11–15 cycli; 100-250 ng, N = 9–12 cycli; 250–500 ng, N = 7-10 cycli.
    3. Voer een opschonende opschorting uit op basis van 0,8 x kraal door versterkt bibliotheek-DNA (50 μL) en KAPA zuivere kralen (40 μL) te combineren en vervolgens de kralen in de DNA-mix grondig te hergebruiken door meerdere keren op en neer te pipetten.
    4. Voer opruimstappen 4.1.7–4.1.9 uit. Grondig resuspend de kralen in 50 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), en de kralen in RT gedurende 2 min uitbroeden.
    5. Breng 50 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis en ga naar de tweede bibliotheekversterkingsopruiming.
    6. Voer een opschonende opschoning uit op basis van 1x kraal door versterkt bibliotheek-DNA (50 μL) en KAPA zuivere kralen (50 μL) te combineren en vervolgens de kralen in de DNA-mix grondig te resuspend door meerdere keren op en neer te pipezen.
    7. Voer opruimstappen 4.1.7–4.1.9 uit. Grondig resuspend de kralen in 22 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), en de kralen in RT gedurende 2 min uitbroeden.
    8. Breng 20 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis ga naar Qbit- en bioanalyzermetingen.
  8. Concentratie- en fragmentatiegrootte
    1. Meet dna-concentraties van de monsters. Met behulp van een zeer gevoelige fluorescerende verf-gebaseerde kit (bijvoorbeeld Denovix Qbit, zie Tabel van Materialen), of als de concentratie lijkt te zijn onder 0,5 ng/μL, requantificeren met behulp van een meer gevoelige qPCR aanpak (bijvoorbeeld Kappa Quantification, zie Tabel van Materialen).
    2. Bepaal de fragmentgrootte van de bibliotheek met behulp van hooggevoelige elektroforese (bijvoorbeeld een bioanalist).
      OPMERKING: Optioneel kan kwaliteitscontrole door qPCR worden uitgevoerd voordat sequencing (Appendix) wordt uitgevoerd met behulp van een verdunde geprepareerde bibliotheek in plaats van cDNA.
  9. Sequencing
    1. Stuur de bibliotheek voor sequencing. Voor RNA-seq differentiële genexpressie analyse, een sequencing diepte van leest tussen 10-25 miljoen per monster is over het algemeen voldoende.

5. Voor verwerking van gegevens

  1. Kwaliteitscontrole Fastq-bestanden
    1. Download en installeer Trimgalore16 om basisparen van lage kwaliteit en lege reads in de Fastq-bestanden te verwijderen.
      LET OP: 1) De meeste hier genoemde software werkt alleen in Linux. Indien beperkt tot een Windows-computer, is het mogelijk om analyses uit te voeren op een Linux-server met behulp van de software MobaXterm of Putty. Houd er rekening mee dat voor genoom indexering veel random-access geheugen (RAM) vereist is (ongeveer 64 GB). 2) Het installeren van alle benodigde software in een conda-omgeving is een aanrader. Dit maakt eenvoudige software-installatie en pakketbeheer mogelijk. Ga voor meer informatie over conda naar .
    2. Maak een map (map) voor de gegevens, bijvoorbeeld de map 'RNA_seq_KC_diff'. Stel dit in als de werkmap door te typen: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      LET OP: Zie 'folder_structure.txt' in de aanvullende coderingsbestanden voor een overzicht van de mapstructuur.
    3. Maak verschillende mappen in de werkmap met de specifieke namen: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' en 'Mapping'.
    4. Verplaats de fasta-bestanden van de gesequencede gegevens naar de fastq-map. U ook zachte koppelingen genereren met behulp van de opdracht: ln -s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile naar de Fastq-bestanden om schijfruimte te besparen.
    5. Voer Trim in overvloed op de Fastq-bestanden, zie de TrimGalore.txt bestand voor de code te kopiëren plakken in bash. Wijzig indien nodig mapnamen en -instellingen in de opdracht.
  2. Toewijzing
    1. Download een genoom om de reads in kaart te brengen op bijvoorbeeld hg38 ensembl release 97 (ontmaskerde versie): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; en het bijbehorende genannotatiebestand: hg 38 genannotatie ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Breng beide bestanden over naar de CRCh38_fasta map.
      OPMERKING: Als alternatief gebruik maken van een andere versie van het genoom, bijvoorbeeld, de UCSC-versie van hg38, als mapping om id's te transcripteren in plaats van gen-id's de voorkeur heeft.
    2. Installeer STAR 2.7.117.
    3. Genereer een eigen referentiegenoom met STAR 2.7.1 door het genoomscript te genereren (zie Aanvullende coderingsbestanden). Wijzig de hoeveelheid threads in wat de processer heeft (--runThreadN X). Wijzig indien nodig mapnamen en -instellingen in dit script. Voer het door te kopiëren / plakken in bash.
    4. Installeer samtools 1.918 voor het indexeren van de bam-bestanden en gzip om de wiggle-bestanden te comprimeren.
    5. Lijn de Trim Galore gevalideerde sequencing leest op de menselijk genoom assemblage hg38 (ensembl release 97) met behulp van STAR 2.7.1, gevolgd door indexering met behulp van samtools en gzip. Dit moet worden uitgevoerd met behulp van het script map_fastq.txt (zie Aanvullende coderingsbestanden). Wijzig waar nodig de mapnamen en -instellingen in dit script. Voer het door het kopiëren / plakken in bash.
      OPMERKING: STAR-toewijzing genereert verschillende uitvoerbestanden, waaronder een bam-bestand, een wiggle-bestand en leestellingstabel met de naam *_ReadsPerGene.out.tab, die direct door R kunnen worden gebruikt om te gebruiken als invoer voor Deseq2.
  3. Genoombrowservisualisatie
    1. Installeer wigToBigWig van de UCSC genoom browser tools om bigwig bestanden te genereren met de big2bw script19.
    2. Breng de bestanden 'convertBigWigChroms.py' en 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' van de aanvullende coderingsbestanden over naar een map 'scripts' in de werkmap.
    3. Maak de convertBigWigChroms.py uitvoerbaar (met behulp van de opdracht: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' op een Linux machine).
    4. Genereer bigWig bestanden uit de Wiggle bestanden, met behulp van het script wig2bw.txt (zie Supplemental Coding Files). Voer het door te kopiëren / plakken in bash.
    5. Voer de BigWig-bestanden in op de UCSC genoombrowser of Integrative Genomics Viewer (IGV) voor visualisatie.

6. RNA-seq-gegevensanalyse

  1. Voorbeeldgegevens invoeren in Deseq2
    1. Download en installeer Rstudio (versie 1.1.456) en R (versie 3.6).
    2. Installeer alle vereiste R-pakketten (zie Aanvullende coderingsbestanden).
      OPMERKING: Zie de bijgevoegde bestanden voor een gedetailleerd R-markdown-bestand met alle programmeercode en uitvoer: 'RNA_seq_kc_differentiation_wt.html' en 'RNA_seq_kc_differentiation_patient.html'. Hieronder vindt u een algemene beschrijving van alle stappen.
    3. Een tellingstabel genereren uit de readsPerGene.out.tab-bestanden.
    4. Schrijf een voorbeeldgegevensbestand met alle bestandsnamen, de dag van differentiatie en andere relevante voorbeeldgegevens. Zie 'sample_data_example.csv' in de aanvullende coderingsbestandenvoor een voorbeeldbestand.
    5. Gebruik de teltabel en voorbeeldgegevens om een Deseq220-object te genereren dat zowel de telbare als de voorbeeldgegevens bevat.
  2. Normalisatie van genexpressie, monsterafstand en PCA
    1. Normaliseer de teltabel in het object Deseq2 met deseq2 rld of vst normalisatie. Rld normalisatie heeft de voorkeur, maar met veel monsters, vst normalisatie is veel sneller.
    2. Plot monsterafstand op basis van de genormaliseerde leestellingsintensiteiten met behulp van de "dist" functie in R en vervolgens het uitvoeren van "hclust" clustering op basis van monsterafstand. Plot de heatmap zelf met behulp van het pheatmappakket.
    3. Een PCA-plot genereren van de genormaliseerde leestellingsintensiteiten met behulp van de plotPCA-functie van Deseq2.
      OPMERKING: PCA dient als een hulpmiddel in verkennende gegevensanalyse en kan worden gebruikt om afstand en verwantschap tussen verschillende monsters te visualiseren.
  3. Differentiële/zeer variabele genexpressieanalyse
    1. Bereken de differentiële genen met behulp van de Deseq2-resultaatfunctie. Gebruik echter zeer variabele genen bij het beoordelen van veranderingen in verschillende tijdpunten waarin pairwise vergelijkingen niet van toepassing zijn. In dit geval, extract de top 500 zeer variabele genen via het bestellen op de variantie tussen monsters uit verschillende tijdpunten met de rowVars functie.
      OPMERKING: In onze analyse werden voor de controlemonsters de top 500 zeer variabele genen (de genen met de hoogste standaardafwijking van hun genormaliseerde intensiteit over dagen van differentiatie) gebruikt voor verdere analyse. Echter, voor de zieke vs controle analyse differentieel uitgedrukt genen tussen ziekte en gezonde controles na verloop van tijd werden berekend door Deseq2 met behulp van een meervoudige testen gecorrigeerd p-waarde van 1 x 10-4 als een cutoff. Een andere mogelijke filterstap is het uitsluiten van differentiële genen die minder dan een bepaalde vouwveranderingssnede veranderen.
    2. Voer kmeans clustering uit op het differentiaal of zeer variabele genen om ze te clusteren door verschillende expressiepatronen.
    3. Visualiseer differentieel of zeer variabele genen in een heatmap met behulp van het pheatmappakket. De intensiteit uitgezet in de heatmap is de Deseq2 genormaliseerde intensiteit met de mediaan waarde afgetrokken.
  4. Gen Ontologie (GO) annotatieverrijkingsanalyse
    1. Genereer een lijst van uitgedrukte achtergrondgenen door alle genen met meer dan 10 tellingen in één enkel monster te nemen.
    2. Voer GO-analyse uit met behulp van online tools zoals GOrilla21. Gebruik de lijsten van de differentiaal/zeer variabele genen in clusters als "genlijst", en de achtergrondgenen als achtergrond voor vergelijking.
      OPMERKING: Meer geavanceerde R-gebruikers kunnen het pakketclusterProfiler22 gebruiken om de verrijkingsanalyse van go-term te automatiseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normale keratinocytendifferentiatie en RNA-seq-analyse
In dit experiment werden keratinocytenlijnen van vijf individuen gebruikt voor differentiatie en RNA-seq-analyses. Figuur 1 vat de experimentele procedure van differentiatie en RNA-seq-analyseresultaten samen. Een overzicht van in vitro differentiatieprocedures van normale keratinocyten en veranderingen in celmorfologie tijdens differentiatie wordt geïllustreerd in figuur 1A. Uit de analyse van de principiële componenten (PSO) bleek dat keratinocyten die differentiatie ondergaan, verbonden waren, maar verschillende algemene genexpressieprofielen hadden (figuur 1B). Zeer variabele genen werden geclusterd door kmeans om de dynamiek en patronen van genexpressie te visualiseren tijdens differentiatie(figuur 1C).

Elke cluster van genen werd vertegenwoordigd door de keratinocyten differentiatie kenmerken genen (bijvoorbeeld KRT5 voor proliferatie, KRT1 en KRT10 voor vroege en mid-differentiatie, en IVL / LOR / FLG voor late differentiatie). Genontologie (GO) annotatieanalyse van zeer variabele genclusters (Figuur 1C) toonde een duidelijk verschil in genfuncties van deze genclusters (bijvoorbeeld keratinisatie in de middenstadia van differentiatie; en epidermale celdifferentiatie, keratinocytendifferentiatie en peptide cross-linking in de late stadia; Figuur 1D). Eiwitexpressie van verschillende differentiatiemarkers werd gemeten door westerse blotting (figuur 1E).

P63 mutant keratinocyte differentiatie en RNA-seq analyse:
In het tweede experiment werden celmorfologie en genexpressieverschillen vergeleken tussen keratinocyten van gezonde controles en drie lijnen afkomstig van patiënten die p63-mutaties droegen (mutanten R204W, R279H en R304W). Figuur 2A toont een overzicht van differentiatieprocedures en veranderingen in celmorfologie. Mutant keratinocyten bleef vlak op het oppervlak van de schotel en niet overvol of overlappen de groei als controle keratinocyten op dag 7.

In de PCA-analyse volgden de controlecellijnen duidelijk een differentiatiepatroon, in vergelijking met figuur 1B. Het patroon van genexpressie van gemuteerde cellen tijdens differentiatie blijft echter grotendeels vergelijkbaar met dat van zich vermenigvuldigende/ongedifferentieerde cellen. Onder de drie mutantlijnen, differentiërende R279 monsters verplaatst langs PC1 en PC2 tot op zekere hoogte, wat aangeeft dat de differentiatie minder aangetast was, in vergelijking met R204W en R304W.

In de clusteringanalyse (figuur 2C)werden genen die zijn gesegreguleerd in controlecellen (cluster 1) gedeeltelijk gesegreguleerd in R204W en R279W, maar hun genexpressie werd niet drastisch veranderd in R304W. Deze genen spelen waarschijnlijk een rol in celproliferatie, zoals blijkt uit GO-annotatie(figuur 2D). In cluster 2 (figuur 2C)werden genen eerst geïnduceerd en vervolgens gesorgeerd in controlecellen. Deze genen zijn waarschijnlijk betrokken bij keratinocyten differentiatie, als epidermale differentiatie en keratinisatie functies waren sterk verrijkt voor deze cluster genen (Figuur 2D). Deze genen werden niet geïnduceerd in R204W en R304W, terwijl in R279H-cellen deze genen werden geïnduceerd, maar niet zo veel werden geregreguleerd als de controlecellen.

Genen in cluster 3 werden pas geïnduceerd aan het einde van differentiatie in controlecellen(figuur 2D). In overeenstemming hiermee kunnen deze genen een rol spelen in de buitenste laag van de opperhuid, omdat is aangetoond dat ze reageren op externe stimuli en ontstekingen(figuur 2D). Het expressiepatroon van deze genen veranderde niet veel in alle drie de gemuteerde cellijnen. De zichtbare verschillen in genexpressiepatronen tussen controle en gemuteerde cellen tonen aan dat gemuteerde cellen niet goed kunnen differentiëren in deze in vitro differentiatiemodellen.

Figure 1
Figuur 1: Keratinocytendifferentiatie en -analyse. (A) Overzicht van het keratinocytendifferentiatieprotocol en de celmorfologie. Schaalbalk = 100 μm. (B) Principecomponentanalyse van differentiërende controlekeratinocyten. (C) Heatmap van de top 500 zeer variabele genen tijdens keratinocyten differentiatie. Genen worden geclusterd in drie clusters met behulp van kmean clustering. Representatieve differentiatie marker genen voor elk gen cluster worden aangegeven aan de zijkant. (D) GO term verrijkingsanalyse van oververtegenwoordigde functies voor genen in de zeer variabele genclusters, in vergelijking met een achtergrond van alle uitgedrukte genen (tellingen van >10). GOrilla werd gebruikt voor de verrijkingstest. (E) Westerse vlek van keratinocyten differentiatie markers tijdens differentiatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vergelijking van de controle en p63 mutant keratinocyten. (A) Overzicht van het keratinocytendifferentiatieprotocol en de celmorfologie van de controle en p63 mutant keratinocyten. Schaal = 100 μm. (B) Principe componentanalyse van differentiërende controle en patiënt (R204W, R279H & R304W) keratinocyten. (C) Heatmap van differentiële genen tussen controle en gemuteerde keratinocyten. Genen worden geclusterd in drie clusters met behulp van kmean clustering. Representatieve differentiatiemarkergenen voor elk gencluster worden aangegeven. (D) GO term verrijkingsanalyse van oververtegenwoordigde functies voor genen in de zeer variabele genclusters, in vergelijking met een achtergrond van alle uitgedrukte genen (tellingen van >10). GOrilla werd gebruikt voor de verrijkingstest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

KGM-component Voorraad Gemiddeld Volume
Kbm 500 mL
Pen/Strep 100.000 eenheden/mL 100 eenheden/mL 5 mL
BPE (BPE) ~13 mg/mL 0.4% 2 mL
Ethanolamine 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoshoethanolamine 0,1 M 0,1 mM 500 μL
Hydrocortison 0,5 mg/mL 0,5 μg/mL 500 μL
Insuline 5 mg/mL 5 μg/mL 500 μL
Efg 10 μg/mL 10 ng/mL 500 μL

Tabel 1. KGM-pro medium supplementen.

KGM-component Voorraad Gemiddeld Volume
Kbm 500 mL
Pen/Strep 100.000 eenheden/mL 100 eenheden/mL 5 mL
Ethanolamine 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoshoethanolamine 0,1 M 0,1 mM 500 μL

Tabel 2. KGM-diff medium supplementen.

Aanvullende coderingsbestanden: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html. Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; en Wig2bw.txt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit werk beschrijft een methode voor het induceren van menselijke keratinocyten differentiatie en de daaropvolgende karakterisering met behulp van RNA-seq analyses. In de huidige literatuur gebruiken veel studies over menselijke keratinocytendifferentiatie twee andere methoden, met een hoge calciumconcentratie of met serum als methoden om differentiatie2,3,23te induceren . Een eerder rapport zorgvuldig vergeleken deze drie verschillende methoden3 en toonde aan dat deze methoden kunnen vertegenwoordigen verschillende biologie van keratinocyten differentiatie. In ditzelfde rapport toonden auteurs aan dat gedifferentieerde cellen die door serum worden geïnduceerd een hoog prolifererend potentieel hebben en genen zoals KRT16 en SKALP/ PI3 uitdrukken die worden uitgedrukt in de psoriasishuid, maar niet in normale opperhuid, en dat daarom serum-geïnduceerde differentiatiemodel kan worden gebruikt om psoriasis te bestuderen. De methode van contactremming plus uitsluiting van groeifactor kan daarentegen KRT1 en KRT10 veroorzaken, die normaal gesproken worden uitgedrukt in de opperhuid en lijken op normale keratinocytendifferentiatie. Hoge calciuminductie geeft aanleiding tot een genexpressieprofiel dat zich tussen seruminductie en contactremming bevindt, als de minst specifieke methode. De analyses aan de hand van RNA-seq-analyses tijdens differentiatie bevestigden dat de methode van contactremming plus uitsluiting van groeifactoren resulteert in gedifferentieerde keratinocyten met vergelijkbare genexpressieprofielen als die welke worden verwacht voor epidermale differentiatie (bijvoorbeeld KRT5 in zich vermenigvuldigende cellen, KRT1 en KRT10 bij vroege differentiatieinductie, en LOR en FLG bij late differentiatie; Figuur 1C).

Deze bevindingen tonen aan dat deze differentiatietechniek een gebruiksvriendelijke en betrouwbare methode is om keratinocytendifferentiatie te bestuderen. Bovendien blijkt uit dit werk op keratinocyten afgeleid van p63 mutant keratinocyten ook dat de methode kan worden gebruikt om de aangetaste keratinocytendifferentiatie onder zieke omstandigheden te bestuderen. In deze in vitro differentiatie benadering wordt KGM gekocht van Lonza gebruikt, omdat dit medium consistente resultaten oplevert. In principe is ook andere epidermale medium met vergelijkbare samenstelling, zoals keratinocyten serumvrij medium (KSFM) van Thermo Fisher Scientific, waarschijnlijk geschikt, hoewel dit moet worden getest.

Opgemerkt moet worden dat deze methode een aantal beperkingen heeft. Omdat het is gebaseerd op contactremming, is de samenvloeiing van celdichtheid vereist. In onze experimenten met p63 mutant keratinocyten is een hogere initiële zaaidichtheid nodig geweest om ervoor te zorgen dat cellen samenvloeiing bereiken. Bovendien, wanneer cellen niet groeien met dezelfde snelheid, differentiatie soms moet worden geïnduceerd op verschillende dagen. Met deze overwegingen moet rekening worden gehouden bij het opzetten van experimenten. In experimentele omgevingen waar cellen tegelijkertijd moeten worden geïnduceerd, moeten andere differentiatiemethoden worden overwogen, waaronder toevoeging van serum, hoge concentraties calcium en remming van epidermale groeifactorreceptoren2,3. Niettemin hebben alle in vitro differentiatiemethoden voors en tegens, omdat ze waarschijnlijk gedeeltelijke differentiatieinductiesignalen vertegenwoordigen die aanwezig zijn tijdens in vivo huidontwikkeling2.

Een uitgebreide moleculaire analyse die deze verschillende methoden vergelijkt zal zeer informatief zijn en de keuze van de methode die het meest geschikt is voor verschillende studies over biologische processen instrueren. Daarnaast wordt het valideren van veranderingen gemeten op transcriptomisch niveau sterk aangeraden, bijvoorbeeld via westerse blotting of proteomische analyses. Bovendien moeten in vitro-gegevens met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt en moeten conclusies van deze modellen in vivo worden gevalideerd, bij voorkeur in de ontwikkeling van de menselijke huid.

Basisprincipes van RNA-extractie en RNA-seq-bibliotheekvoorbereiding zijn eerder goed beschreven24,25,26,27,28. In dit protocol zijn de RNA-extractie- en RNA-seq-bibliotheekvoorbereidingsprocedures gebaseerd op workflows van commercieel beschikbare kits. In principe mogen verschillende methoden voor RNA-extractie geen grote invloed hebben op RNA-seq-analyses als de RNA-kwaliteit goed is. In gevallen waarin de RNA-kwaliteit slecht is (d.w.z. wanneer RNA formaline-vaste paraffine-ingebedde weefsels wordt geëxtraheerd), kan RNA-seq nog steeds worden uitgevoerd; de RNA-fragmentatiestap moet echter worden aangepast. De RNA-seq bibliotheek voorbereiding omvat ribosomale RNA (rRNA) verwijdering aan de cDNA bibliotheek constructie voor sequencing. De belangrijkste procedures kunnen worden uitgevoerd met behulp van verschillende kits, of met behulp van individuele enzymen en zelfgemaakte buffers29,30,31,32. Opgemerkt moet worden dat, als RNA-seq-analyse wordt uitgevoerd met behulp van verschillende basisprincipes (bijvoorbeeld ribosomale RNA-uitputting of polyA mRNA-verrijking door hybridisatie naar polyT oligo's), de uitkomst van RNA-seq-analyses kan verschillen. Bovendien maakt het protocol gebruik van ribosomale RNA verwijdering door hybridisatie van DNA oligo's naar mens, muis en rat rRNA. Bij het werken met verschillende soorten moet een alternatieve oligoset worden gebruikt.

Sequencing van de gegenereerde bibliotheek kan worden uitgevoerd aan beide uiteinden van de fragmenten (gekoppeld einde) of aan het ene uiteinde van het fragment (enkel uiteinde). In het algemeen, gepaarde eind sequencing sterk verbetert mappability en biedt meer informatie over transcript varianten. Echter, voor een relatief eenvoudige differentiële genanalyse zoals hier beschreven, single end sequencing kan ook voldoende informatie opleveren.

Voor de belangrijke stap van data-analyse wordt een relatief eenvoudige methode voor kwaliteitscontrole van de fastq-bestanden beschreven, gevolgd door het in kaart brengen van het genoom. Hoewel de meegeleverde bash code geen ideale schaalbaarheid heeft, heeft het het voordeel van transparantie. De keuze van de software, welke stappen het uitvoert, en versie van het genoom gebruikt tijdens de voorbewerking van gegevens zijn allemaal niet-triviale stappen die goed moeten worden gedocumenteerd, wat essentieel is voor de herhaalbaarheid.

Voor meer gevorderde gebruikers kan een geautomatiseerde pijplijn worden gebruikt om de stappen uit te voeren van fastQ-bestandskwaliteitscontrole, adaptertrimming en mapping, bijvoorbeeld de ARMOR snakemake workflow33 of de 'RNA-seq' Snakemake workflow van het van Heeringen lab34. Deze volledig geautomatiseerde pijpleidingen zijn echter minder transparant en moeilijker te wijzigen. Bij het gebruik van deze tools is het van vitaal belang om de functies binnen deze geautomatiseerde pijplijnen te begrijpen. Ten slotte bevat het protocol RNA-seq-gegevensanalyse met de nadruk op variabele genexpressie in de loop van de tijd. Variabele genexpressie heeft de voorkeur boven paarsdifferentieel testen wanneer je kijkt naar processen met meerdere tijdpunten, zoals differentiatie. Tot slot introduceert deze analysepijplijn relevante tools voor bio-informatica-analyse van RNAseq-gegevens. Het bevat hulpmiddelen die keratinocytendifferentiatie grondig kunnen beoordelen, zowel onder normale als zieke omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door De Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud Universiteit fellowship (H.Z.); en Chinese Scholarship Council grant 201406330059 (J.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).
  13. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019).
  14. Doyle, K. aM. Protocols and applications guide. , Promega Corporation. Madison. (1996).
  15. Roche. Hyperprep Kit. , Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019).
  16. Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019).
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. Soneson, C. ARMOR. , Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019).
  34. Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019).

Tags

Genetica human primary keratinocyten 2D dompel cultuur in vitro differentiatie RNA-seq bioinformatica analyse p63
Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues,… More

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter