Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Retinal vaskulær reaktivitet som vurdert av optisk coherence tomografi angiografi

Published: March 26, 2020 doi: 10.3791/60948
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, USC Roski Eye Institute, 2USC Ginsberg Institute for Biomedical Therapeutics, Keck School of Medicine of the University of Southern California

Summary

Denne artikkelen beskriver en metode for måling av retinal vaskulatur reaktivitet in vivo med menneskelige personer ved hjelp av en gass puste provokasjon teknikk for å levere vasoaktive stimuli mens du anskaffenetthinne bilder.

Abstract

Den vaskulære tilførselen til netthinnen har vist seg å dynamisk tilpasse seg gjennom vasokonstriksjon og vasodilatasjon for å imøtekomme de metabolske kravene til netthinnen. Denne prosessen, referert til som retinal vaskulær reaktivitet (RVR), medieres av nevrovaskulær kobling, som er svekket veldig tidlig i retinal vaskulære sykdommer som diabetisk retinopati. Derfor kan en klinisk mulig metode for å vurdere vaskulær funksjon være av betydelig interesse for både forskning og kliniske miljøer. Nylig, in vivo imaging av retinal vaskulatur på kapillærnivå har blitt gjort mulig ved FDA godkjenning av optisk koherens tomografi angiografi (OCTA), en ikke-invasiv, minimal risiko og dyeless angiografi metode med kapillær nivå oppløsning. Samtidig har fysiologiske og patologiske forandringer i RVR blitt vist av flere etterforskere. Metoden som vises i dette manuskriptet er utformet for å undersøke RVR ved hjelp av OCTA uten behov for endringer i kliniske bildeprosedyrer eller enhet. Det demonstrerer sanntidsavbildning av netthinnen og retinal vaskulaturen under eksponering for hyperkapnisk eller hyperoktiske forhold. Eksamen utføres enkelt med to personer på under 30 minutter med minimalt ubehag eller risiko. Denne metoden kan tilpasses andre oftalmiske bildeenheter, og applikasjonene kan variere avhengig av sammensetningen av gassblandingen og pasientpopulasjonen. En styrke av denne metoden er at det tillater en undersøkelse av retinal vaskulær funksjon på kapillærnivå hos mennesker in vivo. Begrensninger av denne metoden er i stor grad de av OCTA og andre retinal imaging metoder inkludert bildeartefakter og et begrenset dynamisk område. Resultatene fra metoden er OCT- og OCTA-bilder av netthinnen. Disse bildene er mottagelige for enhver analyse som er mulig på kommersielt tilgjengelige OCT- eller OCTA-enheter. Den generelle metoden kan imidlertid tilpasses enhver form for oftalmisk avbildning.

Introduction

Den metabolske etterspørselen av netthinnen er avhengig av en tilstrekkelig og konstant tilførsel av oksygen gitt av et godt regulert system av arterioler, kapillærer og venules1. Flere studier har vist at funksjonen til større kaliber menneskelige retinal fartøy kan vurderes in vivo med ulike fysiologiske2,3,4,5 og farmakologisk6,7 stimuli. I tillegg er unormal funksjon av dette vaskulære systemet vanlig i retinal vaskulære sykdommer som diabetisk retinopati der retinal vaskulær reaktivitet (RVR) har vist seg å være fortenuated selv i sine tidligste stadier8,9 gjennom både gass provokasjon9 og flimrende lyseksperimenter5,10,11. Retinal vaskulære risikofaktorer som røyking har også vært korrelert med nedsatt RVR12 og retinal blodstrøm13. Disse funnene er viktige siden de kliniske symptomene på retinal vaskulær sykdom oppstår relativt sent i sykdomsprosessen og bevist tidlig kliniske markører for sykdom mangler14. Dermed kan vurdering av RVR gi nyttige tiltak for vaskulær integritet for tidlig vurdering av abnormiteter som kan initiere eller forverre retinale degenerative sykdommer.

Tidligere RVR eksperimenter har vanligvis stolt på enheter som en laser blodstrømmeter 9 eller fundus kameraer utstyrt med spesielle filtre15 for retinal bilde oppkjøp. Disse teknologiene er imidlertid optimalisert for større diameter fartøy som arterioler16 og venules15, som ikke er der gass, mikronæringsstoff og molekylær utveksling oppstår. En nyere studie var i stand til å kvantifisere RVR av kapillærer ved hjelp av adaptiv optikk imaging17, men til tross for forbedret romlig oppløsning, disse bildene har en mindre feltstørrelse og er ikke FDA godkjent for klinisk bruk18.

Den nylige bruk av optisk sammenheng tomografi angiografi (OCTA) har gitt en FDA godkjent, ikke-invasiv og fargeløs angiografisk metode for å vurdere kapillær nivå endringer i menneskelige pasienter og forsøkspersoner i vivo. OCTA er allment akseptert i klinisk praksis som et effektivt verktøy for å vurdere svekkelse i kapillær perfusjon i retinal vaskulære sykdommer som diabetisk retinopati19, retinal venøse okklusjoner20, vaskulitt21 og mange andre22. OCTA gir derfor en utmerket mulighet for evaluering av endringer i kapillærnivå, som kan ha betydelig romlig og temporal heterogenitet23 samt patologiske endringer, i en klinisk setting. Vår gruppe viste nylig at OCTA kan brukes til å kvantifisere responsen til retinale kar på kapillærnivå2 til fysiologiske endringer i inspirert oksygen, som er en retinal vasokonstriktiv stimulans16,,24og karbondioksid, som er en retinal vasodilattory stimulus3,5.

Målet med denne artikkelen er å beskrive en protokoll som vil tillate leseren å vurdere retinal vaskulær reaktivitet av de mindre arterioler og kapillær seng ved hjelp av OCTA. Metodene er tilpasset fra de som presenteres i Lu et al.25 som beskrev målingen av cerebrovaskulær reaktivitet med magnetisk resonansavbildning. Selv om dagens metoder ble utviklet og brukt under OCTA imaging2, gjelder de for andre retinal bildeenheter med relativt enkle og åpenbare modifikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble godkjent av University of Southern California Institutional Review Board og overholdt tenets av erklæringen av Helsinki.

1. Oppsett av gassikke-repustende apparat

Figure 1
Figur 1: Diagram over ikke-repustende apparat. Hele oppsettet er delt inn i tre separate enheter i henhold til deres funksjon og frekvensen som de behandles med uavhengig. Disse inkluderer: Air-Control Unit, Non-rebreathing Unit og Subject / Imaging Device Unit Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

  1. Montering av apparater
    1. Koble Douglas-posen (Figur 1, #1) til treveisventilen (#3) ved en selektiv innløpsport via 35 mm indre diameter (#2; se Materialbord) med adapter (#2*). Denne kombinasjonen kalles "Luftkontrollenhet" som vist i figur 1.
    2. Koble den toveis ikke-repustende ventilen (#6) til albueleddkontakten (#7) ved munnporten til ikke-repustende ventil. Form tilkoblingen ved hjelp av et gummirør (#5) utstyrt med en adapter (#4).
    3. Koble albueleddet til gassleveringsslangen (#8). Dette oppsettet, inkludert ikke-rebreathing ventil (#6), in-house rør (#5), adaptere (#4), albueledd (#7), og gass levering rør (#8) vil bli kalt "Ikke-rebreathing Unit".
      MERK: Minimer mengden dødt rom mellom motivets munn og membranen til den toveis ikke-repustende ventilen (#6).
    4. Koble luftkontrollenheten ved utløpsporten på den treveis ventilen (#3) til pusteenheten uten omånding ved innløpsporten på den toveis ikke-repustende ventilen (#6). Gjør tilkoblingen ved hjelp av ekstra gummislange (#5) og adaptere (#4) som de som er beskrevet tidligere som gjør at brikkene kan settes inn i hverandre.
    5. Forsegle alle løse tilkoblinger ved å pakke leddene med tetningstape for å sikre en hermetisk passform.
    6. Koble gassleveringsslangen (#8) i den åpne enden til et munnstykke (#9) som vist i enheten for bildeenhet for bildeenhet 1.
      MERK: Dette trinnet (1.1.6) kan utsettes til fagtestingen er klar til å begynne (trinn 3.5).
  2. Tilberedning av luftkontrollenheten for ikke-rebreathing av gass
    1. Isoler luftkontrollenheten ved å koble den fra eventuelle in-house rør (#5) eller adaptere (#4) hvis den ikke allerede er separert.
    2. Sørg for at Douglas-posen (#1) er tom eller tøm Douglas-posen (#1) av hvilken som helst luft ved systematisk å rulle opp posen fra den distale enden mot posens innløpsport med treveisventilen (#3) satt til Konfigurasjon 1 som vist i figur 1.
    3. Fyll Douglas posen (#1) med riktig gassblanding.
      1. Hvis det bare er tiltenkt at ikke-repustende romluft er beregnet, setter du treveisventilen til Konfigurasjon 2 (vist i figur 1) og fyller ikke Douglas-posen (#1). Ellers fortsette med trinnene som utgjør trinn 1.2.3.
      2. Koble luftkontrollenheten (vist i figur 1) ved utløpsporten på treveisventilen (#3) til en gassflaske (som inneholder ønsket luftblanding) ved hjelp av de aktuelle adapterne og slangen. Bruk en mansjettadapter til å montere et 1/8" gassfyllingsrør til den ytre diameteren på treveisventilen (#3).
      3. Sett treveis ventilenheten til Konfigurasjon 1 (som vist i figur 1) for å la den tiltenkte gassen strømme fra lagringssylinderen inn i Douglas-posen (#1). Åpne gassflasken.
      4. Når Douglas-posen (#1) er fylt til det tiltenkte volumet (vanligvis halvfylt), lukker du gassflaskeuttaket og setter treveisventilen til Configuration 2, som isolerer gassen i Douglas-posen (#1). Koble luftkontrollenheten fra alle rør som brukes til å fylle Douglas-posen (#1).

2. Klargjøre emnet for bildebehandling

  1. Etter at emnet samtykker til å delta i studien, sitte gjenstand bak OCTA bildeenhet. Forklar testprosedyrene for motivet.
  2. Bekreft fagets medisinske historie for å sikre at faget ikke har noen eksisterende medisinske tilstander som øker risikoen for å delta i studien.
    MERK: Eksisterende kardiovaskulære eller lungesykdommer er risikofaktorer som forsøkspersoner kan utelukkes fra å delta. Det er viktig at motivet forstår at de kan stoppe prosedyren når som helst av en eller annen grunn, for eksempel å føle seg ør eller noe ekstra uventet ubehag.
  3. Bestem at øyet skal vurderes i henhold til testprotokollen. Ett øye kan bare avbildes for å begrense testtiden og minimere de potensielle ubehagene fra gassen som ikke puster på nytt.
  4. Vurder øyeutvidelse hvis motivet har en elevstørrelse på ca. 2,5 mm eller mindre. Selv om utvidelse ikke er obligatorisk, øker det sjansene for å skaffe seg bilder av god kvalitet. For å utvide, innpode en dråpe hver av 0,5% proparakain hydroklorid oftalmisk løsning, 1% tropicamid oftalmisk løsning og 2,5% fenylefrin hydroklorid oftalmisk løsning. Full utvidelse bør skje innen 10–15 min.

3. Gass provokasjon eksperiment og bilde oppkjøp

  1. Opprett en profil for pasienten i OCTA-maskinen.
  2. Bruk hansker.
  3. Tørk av OCTA hodet og hakelen med en spritserviett for å desinfisere oppsettet.
  4. Frigjør munnstykket (#9) fra den sterile emballasjen.
    MERK: Avstå fra å berøre munnstykket så mye som mulig, da denne komponenten gjør direkte kontakt med slimslimslimslimslimhinnen i munnen på motivet
  5. Koble munnstykket (#9) til gassleveringsslangen (#8)
  6. Plasser et pulsoksimeter på forsøkspersonenes finger og begynn å overvåke oksygenmetningsnivåer og puls.
    MERK: Når motivet begynner å puste ønsket luftblanding, bør pulsoksimeteret kontinuerlig overvåkes av sensor. Hvis oksygenmetningen av motivet faller under 94 %, bør eksperimentet stoppes, som en sikkerhetsforanstaltning, og motivet som observeres til de går tilbake til baseline.
  7. Juster høyden på OCTA-oppsettet slik at motivet enkelt kan hvile haken på hakestøtten (#11) uten å utvide nakken for mye.
  8. Slynge gassleveringsslangen (#8) med munnstykke (#9) feste gjennom hodet og hakestøtten med munnstykket (#9) vendt mot pasienten. Ha slangen slynge gjennom maskinen oppposite siden av øyet som motivet har avbildet.
  9. Sett munnstykket inn i pasientens munn. Oppmuntre faget til å øve på å puste gjennom det ikke-repustende oppsettet for å skape kjennskap til apparatet. Sørg for at motivet tar dype pust er for å lette gassutvekslingen.
  10. Plasser neseklemmen (#10) på motivet for å sikre at de puster gjennom munnstykket.
  11. Hold treveisventilen på Configuration 2 eller endre den til Configuration 1 avhengig av om bilder blir anskaffet for eksponering for henholdsvis romluft eller en bestemt gassblanding. For fremtidig referanse, legg merke til tiden som starten på gassinnånding.
  12. Få motivet til å plassere haken på høyre eller venstre del av hakestøtten (#11) i henhold til øyet som er valgt for bildebehandling.
  13. Sørg for at de beveger hodet fremover til pannen er i fast kontakt med nakkestøtten (#11).
  14. Fang octa-skanningen av interesse som bestemmes av testprotokollen. I denne studien ble tre 3 mm x 3 mm bilder sentrert på fovea fanget etter 1 min gasspusting.
    1. Få motivet til å holde hodet vendt fremover og fortsatt mens du fikserer på målet i midten av deres syn
    2. I det levende bildet sett i irisvisningen, sentrer skanningen.
    3. Ta iris i fokus ved å flytte hakestøtten inn eller ut ved hjelp av venstre høyre piler.
    4. Kontroller at fovealdip er sentrert i OCT-skanningen, som skal skje som standard.
    5. Ta et bilde. Skanning vil vanligvis vare i flere sekunder på en OCTA-maskin.
    6. Vis OCTA-bildet etter at skanningen er fullført og sørg for at det er av tilstrekkelig kvalitet. Signalstyrken bør være en 7 eller bedre på en 10-punkts skala levert av OCTA-produsenten.
    7. Velg lagre eller skann øyet på nytt.
    8. Gjenta trinn 3.14.1–3.14.7 for så mange skanninger er ønsket.
    9. La motivet lene seg tilbake fra maskinen. Fjern neseklemmen (#10) og munnstykket (#9) når det ikke er behov for flere skanninger av øyet med denne gassblandingen.
  15. Tillat forsøkspersoner en 2 min pause før du starter CO2 gass provokasjon eksperimenter.
  16. Fyll Douglas posen med den første ønskede luftblandingen (bestående av 5% CO2,21% oksygen og 74% nitrogen) som spesifisert i trinn 1.2. Treveisventilen vil være i konfigurasjon 2 etter dette trinnet.
  17. Komplett oppsett av gassapparater som ikke puster opp igjen ved å koble luftkontrollenheten til luftvernenheten, som vist i figur 1 og beskrevet i trinn 1.1.4. Pass på at alle leddene er lufttette med tetningstape.
  18. Gjenta trinn 3.9–3.14, men nå setter du treveisventilen til Konfigurasjon 1 når den rettes i trinn 3.11.
  19. Gi forsøkspersonene en 10 min pause etter CO2 gassprovokasjon for å tillate en retur til baseline.
  20. Mens motivet er på pause, fyll Douglas-posen med 100% O2 i henhold til trinn 1.2.
  21. Gjenta trinn 3.17-3.18 for å utføre eksperimentet under 100% O2 gass provokasjon forhold.

4. Eksperimentell opprydding

  1. Kast engangselementene i oppsettet: motivets munnstykke (#9) og neseklips (#10).
  2. Rengjør hode- og hakestøtten (#11) med en spritserviett. Tørk av emnestolen, OCTA-bordet og OCTA-håndtakene med desinfeksjonsmiddelserviett for å fjerne feilspytt.
  3. Koble oppsettet til basiskomponentene – luftkontrollenheten og pusteenheten uten omånding – ved treveisventilen (#3).
  4. Siden ingen luft utåndet fra motivet skulle ha nådd elementene i luftkontrollenheten, tøm Douglas-posen i henhold til trinn 1.2.2 og plasser på et sted for fremtidig gjenfinning. Koble clean-bor røret (#2) med adapter (#2 *) og treveis ventil (#3) fra Douglas posen hvis ønskelig for enklere oppbevaring. Dette fullfører oppryddingen av luftkontrollenheten.
  5. Fjern gasstilførselsslangen (#8) fra pusteenheten uten omånding ved å koble den fra albueleddet (#7). Koble de interne gummislangene (#5) og slangeadapterne (#4), fra den toveis ikke-repustende ventilen (#6). Gjør det samme fra albueleddet (#7) ved å fjerne tetningsbåndet og løsne delene ved å trekke dem fra hverandre.
    MERK: Mer omfattende rengjøring av toveis ikke-rebreathing ventil kan lettes ved å demontere den for å fjerne de interne membraner for ekstra forsiktighet.
  6. Forbered et desinfeksjonsmiddel bad for opprydding av gjenbrukbare komponenter
    1. Fyll en beholder som er stor nok til å senke gassleveringsslangen (#8) med et riktig fortynnet og godt blandet vaskemiddeldesinfeksjonsmiddel. I dette tilfellet fortynnvaskemiddelet med vann til et forhold på 1:6425.
  7. Bløtlegg gassleveringsslangen (#8), toveis ikke-rebreathingsventil (#6), albueledd (#7), gummislange internt (#5) og slangeadaptere (#4) i det tilberedte desinfeksjonsbadet i minst 10 min.
  8. Fjern alle deler etter at badet er over og skyll dem grundig med vann.
  9. Legg dem på et papirhåndkle på en ren benkeplate for å bli lufttørket.
  10. Når lufttørkingen er fullført, må du kaste papirhåndkleet og plassere alle komponentene for oppbevaring.

5. OCTA dataeksport og analyse

  1. EKSPORT AV OCTA-data
    1. Eksporter OCTA-data ved å sette inn en flyttbar medieenhet som er du velger i OCTA-datamaskinen. Finn emnet og skanning av interesse.
    2. Velg Eksporter for å opprette en zip-mappe som inneholder emnet for interessedata i et BMP-format på den flyttbare medieenheten.
  2. OCTA dataanalyse
    1. Organiser OCTA-dataene på en laboratoriedatamaskin med muligheten til å utføre ytterligere bildeanalyse og behandling.
    2. Bruk et egendefinert skript til å undertrykke støy med en global terskelteknikk og utføre ekstra funksjonsekstraksjon. Binarize og skeletonize OCTA bilder.
    3. På de postbehandlede bildene beregner du fartøyets skjeletttetthet (VSD)19,26, et dimensjonsløst mål på den totale lineære lengden på fartøy ene i et bilde beregnet av følgende ligning utført på et binarized skjelettbilde av OCTA:
      Equation 1
      hvor jeg og j refererer til pikselkoordinaten (i,j), L(i,j) refererer til hvite piksler som representerer dekorrelasjon, X(i,j) refererer til alle piksler, og n refererer til dimensjonene på pikselmatrisen, som kan antas å være n x n piksler19,26. Nevneren for denne ligningen representerer det totale antallet piksler som beregnes som skrevet fra det skjelettiserte bildet, men kan betraktes som å representere det fysiske området av hele bildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utgangen fra dette eksperimentet består av de manuelle avlesningene hentet fra pulsoksimeteret, timingen som er angitt for gasseksponering eller OCTA-skanning og de rå OCTA-bildedataene. Et OCTA-bilde består av OCT B-skanninger og dekorrelasjonssignalet som er knyttet til hver B-skanning. Dataparametrene er gitt av spesifikasjonene til enheten. En feid kilde laser plattform OCTA maskin med en sentral bølgelengde på 1040-1060 nm ble brukt. Bildene gir en tverrgående oppløsning på 20 μm og optisk aksial oppløsning på 6,3 μm. Oftest presenteres OCTA-dataene i et 2D-enface-format som det har blitt vist i representanten Figur 2. Det finnes mange beregninger for å kvantifisere disse dataene på en måte som muliggjør sammenligninger mellom emner og mellom ulike forhold. En representativ beregning, fartøyskjeletttetthet (VSD), vises sammen med full retinal angiogram i figur 2. Etterhvert som kapillærene vasokonstrikt og vasodilaterer som svar på gasseksponeringen, endres kapillærtettheten også. Hypercapnic forhold forventes å resultere i en økning i VSD og hyperoktiske forhold forventes å resultere i en reduksjon i VSD sammenlignet med romluftforhold.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater av fartøyets skjeletttetthet (VSD) i hyperoktiske, romluft og hyperkapnisk tilstand. Denne grafikken viser 3 mm x 3 mm OCTA angiograms og fartøytetthetsfunn av et sunt 76 år gammelt kvinnelig emne. Rad 1 viser en enkelt representativ horisontal OCT B-skanning gjennom fovea med dekorrelasjonssignal over retinal pigmentepitelrepresentert av rødt for hver av gasspusteprovokasjonsforholdene - henholdsvis 100% O2, romluft og 5% CO2. Rad 2 består av et enkelt OCTA-ansikt bilde konstruert av 256 OCTA B-skanninger, hvorav den ene er vist på rad 1. enface Rad 3 består av de samme OCTA-bildene i rad 2 etter behandling der fartøyene ble binarized og skeletonized. Rad 4 består av et varmekart som viser VSD beregnet lokalt fra bildene i rad 3. Vær oppmerksom på at det totale VSD og det relative antallet lokale VSD-aktiveringspunkter øker etter hvert som man utvikler seg i kolonnene fra venstre til høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodikken som nettopp er beskrevet er den komplette protokollen for et gasspusteprovokasjonseksperiment som gjør det mulig å måle et motivs RVR i et kontrollert miljø på bestemte tidspunkter uten endringer i OCTA-bildeenheten og minimalt ubehag eller risiko for motivet. Dette oppsettet er beskrevet på en måte som gjør det mulig for enkle modifikasjoner for å passe til forskernes behov. Det kan romme ekstra rør for å passe forskjellige klinikkrom og visse elementer som in-house rør eller albueledd kan utelates eller erstattes med andre komponenter. Figur 1 viser hvordan de viktigste delene av oppsettet – luftkontrollenheten, enheten som ikke puster om luftveiene og enheten for underbildeenhet – grensesnitt med hverandre i én enkel tilkobling. Gassblandinger kan enkelt kontrolleres ved hjelp av Douglas-posen som reservoar. I tillegg kan supplerende skjermer legges til flere punkter i oppsettet. For eksempel inneholder albueleddet en valgfri prøvetakingsport som kan brukes til å måle gassene i motivets utånding som slutttidevann CO2 for mer nøyaktig karakterisering av tilstanden til motivets pust. Styrken til dette ikke-repustende apparatet er i sin tilpasningsevne til både klinikkforhold og forskerkrav. Selv om OCTA-avbildning brukes, kan andre bildemodaliteter tenkes å implementeres med dette gassoppsettet.

Rekkefølgen på eksponering for gasser under testing kan være viktig for ikke å forutse reaktivitetstiltakene. Studier av Tayyari et al.24 har antydet at en vasokonstriktiv tilstand av retinal fartøy vedvarte etter avslutningen av en hyperoktisk gassutfordring og kan påvirke hyperkapnisk RVR-vurdering. Andre har imidlertid vist retinal fartøy oksygenering27 og retinal fartøy diameter16 begge tilbake til baseline innen 2,5 minutter etter opphør av hyperoktisk pusting. Varigheten av gassprovokasjonen er også viktig. Tidligere arbeid har vist at vasokonstrikjon er målbar etter 1 min hyperoktisk eksponering, og at nesten all vasokonstrikjon har skjedd etter 4–5 min innsettende. Fartøyets diameter vil da forbli stabil med oksygeneksponering i over minst 20 min28. Ved hyperkapnisk gassprovokasjon ble toppeffekter på retinal arterielle og venøse kardiametere observert etter 3 min eksponering for 5% karbondioksidforhold4. Metoden som foreslås er denne studien begynner avbildning etter 1 min gass ikke-rebreathing fordi effekten av hyperkapni på cerebral vaskulær reaktivitet har vist seg å være tilsvarende ved 1 og 4 min, og dermed redusere tiden som er nødvendig for bildebehandling og pasientubehag betydelig29.

Ved å bruke et munnstykke med en neseklips, kan dette oppsettet forbedres ved hjelp av en gassmaske. Tidligere studier indusere hyperoktiske forhold ved hjelp av et munnstykke bemerket en gjennomsnittlig økning i blod oksygenkonsentrasjon en retinal arterioler på 2%15 sammenlignet med en 5% økning30 når du bruker en maske. Men ved å legge til et neseklips, bør denne metoden redusere potensialet for forsøkspersoner til å inspirere enhver mengde luft gjennom nesen som kan ha skjedd i denne forrige studien. Potensialet for feil i oppsettet må balanseres med pasientens komfort og de ekstra komplikasjonene ved å bruke en ansiktsmaske mens du bruker et umodifisert OCTA-system. Disse inkluderer å gjøre plass til masken på OCTA31 og potensialet for gassutveksling og blanding i det store rommet okkupert av masken selv32. En bekymring angående munnstykket oppsettet er potensialet for sammensatte vasokonstrikive effekter på RVR på grunn av endringer i delvis trykk av CO2 (PCO2) under induksjon av hyperoksi33. Pusteapparatet kan endres for å kontrollere denne forvirrende effekten ved å opprettholde et konstant endetidevannspartitrykk av karbondioksid med en sekvensiell rebreathingskrets33,34.

Under testingen kan pasientene føle seg kortpustet når de puster gjennom rørkretsen, selv om de oksygenerer godt. Denne følelsen skyldes potensielt økt motstand mot gassstrømmen når du puster gjennom rør. Flere tiltak kan tas for å sikre at motivet ikke blir forstyrret eller skremt. For det første er det viktig å minimere lengden på dødt rom mellom motivets munn og den toveis ikke-repustende ventilen for å minimere repusting av gass. Selv med et svært kort segment kan forsøkspersonene fortsatt "føle" som å puste er vanskeligere. Derfor er det viktig å få motivet til å puste gjennom gassikke-repustende apparatet før initiering av datainnsamling for å gjøre motivet kjent med oppsettet. Sensor bør minne motivet om å puste sakte og dypt, holde et øye med pulsoksidatikken og informere emnet om sine funn for trygghet. Sørg også for at motivet kan sitte komfortabelt og hvile hodet lett på OCTA-nakkestøtten mens munnstykket er satt inn. Dette innebærer å dirigere munnstykket røret gjennom og rundt OCTA hakestøtte slik at motivet ikke trenger bite ned med kraft for å holde den i munnen. Minn emnet på å opprettholde blikket på fikseringsmålet og begrense handlinger som resulterer i øye- eller hodebevegelse, inkludert å snakke, da disse kan introdusere bevegelsesartefakter i OCTA-skanningene. Faget bør oppfordres til å trekke seg fra eksperimentet hvis ubehaget fra å delta i studien går utover det minste minimum.

Hyperkapni og hyperoksi forventes ikke å ha en signifikant effekt på gjennomsnittlig arterielt trykk i omfanget og varigheten av gassvariasjonsett i denne studien, spesielt hos hemodynamisk normale forsøkspersoner35,36. Måling av blodtrykk under gasspusteprovokasjoner kan imidlertid være nyttig hvis selve måleprosedyren ikke forvirrer studien eller øker fagangsten under testingen. Hvis de foretrukne stimuli for å vurdere RVR er å øke gjennomsnittlig arterielt trykk, alternative metoder som hånd-grep test37,38,39 eller kald pressor test40, som kan mer direkte og effektivt øke et subjeks blodtrykk, kan vurderes.

OCTA gir mulighet for god intravisit og intervisit reproduserbarhet hos både friske pasienter og de med retinopati med de fleste variasjonskoeffisienter for fartøytetthet mindre enn 6%41,42. I en pasientpopulasjon av interesse, slik som for diabetikere, forble intersessionkoeffisienten av variabilitet for fartøytetthet under 6% selv med et intervall på en måned43. Dermed kan denne metoden brukes til å følge de langsgående endringene i RVR. Under langsgående oppfølginger vil det imidlertid være viktig å holde styr på de potensielle confounders til retinal vaskulær reaktivitetsvurdering som kaffeinntak44. Det kan også være behov for å være følsom for dagvariasjon som kan påvirke reaktiviteten avhengig av tilstanden og retinal laget som studeres45,46,47.

Til tross for den brede anvendelsen av metoden, må noen faktorer vurderes under pasientrekruttering. Selv om denne ikke-repustende prosedyren ikke bruker en hypoksisk gassblanding, kan den økte motstanden mot åndedrett gjennom røret utgjøre ytterligere risiko for de som allerede er med obstruktive lungesykdommer, inkludert astma og kronisk obstruktiv lungesykdom. For, inkludert de med hjertesykdommer, der kortpustethet allerede er en bekymring, bør deres deltakelse i studien få ytterligere gransking. I tilfelle av mer vanlige vaskulære sykdommer, inkludert hypertensjon og diabetes, har gassutfordringstester blitt utført med lignende gasssammensetninger i disse pasientpopulasjonene i flere studier8,9,48, og mer nylig med den beskrevne metoden2, og det har ikke vært noen rapporter om bivirkninger i disse papirene.

Videre, selv om OCTA-bilder inneholder betydelig informasjon om funksjonen til netthinnen og mange parametere kan beregnes for å kvantifisere morfologien til kapillærsengen49,50, som med mange andre bildeteknologier, eksisterer begrensninger i tolkningen av OCTA-skanninger. Bildefeil, inkludert forskyvningsartefakter, bevegelsesartefakter og projeksjonsartefakter50, kan påvirke bildekvaliteten. OCTA er avhengig av flyt for å oppdage signal uten å visualisere endotelet eller vaskulær veggen. Som et resultat involverer OCTA-beregninger indekser som er representative for de iboende vaskulære egenskapene, men kan ikke være perfekte representasjoner av mikrovaskulaturen. Sammenligninger med histologi har vist at den virkelige tettheten av retinal vaskulatur kan være større enn vurdert med OCTA51. I tillegg kan tidsendringer i strømmen i mikrofartøy mindre enn 10–15 μm forårsake variasjon i OCTA-bildeintensitet mellom skanninger23. Dette mistenkes for å skyldes strømningshastigheter under en minimum påviselig hastighet.

For å konkludere, bekvemmeligheten av gassutveksling oppsett, lave kostnader av materialene, og evnen til metoden som skal brukes på et bredt utvalg av oftalmisk bildeenheter betyr at det vil forbli relevant for retinal imaging, spesielt med OCTA-systemer. Ved å stimulere både en positiv og negativ RVR-respons, kan dette oppsettet også brukes til å undersøke retinal vaskulær sykdomsfysiologi samt grensene for OCTA-systemene selv ved å visualisere de fartøyene som unngår deteksjon ved hjelp av dagens teknologi, men er tydelig med ekstra stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Carl Zeiss Meditec har gitt tilskuddsmidler, utstyr og økonomisk støtte til AHK knyttet til temaet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH K08EY027006, R01EY030564, UH3NS100614, Research Grants fra Carl Zeiss Meditec Inc (Dublin, CA) og Unrestricted Department Funding fra Research to Prevent Blindness (New York, NY).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% CO2 gas [5% CO2, 21% O2, 74% N2] (Compressed) Institution Dependent (Praxair)
Bacdown Disinfectant Detergent Decon Labs 8001 https://deconlabs.com/products/disinfectant-bdd/
Clean-Bor Tubes (35 mm Inner Diameter) Vacumed 1011-108 http://www.vacumed.com/zcom/product/Product.do?compid=27&skuid=1197
Cuff adapter for Douglas bag filling Vacumed 22254 http://www.vacumed.com/zcom/product/Product.do?compid=27&prodid=343
Douglas bag (200 L capacity) Harvard Apparatus 500942 https://www.harvardapparatus.com/douglas-bag.html
Elbow Joint (Inner Diameter 19 mm/Outer Diameter 22 mm), Modified in House
Fingertip Pulse Oximeter (Pro-Series) CMS CMS 500DL https://www.walmart.com/ip/Pro-Series-CMS-500DL-Fingertip-Pulse-Oximeter-Blood-Oxygen-Saturation-Monitor-with-silicon-cover-batteries-and-lanyard/479049154
Gas Delivery Tube (22 mm Inner Diameter) Modified in House
Gas filling tube (1/8" for compressed gas)
Hydrogen Peroxide Cleaner Disinfectant Wipes Clorox Healthcare 30824 https://www.cloroxpro.com/products/clorox-healthcare/hydrogen-peroxide-cleaner-disinfectants/?gclid=EAIaIQobChMIk-KG4vi15QIVcRh9Ch0NNwLPEAAYASAAEgJIa_D_BwE&gclsrc=aw.ds
Lubricant Eye Drops Refresh Refresh Plus https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-plus
Manual Directional Control Valves: Three-Way T-Shape Stopcock Type (Inner Diameter 28.6 mm, Outer Diameter 35 mm) Hans Rudolph 2100C Series www.rudolphkc.com
Medical O2 (Compressed) Institution Dependent
Mouth piece (Silicone, Model #9061) Hans Rudolph 602076 www.rudolphkc.com
OCTA Imaging Device (PLEX Elite 9000) Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA https://www.zeiss.com/meditec/int/product-portfolio/optical-coherence-tomography-devices/plex-elite-9000-swept-source-oct.html
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2.5% Paragon Bioteck, Inc NDC 42702-102-15 https://paragonbioteck.com/products/diagnostics/phenylephrine-hydrochloride-ophthalmic-solution-usp-2-5/
Plastic Nose Clip Sterile Foam CS100 Sklar Sterile 96-2951 https://www.sklarcorp.com/disposables/plastic/plastic-nose-clip-sterile-foam-box-of-100.html
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP .5% Bausch + Lomb NDC 24208-730-06 https://www.bausch.com/ecp/our-products/rx-pharmaceuticals/generics
Regulator (tank dependent- 5% CO2: Fisherbrand Mulitstage Gas Cylinder Regulators) Genstar Technologies Company 10575150 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-multistage-cylinder-regulators-22/10575150?keyword=true
Regulator (tank dependent- Oxygen: Fisherbrand Multistage Gas Cylinder Regulators) Genstar Technologies Company 10575145 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-multistage-cylinder-regulators-22/10575145?keyword=true
Rubber Tubing (Inner diameter 19 mm, Outer diameter 27 mm), Made in House
Sealing tape- Parafilm Wrap (2" Wide) Cole Parmer PM992 https://www.coleparmer.com/i/parafilm-pm992-wrap-2-wide-250-ft-roll/0672050?PubID=VV&persist=True&ip=no&gclid=EAIaIQobChMInY3vqomz5QIVfyCtBh1VSg64EAAYASAAEgJ9n_D_BwE
Sterile Alcohol Prep Pads Medline MDS090670 https://www.medline.com/product/Sterile-Alcohol-Prep-Pads/Swab-Pads/Z05-PF03816
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP 1% Akorn NDC 17478-102-12 http://www.akorn.com/prod_detail.php?ndc=17478-102-12
Tubing Adapter, Made in House
Two-way non-rebreathing valve (2600 Series- Inner Diameter 28.6 mm, Outer Diameter 35 mm) Hans Rudolph 2600 Series, UM-112078 www.rudolphkc.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
  2. Ashimatey, B. S., Green, K. M., Chu, Z., Wang, R. K., Kashani, A. H. Impaired Retinal Vascular Reactivity in Diabetic Retinopathy as Assessed by Optical Coherence Tomography Angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (7), 2468 (2019).
  3. Hickam, J. B. M. D., Frayser, R. P. D. Studies of the Retinal Circulation in Man: Observations on Vessel Diameter, Arteriovenous Oxygen Difference, and Mean Circulation Time. Circulation. 33 (2), 302-316 (1966).
  4. Dorner, G. T., Garhoefer, G., Zawinka, C., Kiss, B., Schmetterer, L. Response of Retinal Blood Flow to CO2 -Breathing in Humans. European Journal of Ophthalmology. 12 (6), 459-466 (2002).
  5. Linsenmeier, R. A., Zhang, H. F. Retinal oxygen: from animals to humans. Progress in Retinal and Eye Research. 58, 115-151 (2017).
  6. Eliakim, M., Mor, I., Michaelson, I. C. Assessment of pharmacologic effects on the retinal circulation of hypertensive subjects by a quantitative method. Microvascular Research. 4 (4), 374-383 (1972).
  7. Gilmore, E. D., et al. Retinal arteriolar hemodynamic response to an acute hyperglycemic provocation in early and sight-threatening diabetic retinopathy. Microvascular Research. 73 (3), 191-197 (2007).
  8. Hickam, J. B., Sieker, H. O. Retinal Vascular Reactivity in Patients with Diabetes Mellitus and with Atherosclerosis. Circulation. 22 (2), 243-246 (1960).
  9. Gilmore, E. D., et al. Retinal Arteriolar Diameter, Blood Velocity, and Blood Flow Response to an Isocapnic Hyperoxic Provocation in Early Sight-Threatening Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1744 (2007).
  10. Garhofer, G. Reduced response of retinal vessel diameters to flicker stimulation in patients with diabetes. British Journal of Ophthalmology. 88 (7), 887-891 (2004).
  11. Felder, A. E., Wanek, J., Blair, N. P., Shahidi, M. Inner Retinal Oxygen Extraction Fraction in Response to Light Flicker Stimulation in Humans. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6633-6637 (2015).
  12. Rose, K., Flanagan, J. G., Patel, S. R., Cheng, R., Hudson, C. Retinal Blood Flow and Vascular Reactivity in Chronic Smokers. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4266 (2014).
  13. Omae, T., Nagaoka, T., Yoshida, A. Effects of Habitual Cigarette Smoking on Retinal Circulation in Patients With Type 2 Diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (3), 1345 (2016).
  14. Pusparajah, P., Lee, L. H., Abdul Kadir, K. Molecular Markers of Diabetic Retinopathy: Potential Screening Tool of the Future. Frontiers in Physiology. 7, (2016).
  15. Hammer, M., Vilser, W., Riemer, T., Schweitzer, D. Retinal vessel oximetry-calibration, compensation for vessel diameter and fundus pigmentation, and reproducibility. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054015 (2008).
  16. Gilmore, E. D., Hudson, C., Preiss, D., Fisher, J. Retinal arteriolar diameter, blood velocity, and blood flow response to an isocapnic hyperoxic provocation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 288 (6), 2912-2917 (2005).
  17. Duan, A., Bedggood, P. A., Metha, A. B., Bui, B. V. Reactivity in the human retinal microvasculature measured during acute gas breathing provocations. Scientific Reports. 7 (1), 2113 (2017).
  18. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Progress in Retinal and Eye Research. 68, 1-30 (2019).
  19. Kim, A. Y., Chu, Z., Shahidzadeh, A., Wang, R. K., Puliafito, C. A., Kashani, A. H. Quantifying Microvascular Density and Morphology in Diabetic Retinopathy Using Spectral-Domain Optical Coherence Tomography Angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Koulisis, N., et al. Quantitative microvascular analysis of retinal venous occlusions by spectral domain optical coherence tomography angiography. PLOS ONE. 12 (4), 0176404 (2017).
  21. Kim, A. Y., et al. Quantifying Retinal Microvascular Changes in Uveitis Using Spectral-Domain Optical Coherence Tomography Angiography. American Journal of Ophthalmology. 171, 101-112 (2016).
  22. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  23. Yu, D. Y., et al. Retinal capillary perfusion: Spatial and temporal heterogeneity. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 23-54 (2019).
  24. Tayyari, F., et al. The Relationship between Retinal Vascular Reactivity and Arteriolar Diameter in Response to Metabolic Provocation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4814 (2009).
  25. Lu, H., Liu, P., Yezhuvath, U., Cheng, Y., Marshall, O., Ge, Y. MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges. Journal of Visualized Experiments. (94), e52306 (2014).
  26. Reif, R., Qin, J., An, L., Zhi, Z., Dziennis, S., Wang, R. Quantifying Optical Microangiography Images Obtained from a Spectral Domain Optical Coherence Tomography System. International Journal of Biomedical Imaging. 2012, 1-11 (2012).
  27. Olafsdottir, O. B., Eliasdottir, T. S., Kristjansdottir, J. V., Hardarson, S. H., Stefánsson, E. Retinal Vessel Oxygen Saturation during 100% Oxygen Breathing in Healthy Individuals. PLOS ONE. 10 (6), 0128780 (2015).
  28. Kiss, B., et al. Retinal Blood Flow during Hyperoxia in Humans Revisited: Concerted Results Using Different Measurement Techniques. Microvascular Research. 64 (1), 75-85 (2002).
  29. Yezhuvath, U. S., Lewis-Amezcua, K., Varghese, R., Xiao, G., Lu, H. On the assessment of cerebrovascular reactivity using hypercapnia BOLD MRI. NMR in biomedicine. 22 (7), 779-786 (2009).
  30. Hardarson, S. H., et al. Automatic Retinal Oximetry. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5011 (2006).
  31. Sousa, D. C., Leal, I., Moreira, S., Dionísio, P., Abegão Pinto, L., Marques-Neves, C. Hypoxia challenge test and retinal circulation changes - a study using ocular coherence tomography angiography. Acta Ophthalmologica. 96 (3), 315-319 (2018).
  32. Slessarev, M., Somogyi, R., Preiss, D., Vesely, A., Sasano, H., Fisher, J. A. Efficiency of oxygen administration: Sequential gas delivery versus "flow into a cone" methods. Critical Care Medicine. 34 (3), 829-834 (2006).
  33. Gilmore, E. D., Hudson, C., Venkataraman, S. T., Preiss, D., Fisher, J. Comparison of Different Hyperoxic Paradigms to Induce Vasoconstriction: Implications for the Investigation of Retinal Vascular Reactivity. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (9), 3207 (2004).
  34. Shahidi, A. M., Patel, S. R., Huang, D., Tan, O., Flanagan, J. G., Hudson, C. Assessment of total retinal blood flow using Doppler Fourier Domain Optical Coherence Tomography during systemic hypercapnia and hypocapnia. Physiological Reports. 2 (7), 12046 (2014).
  35. Maleki, N., et al. The Effect of Hypercarbia and Hyperoxia on the Total Blood Flow to the Retina as Assessed by Magnetic Resonance Imaging. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (9), 6867 (2011).
  36. Smit, B., Smulders, Y. M., vander Wouden, J. C., Oudemans-van Straaten, H. M., Spoelstra-de Man, A. M. E. Hemodynamic effects of acute hyperoxia: systematic review and meta-analysis. Critical Care. 22 (1), 45 (2018).
  37. Piccolino, F. P., Cagini, C., Fruttini, D., Nicolò, M., Eandi, C. M., Tito, S. Retinal Vascular Reactivity in Central Serous Chorioretinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4425 (2018).
  38. Sousa, D. C., et al. A Protocol to Evaluate Retinal Vascular Response Using Optical Coherence Tomography Angiography. Frontiers in Neuroscience. 13, 566 (2019).
  39. Robinson, F., Riva, C. E., Grunwald, J. E., Petrig, B. L., Sinclair, S. H. Retinal Blood Flow Autoregulation in Response to on Acute Increase in Blood Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (5), 5 (1986).
  40. Gherghel, D., Hosking, S. L., Cunliffe, I. A. Abnormal Systemic and Ocular Vascular Response to Temperature Provocation in Primary Open-Angle Glaucoma Patients: A Case for Autonomic Failure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3546 (2004).
  41. You, Q., et al. Reproducibility of vessel density measurement with Optical Coherence Tomography Angiography in eyes with and without retinopathy. Retina. 37 (8), 1475-1482 (2017).
  42. Lei, J., et al. Repeatability and Reproducibility of Superficial Macular Retinal Vessel Density Measurements Using Optical Coherence Tomography Angiography En Face Images. JAMA Ophthalmology. 135 (10), 1092 (2017).
  43. Czakó, C., et al. Intrasession and Between-Visit Variability of Retinal Vessel Density Values Measured with OCT Angiography in Diabetic Patients. Scientific Reports. 8 (1), 10598 (2018).
  44. Field, A. S., Laurienti, P. J., Yen, Y. F., Burdette, J. H., Moody, D. M. Dietary Caffeine Consumption and Withdrawal: Confounding Variables in Quantitative Cerebral Perfusion Studies. Radiology. 227 (1), 129-135 (2003).
  45. Baek, S. U., et al. Diurnal change of retinal vessel density and mean ocular perfusion pressure in patients with open-angle glaucoma. PLOS ONE. 14 (4), 0215684 (2019).
  46. Müller, V. C., Storp, J. J., Kerschke, L., Nelis, P., Eter, N., Alnawaiseh, M. Diurnal variations in flow density measured using optical coherence tomography angiography and the impact of heart rate, mean arterial pressure and intraocular pressure on flow density in primary open-angle glaucoma patients. Acta Ophthalmologica. 97 (6), (2019).
  47. Sarwar, S., et al. Diurnal variation of choriocapillaris vessel flow density in normal subjects measured using optical coherence tomography angiography. International Journal of Retina and Vitreous. 4 (1), 37 (2018).
  48. Liu, P., De Vis, J. B., Lu, H. Cerebrovascular reactivity (CVR) MRI with CO2 challenge: A technical review. NeuroImage. 187, 104-115 (2019).
  49. Ting, D. S. W., et al. Optical Coherence Tomographic Angiography in Type 2 Diabetes and Diabetic Retinopathy. JAMA Ophthalmology. 135 (4), 306 (2017).
  50. Spaide, R. F., Fujimoto, J. G., Waheed, N. K., Sadda, S. R., Staurenghi, G. Optical coherence tomography angiography. Progress in retinal and eye research. 64, 1-55 (2018).
  51. An, D., et al. Quantitative comparisons between optical coherence tomography angiography and matched histology in the human eye. Experimental Eye Research. 170, 13-19 (2018).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 157 OCTA Vaskulær reaktivitet Netthinne Hyperkapni Hyperoksi Mennesker Retinal fartøy/patologi Tomografi Optisk sammenheng
Retinal vaskulær reaktivitet som vurdert av optisk coherence tomografi angiografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kushner-Lenhoff, S., Ashimatey, B.… More

Kushner-Lenhoff, S., Ashimatey, B. S., Kashani, A. H. Retinal Vascular Reactivity as Assessed by Optical Coherence Tomography Angiography. J. Vis. Exp. (157), e60948, doi:10.3791/60948 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter