Summary
我们提出了一种用于标记和分析金字塔神经元的协议，这对于评估神经元和树突脊柱的潜在形态变化至关重要，这些变化可能是神经化学和行为异常的基础。
Abstract
据报道，树突椎的大小和形状与其结构可塑性有关。为了识别金字塔神经元和树突脊柱的形态结构，可以使用弹道标记技术。在本协议中，金字塔神经元标有DilC18（3）染料，并使用神经元重建软件进行分析，以评估神经元形态和树突脊柱。为了研究神经元结构，进行了树突分支分析和Sholl分析，使研究人员能够分别对树突分支的复杂性和神经元树体的复杂性进行推论。树突脊柱的评估使用重建软件不可或缺的自动辅助分类算法进行，该算法将脊柱分为四类（即薄、蘑菇、短根、纤维素）。此外，还选择另外三个参数（即长度、头部直径和体积）来评估树突脊柱形态的变化。为了验证弹道标记技术的广泛应用潜力，成功地标记了体外细胞培养的金字塔神经元。总体而言，弹道标记方法是独特的，可用于可视化大鼠不同大脑区域的神经元，与复杂的重建软件相结合，使研究人员能够阐明潜在的机制神经认知功能障碍。
Introduction
2000年，Gan等人描述了神经系统中单个神经元和胶质的快速标记技术，将各种嗜脂染料结合在一起，允许同时标记许多不同颜色的脑细胞11，2。2最近，Seabold等人3描述了一种弹道标记技术，该技术将荧光染料（Dil）引入脑切片的神经元。弹道标记是一种多功能染色技术，因其在多种动物种类和不同年龄范围内使用的能力而广受赞赏。此外，它可以与免疫染色相结合，以识别脑细胞的亚群3。与传统技术（如Golgi-Cox银浸渍、微注射）4相比，弹道标记提供了一个更清晰地区分形态特征的机会，包括树突脊柱，这一特征对于绘制关于神经元复杂性和突触连通性5的推论至关重要。
外泄金字塔神经元的特点是单个，大的树突，多个较短的基底树突，和数以千计的树突脊柱6。金字塔神经元存在于与高阶认知处理相关的多个大脑区域，包括前额叶皮质（PFC）和海马。在PFC中，金字塔神经元在II/III层和第五层被观察到，每个神经元都表现出独特的形态。具体来说，PFC第二/III层中的金字塔神经元具有比第五层6中的金字塔神经元较短的尖树突和更少的分支。在海马区内，金字塔神经元位于CA1和CA3区域，每个区域都显示不同的形态。具体来说，CA1 区域中的金字塔神经元表现出更独特的尖突，与 CA3 区域6相比，分支远离躯体。
在PFC和海马的金字塔神经元上的腺突脊柱是兴奋突触7的主要部位。树突脊柱的形态特征，被经典地分为三大类（即薄、小根或蘑菇8），与兴奋突触9的大小有关。细脊椎，其特点是长，薄的脖子，小球状头，和较小的脑后密度，是更不稳定的，并发展较弱的连接。然而，蘑菇脊柱，有一个更大的树突脊柱头，被认为是形成更强的突触连接，其更大的尺寸所产生的效果。与此形成鲜明对比的是，短根脊柱没有脊柱颈部，头部和颈部体积比约为8。在海马区内，也可以观察到分支脊柱，即脊柱有多个头，从同一树突脊柱颈部10中浮现出来。因此，树突脊柱的形态变化可以反映功能和结构能力。此外，研究表明，树突椎的大小和形状与结构可塑性有关，导致小脊柱参与学习和注意力，而更大，更稳定的脊柱，参与长期过程，包括记忆11。此外，树突状脊柱沿树突的分布可能与突触连接55，1212相关。
因此，本方法论文件有三个目标：1） 提出我们的弹道标记方案，其成功率（即符合选择标准的神经元和适合分析的神经元）为 83.3%5,5、12、13,13和跨多个大脑区域（即 PFC、核积液、海马区）;2） 证明该技术的通用性及其在体外生长的神经元中的应用;3） 详细说明神经元重建软件中使用的方法以及可以从此类数据中提取的推论。
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Protocol
所有动物协议均由南卡罗来纳大学动物护理和使用委员会审查和批准（联邦保证号：D16-00028）。
1. 准备 DiI/钨珠管
- 用 10 mL ddH2O. Vortex 轻轻溶解 100 毫克聚乙烯丙烯酮 （PVP）。
- 用 PVP 溶液填充油管（参见材料表），并保留 20 分钟。然后，使用 10 mL 注射器通过管道的另一端排出 PVP 溶液。
- 将 170 毫克钨微载珠与 250 μL 的二甲苯氯化物混合。彻底地涡旋钨珠悬浮液。
- 将6毫克的脂质迪尔C18（3）染料与300μL的二甲烷氯化物混合。彻底涡旋 DilC18（3） 染料溶液。
注：在烟雾罩中执行步骤 1.3_1.4。 - 钨珠悬浮液的移液器 250 μL 放在玻璃滑轨上。等待悬架风干（约3分钟）。
- 在钨珠悬浮层顶部加入300μL的DilC18（3）染料溶液。将 DiIC18（3） 染料溶液和钨珠悬浮液与移液器尖端彻底混合，让混合物干燥（约 3 分钟）。
- 干燥后，使用剃刀刀片将混合物分成两个 1.5 mL 离心机管。给管子加水。
- 水浴中声波（安培 I，100%）直到均匀（约5分钟）。确保声波器的尖端直接位于带珠悬架的管上。
- 将两个 1.5 mL 的均质混合物组合成 15 mL 锥形管。将混合物再声波3分钟。
- 使用 10 mL 注射器将钨珠-DilC18（3） 染料混合物放入 PVP 涂层管中。将油管送入准备站（参见材料表）。
- 在准备站上旋转 1 分钟。使用 10 mL 注射器小心地从管道中取出所有水。
- 打开氮气，将氮气流量调整到每分钟约 0.5 升 （LPM），在制备站中旋转油管，用氮气干燥 30 分钟。
- 使用油管切割机从准备站取下油管，切成 13 mm 长度（与墨盒的装载尺寸相匹配）。在黑暗中保持 13 mm 长度的闪烁小瓶。
2. 准备大脑部分
注：成年雄性F344/N大鼠在12/12光：暗循环下被安置在受控的环境中，可以接触到食物和水。所有动物都使用国家卫生研究院在《实验室动物护理和使用指南》中制定的指南进行照料。
- 使用5%的氟烷对大鼠进行深度麻醉。
- 当大鼠对有害的刺激和反射没有反应时，继续执行以下步骤。
- 将大鼠固定在化学烟罩内的假位置。
- 沿着胸腔中线穿过皮肤进行切口。将隔膜分开，用剪刀打开胸部。将 20 G × 25 mm 针插入左侧心室。
- 立即用剪刀切开右中庭。注入 50 mL 100 mM PBS，流量为 5 mL/min。在100mM PBS中缓冲100 mL4%的甲醛。
- 灌注后，直接取出整个大鼠大脑。
- 用4%的甲醛将整个大脑固定10分钟。
注：不要在4%半甲醛中后缀超过30分钟，因为它会影响标签。 - 使用大鼠大脑矩阵切割500μm厚的日冕部分（参见材料表）。进行第一次切割，并保持刀片到位。使用第二个刀片进行第二次切割，并垂直拆下第一个刀片，将组织保留在刀片表面。
- 将脑切片放入 24 孔板中，每个孔中具有 1 mL 100 mM PBS 的 1 mL。重复此过程，直到剪切所有切片。
3. 脑部弹道标记和可视化
- 从每个目标井中删除 PBS。
- 用一块 DiI/Tungsten 珠管装入墨盒，并将其放入施用器中。
- 在两个网屏之间放一张滤纸。将施用器连接到氦软管。将氦的输出压力调整到每平方英寸 （psi） 90 磅。
- 在样品和网状屏幕之间的距离为 1.5 厘米的地方，用手将施用器垂直放置在目标井的中心。点燃 DiI/钨珠管。
注：在拍摄前，请务必从目标井中取出所有 PBS。 - 使用下一个 DiI/Tungsten 珠管装入墨盒。持续从剩余的切片的管子中连续发射 DiI/钨珠。
- 用 100 mM 的 PBS 填充 24 孔板。用 500 μL 的新鲜 100 mM PBS 3 倍清洗。使用 PBS 清洗时，不要让切片翻转。
- 加入 500 μL 的新鲜 100 mM PBS，将切片保持在 4 °C 的黑暗中 3 小时。
- 使用细刷子将大脑切片转移到玻璃幻灯片上。
注：三个大脑部分可以转移到每个玻璃幻灯片上。 - 立即在每个部分添加 1 mL 防褪色安装介质。在大脑部分放置 22 毫米 x 50 毫米盖玻片。在黑暗中干燥玻璃滑梯 2 天。
- 打开共聚焦显微镜系统并切换到 60° 目标。
- 将共聚焦显微镜系统设置为放大倍率为 60°（A/1.4，机油）和 0.15 μm（针孔尺寸 30 μm，后投影针孔半径 167 nm）的 Z 平面间隔。使用 543 nm 波长获取感兴趣的神经元的图像。
- 根据大脑区域边界和神经元的形态特征获取目标神经元类型的Z堆栈图像。
注：从每只动物中获取至少三张图像。
4. 将方法与细胞培养一起使用
- 使用先前报告的方法14，在产后第一天从F344/N大鼠分离原发皮质神经元。
- 在35毫米玻璃底盘中培养原皮质神经元一周。在分离后的第三天，使用新鲜的神经元生长培养基改变一半的培养基。用 1 mL 100 mM PBS 的 1 mL 清洗玻璃底盘 2 倍。
- 在室温下用4%的甲醛固定15分钟。重复步骤 3.2_3.6 以弹道标记细胞。
- 用 1 mL 100 mM PBS 3 倍清洗。加入 500 μL 的新鲜 100 mM PBS，并将其在黑暗中保持在 4 °C，持续 3 小时。
- 加入200 μL的防褪色安装介质。
- 使用步骤 3.10 中的参数获取每个目标神经元的 Z 堆栈图像。
5. 神经分析和树突脊柱定量
- 使用代码数的盲神经元，以防止实验者偏倚。
- 根据感兴趣的大脑区域为神经元建立选择标准。
注：神经元的选择标准包括连续树突染色、低背景、细胞内无染料簇、DiI染料在细胞外空间的最小扩散、金字塔神经元的正确形态（图1）。 - 打开神经元重建软件（参见随附的视频1）。
- 通过单击左上角的"文件夹"图像加载图像文件。
- 单击"Soma"并在图像上标记神经元的躯瘤。
- 单击"树"并选择"用户引导"。
- 跟踪所有感兴趣的树突状分支。
注：对于金字塔神经元，其特点是一个尖树突和多个巴西尔树突，只有尖树突被追踪。确保所有连接分支彼此连接。 - 单击"脊柱"。
- 定义检测参数，然后单击"检测所有"。
注：对于脑切片，大脑区域使用的一致参数为：2.0（外距）、0.3（最小高度）、100%（检测灵敏度）和10（最小计数）。对于细胞培养，有必要提高检测器灵敏度并减少最小计数。 - 通过选择"对所有脊柱进行分类"来对脊柱进行分类。
注：树突脊柱分类使用算法集成到神经元重建软件15。 - 通过选择左上角中的磁盘映像来保存跟踪。
- 执行神经元和树突脊柱形态分析。
- 开放神经元重建定量分析软件（参见随附的视频 2）。
- 通过单击"文件"和"打开数据文件"加载图像。
- 单击"分析"和"分支结构分析"，分析神经元形态和树突脊柱形态。
- 对于神经元形态，单击"树总计"并选择"Dendrite 总计"的框。
- 对于树突脊柱形态，单击"脊柱"，然后选择"脊柱详细信息"框。
- 通过右键单击输出表并选择"保存到文件"将输出保存为文本 （.txt） 文件。
- 单击"分析"和"肖尔分析"。
- 将起始半径设置为 10 μm，将半径增量设置为 10 μm。
- 单击"Dendrite"框，然后单击"显示"。
- 通过右键单击输出表并选择"保存到文件"将输出保存为文本 （.txt） 文件。
6. 数据分析
- 分析神经元形态学（即树突分支复杂性）数据。
- 在每个分支订单上添加树突数，并将树突总数除以。乘以 100 计算每个分支订单上树突数的相对频率。
- 分析 Sholl 分析数据，以检查神经元树干复杂性和树突脊柱连通性。
- 计算每个半径的交点数平均值和标准误差。
- 并求每个半径内取决于脊柱类型（即薄、短根、蘑菇）的脊柱数量，并除以该脊柱类型的脊柱总数。乘以 100 计算每个半径的脊柱数的相对频率。
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Representative Results
在图2A中，大鼠大脑部分海马区域的典型金字塔神经元通过弹道标记技术进行识别，其特点是在躯体周围有一个大的树突和几个较小的基底树突。图2B显示了检测到躯体后神经元重建定量分析软件中的神经元，追踪树突状分支，并检测到脊柱。随后，利用神经元重建定量分析软件对数据进行了分析，为评估树突分支复杂性（图2C）和神经元树干复杂性（图2D）提供了机会。
在图 2C中，我们使用从"树总计"输出收集的离心分支排序方法来计算沿每个树突和分配的分支订单遍历的段数。针对分支订单 1-15 检查了每个分支订单的段的相对频率。当观察到树突状分支在组之间的分布变化时，可以推断出树突分分的复杂性变化。此外，Sholl 分析作为神经元树皮复杂性的一个补充测量，根据该分析，在每个样本部分中量化每 10 μm 从躯体发生的树突状交点数（图2D）。当观察到各组间树突交叉数的变化时，可以推断出神经元树干复杂性的变化。
树突脊柱的形态变化可以用长度（μm）、头部直径（μm）和体积（μm3）来评估，如图3A+B所示。此外，脊柱在神经元重建软件中使用自动辅助分类系统进行分类。检查了每个半径之间的脊柱数量的相对频率，以检查薄、蘑菇和短脊柱。鉴于我们了解哪些脊柱类型形成更强的突触连接（即蘑菇相对于存根）和神经递质变性，脊柱沿神经元分布的变化可以指示突触连接。
此外，我们还验证了弹道标记技术在细胞培养中主金字塔神经元的效用。首先，我们在产后D1（第1天）培养原发性海马神经元，在涂有多L-莱辛的细胞培养板上2周或直到大约70%的汇合。然后用4%PFA固定样品15分钟，用PBS洗涤2倍。从本协议的第3.1步开始，我们用弹道标记和图像从海马区的主要金字塔神经元。数据显示，根据索马和大角树突的三角形形状，稳定标记和识别金字塔神经元（图4A）。利用神经元重建软件来研究在细胞培养中生长的主要金字塔神经元的树突状脊柱，提供了类似于大鼠大脑的机会。例如，以 μm 为单位测量的薄树突脊柱分布（图 4B）和树突脊柱长度（图 4C）的分布。然而，值得注意的是，在细胞培养中生长的主要金字塔神经元较少树突状分支，排除了至少在此示例中，树突分支复杂性和神经元树干复杂性的评估。
图1：使用弹道标记技术标记的中前额叶皮层金字塔神经元的选择标准。（A） 来自前额叶皮层的标记良好的金字塔神经元的代表性共聚焦图像（60 倍）。单个金字塔神经元具有清晰的躯体和尖树突，包括连续、明亮的树突染色，背景较低。（B=C）来自中前额叶皮层的金字塔神经元的代表性共聚焦图像（60倍），在较远端的分支（B）和高背景（C）处有光染色。（D） 具有有缺陷的形态特征的中前皮层（基于布雷格玛坐标）标记神经元的代表性共聚焦图像（60倍）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：使用弹道标记技术和神经解剖学评估在海马区（HIP）中标记金字塔神经元。（A） 三个具有代表性的共聚焦图像（60倍），这些金字塔神经元标有弹道钨珠。（B） 神经元形态学评估：树突分支顺序分析和肖尔分析。树突脊柱的跟踪图像，其中脊柱形态也识别使用树突脊柱分析软件。（C） 分支订单分析用于检查不同分支订单中树突状分支的相对频率。（D） 使用 Sholl 分析作为神经元树皮复杂性的度量，评估从躯体中每 10 μm 的树突状交点数。数据被描述为整个数据集 （C） 的相对频率， 或适合 95% 置信区间 （D）.请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3.树突脊柱形态的评估。（A=B） 树突状脊柱的分布图示为脊柱类型的功能（即薄、小根、蘑菇）。还分析了其他树突脊柱参数（即长度、体积、头部直径），作为对树突脊柱形态的评估。数据作为整个数据集的相对频率进行说明。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4.使用弹道标记技术在体外标记原皮质神经元。（A） 体外标记的由弹道钨珠标记的原皮质神经元的代表性共聚焦图像 （60x）。示例结果类似于脑切片中弹道标记的结果，用于分布薄树突脊柱 （B） 和长度 （C）。数据作为整个数据集的相对频率进行说明。请点击此处查看此图形的较大版本。
视频1：神经元跟踪和树突脊柱检测的过程。请点击此处查看此视频。（右键单击以下载。
视频 2：用于定量分析的数据收集和输出程序。请点击此处查看此视频。（右键单击以下载。
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Discussion
在此协议中，我们描述了一种针对大鼠大脑和体外生长的神经元的通用标记技术。此外，我们报告利用神经元重建软件和神经元重建定量分析软件来评估神经元形态和树突脊柱的方法。对神经元形态学和树突脊柱的评估提供了一个机会，以确定树突分枝的复杂性、神经元树干复杂性、树突脊柱形态和突触连通性的变化。
在进行协议时，研究人员应特别注意几个步骤。首先，在4%PFA中固定时间过长会损害脂质膜的完整性，并导致染料在细胞外泄漏。其次，与脑切片中弹道标记的特异性（仅针对神经元）相比，体外原皮质神经元的标签引入了胶质的非特异性标记，因为脑切片中的弹道标记不是针对一种神经元（即金字塔神经元、中旋神经元、颗粒细胞）的特异性标记。因此，布雷格玛坐标、形态评估或特定的细胞标记应与弹道标记方法相结合。第三，脑切片厚度可在200~500μm之间;为了获得最佳效果，应对其进行优化。第四，标签和染料渗透效率与氦压、弹道应用后孵育时间、DiI/Tungsten珠、网状屏与脑切片表面之间的距离等多种因素有关。应针对每个研究优化协议。第五，在制备过程中必须避免大块或块状的弹道染料涂层钨珠，因为团块不允许区分单个神经元。我们还确定，在这个弹道方法中，DiI扩散到单个神经元中比DiO更完整。
然而，与传统的标签方法4相比，弹道标记技术使高分辨率共聚焦成像成为可能，从而可以评估神经元和树突脊柱形态。此外，神经元重建软件利用一种算法自动辅助分类树突脊柱（即薄，蘑菇，存根），分支排序测量，经典的Sholl分析和测量树突脊柱的形态特征，如长度（μm），头部直径（μm）和体积（μm3）。多个神经元参数的定量提供了一个机会，以更好地了解神经认知功能障碍背后的机制。
总体而言，弹道标记方法允许对大鼠不同大脑区域和细胞培养中的神经元结构进行可视化，这对阐明神经认知功能障碍背后的可能机制非常重要。在本研究中，我们提出了一种通过弹道标记技术标记金字塔神经元的方法。此外，结合神经元重建软件，我们证明了检查海马金字塔神经元神经元和树突脊柱形态的能力。神经元和/或树突脊柱形态的组差异提供了一个了解神经认知功能障碍背后的机制的机会。
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Disclosures
提交人中没有一个有利益冲突可申报。
Acknowledgments
这项工作由NIH拨款HD043680、MH106392、DA013137和NS100624资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
