Summary
우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 피라미드 형 뉴런과 수지상 척추의 형태 학적 구조를 식별하기 위해 탄도 라벨링 기술을 활용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 피라미드 형 뉴런은 DilC18 (3) 염료로 표지되고 신경 형태 및 수지상 척추를 평가하기 위해 뉴런 재건 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 신경 구조를 조사하기 위해 수지상 분기 분석과 Sholl 분석을 수행하여 연구원들이 수지상 분기 복잡성과 뉴런 아버 복잡성에 대한 추론을 각각 그릴 수 있습니다. 수지상 척추의 평가는 재건 소프트웨어에 필수적인 자동 보조 분류 알고리즘을 사용하여 수행되며, 척추를 네 가지 범주 (즉, 얇은, 버섯, 스터비, 필로포디아)로 분류합니다. 또한 수지상 척추 형태학의 변경을 평가하기 위해 추가적인 세 가지 매개변수(예: 길이, 머리 직경 및 부피)도 선택됩니다. 탄도 라벨링 기술의 광범위한 적용 가능성을 검증하기 위해 시험관 내 세포 배양으로부터의 피라미드 뉴런이 성공적으로 표지되었습니다. 전반적으로, 탄도 라벨링 방법은 쥐의 다른 뇌 영역에서 뉴런을 시각화하는 데 독특하고 유용하며, 정교한 재건 소프트웨어와 함께 연구자들은 근본적인 가능한 메커니즘을 해명 할 수 있습니다. 신경 인지 기능 장애.
Introduction
2000년, Gan et al.은 다양한 친유성 염료를 결합한 신경계에서 개별 뉴런및 글리아에 대한 신속한 라벨링 기술을 설명하여, 다른 색을 가진 많은 뇌 세포의 동시 라벨링을허용1,,2. 더 최근에, 탄도 표지 기술은 Seabold 등.3 뇌 조각의 뉴런으로 형광 염료 (Dil)를 도입했다고 기술되었습니다. 다재다능한 염색 기술인 탄도 라벨링은 여러 동물 종과 다양한 연령대에서 활용될 수 있는 능력으로 평가받고 있습니다. 또한, 뇌 세포의 하위 집단을 식별하기 위해 면역 염색과 결합 될 수있다3. 기존의 기법(예를 들어, 골지콕스 은침, 미세주입)과 비교하여4,탄도 라벨링은 수지상 척추를 포함한 형태학적 특성을 보다 명확하게 구별할 수 있는 기회를 제공하며, 이는 뉴런복잡성 및 시냅스 연결성에 대한 추론을 그리는 데 중요한특징이다5.
흥분성 피라미드 뉴런은 단일, 큰 상피 덴드라이트, 다중 짧은 기저 모수석, 및 수지상 척추의 수천을 특징으로한다6. 피라미드 뉴런은 전두엽 피질 (PFC) 및 해마를 포함하여 더 높은 차수인지 처리와 관련된 여러 뇌 영역에서 발견됩니다. PFC에서, 피라미드 뉴런은 층 II/III 및 층 V에서 관찰되며, 각각고유한 형태를 나타낸다. 구체적으로, PFC의 층 II/III에 있는 피라미드형 뉴런은 층V6에있는 피라미드 형 뉴런 보다는 더 짧은 정점 수상돌기 및 더 적은 분기가 있습니다. 해마 내에서 피라미드 형 뉴런은 CA1 및 CA3 영역 모두에 위치하며 각 신경 세포는 뚜렷한 형태를 표시합니다. 구체적으로, CA1 영역의 피라미드 형 뉴런은 CA3 영역6에비해 소마로부터 더 멀리 발생하는 분기와 함께 보다 독특한 정점 수상돌기를 나타낸다.
PFC와 해마 둘 다에 있는 피라미드 형 뉴런에 수지상 척추는 흥분성의 시냅스의 1 차적인 사이트입니다7. 수지상 척추의 형태학적 특성은 고전적으로 3가지 1차 범주(즉, 얇고, 스터비, 또는 버섯8)로특징지어지며, 흥분성 시냅스9의크기와 관련이 있다. 길고 얇은 목, 작은 구근 머리 및 작은 후두 밀도를 특징으로하는 얇은 척추는 더 불안정하고 약한 연결을 개발합니다. 그러나, 버섯 척추, 더 큰 수지상 척추 머리, 강한 시 냅 스 연결을 형성에 대 한 인식, 그들의 더 큰 크기에서 발생 하는 효과. 선명한 대조적으로, 스터비 척추는 척추 목이없는, 거의 동등한 머리와 목 볼륨 비율을 나타내는8. 해마 내에서, 분지 된 척추는 또한 관찰 될 수 있으며, 척추는 동일한 수지상 척추 목(10)에서나타나는 여러 개의 머리를 가지고 있다. 따라서 수지상 척추의 형태학적 변화는 기능과 구조적 능력을 반영할 수 있습니다. 또한 수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있으며, 작은 척추가 학습과 관심에 관여하는 반면, 더 크고 안정적인 척추는 기억11을포함한 장기 프로세스에 관여한다는 것을 입증했습니다. 부가적으로, 수상돌기를 따라 수지상 척추의 분포는 시냅스 연결과 연관될 수 있다5,,12.
따라서, 본 방법론 논문은 세 가지 목표를 갖는다: 1) 탄도 라벨링에 대한 우리의 프로토콜을 제시, 이는 성공률로 활용되고있다 (즉, 뉴런은 선택 기준을 충족하고 분석에 적합한) 의 83.3%55,12,,13 및 여러 뇌 영역 (즉, PFC, 핵 accumbens, 해마); 2) 시험관내에서 성장한 뉴런에 대한 기술의 일반화 및 그 적용성을 입증한다; 3) 신경 재건 소프트웨어에 활용된 방법론과 그러한 데이터로부터 도출될 수 있는 추론을 상세히 설명한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다 (연방 보증 번호 : D16-00028).
1. DiI / 텅스텐 비드 튜브 의 준비
- 100 mg의 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 ddH2O. 소용돌이 로 10 mL로 가볍게 용해시고 PVP 용액을 가볍게 녹입니다.
- PVP 용액으로 튜브를 채우고 (재료 표참조) 20 분 동안 둡니다. 이어서, 10 mL 주사기를 사용하여 배관의 다른 쪽 끝을 통해 PVP 용액을 추방한다.
- 170 mg의 텅스텐 마이크로 캐리어 비드와 250 μL의 메틸렌 염화물을 결합합니다. 텅스텐 비드 현탁액을 철저히 소용돌이.
- 6 mg의 친유성 DilC18(3) 염료와 300 μL의 메틸렌 염화물을 섞습니다. 와류 딜C18 (3) 염료 용액을 철저히.
참고: 연기 후드에서 1.3-1.4 단계를 수행합니다. - 텅스텐 비드 현탁액의 피펫 250 μL을 유리 슬라이드 상에. 서스펜션이 공기 건조될 때까지 기다립니다(~3분).
- 텅스텐 비드 서스펜션 층 의 상단에 DilC18 (3) 염료 용액 의 300 μL을 추가합니다. DiIC18(3) 염료 용액과 텅스텐 비드 현탁액을 파이펫 팁과 철저히 혼합하고 혼합물을 공기 건조 (~ 3 분)에 허용하십시오.
- 일단 건조, 두 개의 1.5 mL 원심 분리튜브로 혼합물을 분할 면도날을 사용 하 여. 튜브를 물로 채웁니다.
- 수조에서 초음파 처리 (앰프 I, 100 %) 균질(~5분)까지. 초음파 처리기의 끝이 비드 현탁액이있는 튜브에 직접 놓여 있는지 확인하십시오.
- 균질화된 혼합물 2개 1.5 mL을 15 mL 원엽 튜브에 결합합니다. 혼합물을 3분 더 소성시합니다.
- 텅스텐 비드-DilC18(3) 염료 혼합물을 10 mL 주사기를 사용하여 PVP 코팅 튜브에 넣습니다. 튜빙을 준비 스테이션에 공급합니다(재료 표참조).
- 준비 스테이션에서 1분 동안 회전합니다. 10 mL 주사기를 사용하여 튜브에서 모든 물을 조심스럽게 제거하십시오.
- 질소 가스를 켜고 질소 흐름을 분당 약 0.5 리터 (LPM)로 조정하고 준비 스테이션에서 튜브를 회전시키고 질소로 30 분 동안 건조시십시오.
- 준비 스테이션에서 튜브를 제거하고 튜브 커터를 사용하여 13mm 길이(카트리지의 로딩 크기와 일치)로 자른다. 13mm 길이를 암흑 에 있는 반짝이 바이알에 보관하십시오.
2. 뇌 섹션의 준비
참고: 성인 남성 F344/N 쥐 는 음식과 물에 광고 리비툼 액세스와 12/12 빛:어두운 주기에서 통제 된 환경에서 보관 했다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 건강의 국가 학회에 의해 설립 된 지침을 사용 하 여 에 대 한 관심.
- 5% 세보플루란을 사용하여 쥐를 깊이 마취시킵니다.
- 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 다음 단계로 진행하십시오.
- 쥐를 화학 연기 후드 내부의 척추 위치에 고정시다.
- 흉부 중간선을 따라 피부를 통해 절개를합니다. 다이어프램을 분리하고 가위로 가슴을 엽니다. 좌심실에 20G × 25mm 바늘을 삽입하십시오.
- 즉시 가위로 오른쪽 심방을 잘라. 5mL/min의 유량으로 100mM PBS의 50mL를 퍼퓨즈합니다. 100 mM PBS에서 버퍼링된 4% 파라포름알데히드의 100 mL을 퍼퓨즈.
- 관류 직후 쥐 뇌 전체를 제거하십시오.
- 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 뇌 전체를 접두사.
참고 : 라벨에 영향을 미치기 때문에 30 분 이상 4 % 파라 포름 알데히드에 붙이지 마십시오. - 쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 500 μm 두께의관상 동맥 부분을 잘라냅니다(재료 표 참조). 첫 번째 컷을 만들고 블레이드를 제자리에 유지하십시오. 두 번째 블레이드를 사용하여 두 번째 컷을 만들고 첫 번째 블레이드를 수직으로 제거하여 조직을 블레이드 표면에 유지합니다.
- 각 우물에 100 mM PBS의 1 mL와 24 잘 접시에 뇌 조각을 배치합니다. 모든 슬라이스가 잘리때까지 이 과정을 반복합니다.
3. 뇌 섹션의 탄도 라벨링 및 시각화
- 대상각 에서 PBS를 제거합니다.
- DiI/텅스텐 비드 튜브 조각으로 카트리지를 적재하고 어플리케이터에 넣습니다.
- 두 개의 메쉬 스크린 사이에 여과지를 놓습니다. 어플리케이터를 헬륨 호스에 연결합니다. 헬륨의 출력 압력을 평방 인치당 90파운드(psi)로 조정합니다.
- 샘플과 메쉬 스크린 사이의 거리에서 대상 의 중심에 손으로 수직으로 어플리케이터를 놓습니다. DiI/텅스텐 비드 튜브를 발사하십시오.
참고: 촬영 전에 대상 우물에서 모든 PBS를 제거해야 합니다. - 다음 DiI/텅스텐 비드 튜브로 카트리지를 적재하십시오. 나머지 조각의 튜빙에서 DiI/텅스텐 구슬을 지속적으로 발사합니다.
- PBS 의 100mM로 24 웰 플레이트를 채웁니다. PBS 3x의 신선한 100 mM의 500 μL로 씻으소서. PBS로 세척하는 동안 슬라이스가 뒤집지 않도록 하십시오.
- 신선한 100 mM PBS 500 μL을 추가하고 3 시간 동안 어두운 4 °C에서 슬라이스를 유지합니다.
- 미세한 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드로 옮김을 옮김.
참고 : 세 개의 뇌 섹션은 각 유리 슬라이드에 전송 할 수 있습니다. - 즉시 각 섹션에 안티 페이드 장착 매체 1 mL를 추가합니다. 22mm x 50mm 커버슬립을 뇌 섹션에 놓습니다. 2 일 동안 어둠 속에서 유리 슬라이드를 건조.
- 공초점 현미경 시스템을 켜고 60 × 목표로 전환하십시오.
- 공초점 현미경 시스템을 60×(A/1.4, 오일)의 배율과 0.15 μm의 Z 평면 간격(핀홀 크기 30 μm, 백 프로젝션 핀홀 반경 167nm)으로 설정합니다. 543 nm 파장을 사용하여 관심있는 뉴런의 이미지를 획득하십시오.
- 뇌 영역 경계 및 뉴런의 형태학적 특성을 기반으로 표적 화된 뉴런 유형에 대한 Z 스택 이미지를 가져옵니다.
참고 : 각 동물m에서 적어도 세 개의 이미지를 획득합니다.
4. 세포 배양방법론의 사용
- 이전에 보고된 방법론을 사용하여 산후 날에 F344/N 쥐로부터 1차 피질 뉴런을분리합니다 14.
- 1 주일 동안 35 mm 유리 바닥 접시에 배양 기본 피질 뉴런. 분리 후 3일째에 신선한 뉴런 성장 배지로 배양 배지의 절반을 변경한다. 100 mM PBS의 1 mL로 유리 바닥 접시 2 x를 씻으하십시오.
- 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 3.2-3.6 단계를 반복하여 셀에 탄도로 레이블을 지정합니다.
- 100 mM PBS 3 x의 1 mL로 씻으하십시오. 500 μL의 신선한 100 mM의 PBS를 추가하고 3 시간 동안 어둠 속에서 4 °C에서 유지하십시오.
- 안티페이드 마운팅 매체200 μL을 추가합니다.
- 3.10단계의 매개 변수를 사용하여 각 표적 뉴런에 대한 Z 스택 이미지를 가져옵니다.
5. 신경 분석 및 수지상 척추 정량화
- 코드 번호를 사용하여 실험자의 편향을 방지하는 블라인드 뉴런.
- 관심 있는 뇌 영역에 따라 뉴런에 대한 선택 기준을 설정합니다.
참고 : 뉴런에 대한 선택 기준은 연속 수지상 염색, 낮은 배경, 세포 내부의 염료 클러스터 없음, 세포 외 공간으로의 DiI 염료의 최소 확산, 피라미드 뉴런의 올바른 형태(그림 1)를포함한다. - 오픈 뉴런 재구성 소프트웨어(첨부된 비디오 1참조).
- 왼쪽 위 모서리에 있는"파일 폴더"이미지를 클릭하여 이미지 파일을 로드합니다.
- "Soma"를클릭하고 이미지에 있는 뉴런의 소마를 표시합니다.
- "트리"를클릭하고"사용자 안내"를선택합니다.
- 관심있는 모든 수지상 지점을 추적합니다.
참고 : 하나의 상판 모수석과 여러 바실라 수상돌기로 특징 지어지는 피라미드 형 뉴런의 경우 정점 모수석만 추적됩니다. 연결되는 모든 분기가 서로 연결되어 있는지 확인합니다. - "척추"를클릭합니다.
- 감지 매개 변수를 정의하고"모두 감지"를 클릭합니다.
참고: 뇌 조각의 경우 뇌 영역에서 사용되는 일관된 매개 변수는 2.0(외부 범위), 0.3(최소 높이), 100%(검출기 민감도) 및 10(최소 개수)입니다. 세포 배양을 위해 검출기 감도를 높이고 최소 카운트를 줄이셔야 합니다. - "모두분류"를선택하여 가시를 분류합니다.
참고: 수지상 척추는 신경 재건소프트웨어(15)에필수적인 알고리즘을 사용하여 분류된다. - 왼쪽 위 모서리에 디스크 이미지를 선택하여 추적을 저장합니다.
- 신경 및 수지상 척추 형태 학적 분석을 수행합니다.
- 오픈 뉴런 재구성 정량 분석 소프트웨어(첨부된 비디오 2참조).
- "파일"및"데이터 파일 열기"를클릭하여 이미지를 로드합니다.
- "분석Analysis" 및"분기 구조 분석"을클릭하여 신경 형태 및 수지상 척추 형태를 분석합니다.
- 신경 형태에 대 한, 클릭 "나무 합계" 그리고"수상 돌기 합계"에대 한 상자를 선택 합니다.
- 수지상 척추 형태에 대 한, 클릭"척추" 다음 에 대 한 상자를 선택 "척추 세부 사항".
- 출력 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고"파일에 저장"을선택하여 출력을 텍스트(.txt) 파일로 저장합니다.
- "분석"및"Sholl 분석"을클릭합니다.
- 시작 반경을 10 μm로 설정하고 반지름 증분을 10 μm로 설정합니다.
- 상자"수상돌기"를클릭하고"표시"를클릭합니다.
- 출력 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고"파일에 저장"을선택하여 출력을 텍스트(.txt) 파일로 저장합니다.
6. 데이터 분석
- 뉴런 형태(즉, 수지상 분기 복잡성) 데이터를 분석합니다.
- 각 분기 순서에 모수석 수를 추가하고 총 수상 돌기 수로 나눕니다. 100을 곱하여 각 분기 순서의 수상돌기 수에 대한 상대 주파수를 계산합니다.
- Sholl 분석 데이터를 분석하여 뉴런 아버의 복잡성과 수지상 척추 연결성을 검사합니다.
- 각 반지름의 교차수에 대한 평균 및 표준 오차를 계산합니다.
- 각 반경에서 척추 유형(즉, 얇고, 스터비, 버섯)에 의존하는 척추 수를 합산하고 해당 척추 유형에 대한 총 척추 수를 나눈다. 100을 곱하여 각 반지름의 등 수에 대한 상대 주파수를 계산합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 2A에서,쥐 두뇌 단면도에 있는 해마 지구에 있는 전형적인 피라미드 뉴런은 소마의 주위에 1개의 큰 정점 수상돌기 및 몇몇 더 작은 기저 모수석을 특징으로 하는 탄도 표지 기술에 의해 확인되었습니다. 도 2B는 소마가 검출된 후 뉴런 재구성 정량 분석 소프트웨어에서 뉴런을 나타내고, 수지상 가지를 추적하고, 척추를 검출했다. 이어서, 데이터는 신경 재건 정량 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었고, 이는 수지상 분기복잡성(도 2C)및 뉴런 아버 복잡성을 평가할 수 있는 기회를 제공했다(도2D).
그림 2C에서는"트리 합계" 출력에서 수집된 원심 분기 순서 지정 방법을 사용하여 각 모수석 및 할당된 분기 순서를 따라 횡단한 세그먼트 수를 계산했습니다. 각 분기 주문에서 세그먼트의 상대적 빈도를 분기 주문 1-15에 대해 검사했습니다. 수지상 가지 분포의 변화가 그룹 간에 관찰되었을 때 수지상 분기 복잡성의 변경이 유추 될 수 있습니다. 더욱이, Sholl 분석은 신경 아버 복잡성의 상보적인 척도로서 수행되었고, 이에 의해 소종으로부터 10 μm마다 발생하는 수지상 교차점의 수를 각 샘플 섹션에서 정량화하였다(도2D). 수지상 교차점의 수의 변화가 그룹 간에 관찰되었을 때, 뉴런 아버 복잡성의 변화는 추론될 수 있다.
수지상 척추의 형태학적 변화는 그림 3A–B에서볼 수 있듯이 길이(μm), 머리 직경(μm) 및 부피(μm3)를사용하여 평가될 수 있습니다. 더욱이, 척추는 신경 재건 소프트웨어에서 자동 보조 분류 시스템을 사용하여 분류되었다. 각 반경 사이의 가시 수의 상대적 빈도는 얇고 버섯 및 스터비 척추에 대해 조사되었습니다. 어떤 척추 유형이 더 강한 시냅스 연결을 형성하는지 (즉, 버섯이 스텁비에 상대적) 및 신경 전달 물질 구심물질을 형성하는 것을 감안할 때, 뉴런을 따라 척추분포의 변화는 시냅스 연결을 나타낼 수 있습니다.
또한, 우리는 세포 배양에서 1 차적인 피라미드 뉴런에 탄도 표지 기술의 유용성을 검증했습니다. 첫째, 우리는 2 주 동안 또는 약 70 % 수렴까지 폴리 L-리신으로 코팅 된 세포 배양 판에 출생 후 D1 (1 일)에서 1 차 해마 뉴런을 배양했습니다. 이어서 샘플을 15분 동안 4% PFA로 고정하고 PBS로 2x 세척하였다. 본 프로토콜의 3.1 단계에서 시작하여, 우리는 탄도로 표기하고 해마로부터 의 원발성 피라미드 뉴런을 이미지화시켰다. 데이터는 소마및 큰 상아수의 삼각형 형상에 기초하여 안정화된 라벨링 및 확인된 피라미드 뉴런을보였다(도 4A). 세포 배양에서 자란 1 차적인 피라미드 뉴런의 수지상 척추를 조사하기 위해 신경 재건 소프트웨어를 활용하면 쥐 뇌의 것과 유사한 기회를 제공합니다. 실시예 결과는 μm(도4C)으로측정된 얇은 수지상척추(도 4B)및 수지상 척추 길이의 분포에 대해 예시된다. 그러나, 세포 배양에서 성장한 1차 피라미드 형 뉴런은 수지상 분지가 적고, 적어도 이 예에서 수지상 분기 복잡성 및 뉴런 아버 복잡성의 평가를 배제했다는 점은 주목할 만하다.
그림 1: 탄도 라벨링 기술을 사용하여 표지된 내측 전두엽 피질에서 피라미드 뉴런에 사용되는 선택 기준. (a)내측 전두엽 피질로부터 잘 표지된 피라미드 뉴런의 대표적인 공초점 이미지(60x). 명확한 소마와 상형 모수석을 가진 단 하나 피라미드 뉴런은 낮은 배경을 가진 연속, 밝은 수지상 염색을 포함했습니다. (B–C) 내측 전두엽 피질로부터의 피라미드 뉴런의 대표적인 공초점 이미지(60x)는 더 많은 원위가지(B)와 높은 배경(C)에서 빛을 염색한다.BC (D)형태학적 특성에 결함이 있는 내측 전두엽 피질(Bregma 좌표에 기초)으로부터 표지된 뉴런의 대표적인 공초점 이미지(60x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 탄도 라벨링 기술 및 신경 해부학 평가를 사용하여 해마(HIP)에서 피라미드 형 뉴런의 라벨링. (A)탄도 텅스텐 비드로 표지된 피라미드 뉴런의 3개의 대표적인 공초점 이미지(60x). (b)신경 형태평가: 수지상 분기 차수 분석 및 Sholl 분석. 척추 형태가 수지상 척추 분석 소프트웨어를 사용하여 확인된 수지상 척추의 추적된 이미지. (C)분기 순서 분석은 다른 분기 순서에서 수지상 가지의 상대적 주파수를 검사하는 데 활용. (D)소마로부터 10 μm마다 수지상 교차점의 수를 신경 아버 복잡성의 척도로서 Sholl 분석을 사용하여 평가하였다. 데이터는 전체 데이터집합(C)의상대 주파수또는 95% 신뢰구간(D)에맞도록 설명됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 수지상 척추 형태학의 평가. (A–B)척추 유형 (즉, 얇고, 그루터기, 버섯)의 함수로 묘사 된 수지상 척추의 분포. 추가 수지상 척추 매개변수는 또한 수지상 척추 형태학의 평가로서 (즉, 길이, 부피, 머리 직경)을 분석하였다. 데이터는 전체 데이터 집합의 상대 주파수로 설명됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 탄도 라벨기술을 사용하여 시험관내 1차 피질 뉴런의 라벨링. (A)시험관내 탄도 텅스텐 비드에 의해 표지된 1차 피질 뉴런의 대표적인 공초점 이미지(60x). 예시 결과는 뇌 슬라이스에서 탄도 라벨링으로부터 획득한 것과 유사한 결과가 얇은 수지상척추(B)및길이(C)의분포를 나타내고 있다. 데이터는 전체 데이터 집합의 상대 주파수로 설명됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 신경 추적 및 수지상 척추 검출 절차. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 2: 정량 분석을 위한 데이터 수집 및 출력 절차입니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서는 쥐 뇌와 시험관 내에서 자란 뉴런에 대한 다목적 라벨링 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 신경 형태와 수지상 척추를 평가하기 위해 신경 재건 소프트웨어 및 신경 재건 정량 분석 소프트웨어를 활용하는 방법론을보고합니다. 신경 형태와 수지상 척추의 평가는 수지상 분기 복잡성, 신경 아버 복잡성, 수지상 척추 형태 및 시냅스 연결의 변화를 결정할 수있는 기회를 제공합니다.
프로토콜을 수행 할 때, 연구원은 몇 가지 단계에 특별한주의를 기울여야한다. 첫째, 너무 오래 4% PFA에 있는 사후 고정은 친유성 막의 무결성을 손상하고 세포의 외부로 새는 염료를 일으키는 원인이 됩니다. 둘째, 뇌 슬라이스에서 탄도 라벨링의 특이성과 비교하여, 뉴런만을 대상으로 하는, 시험관내 에서 1차 피질 뉴런의 라벨링은 뇌 슬라이스의 탄도 라벨링이 뉴런의 종류에 특이적이지 않기 때문에 글리아의 비특이적 라벨링을 도입한다(즉, 피라미드형 뉴런, 중간 가시 뉴런, 과립 세포). 따라서 Bregma 좌표, 형태학적 평가 또는 특정 세포 마커를 탄도 라벨링 방법과 결합해야 합니다. 셋째, 뇌 슬라이스의 두께는 200-500 μm 사이일 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 최적화해야 합니다. 넷째, 라벨링 및 염료 침투의 효율성은 헬륨 압력, 탄도 적용 후 배양 시간, DiI / 텅스텐 비드, 메쉬 스크린과 뇌 슬라이스 표면 사이의 거리 등과 같은 많은 요인과 관련이 있습니다. 프로토콜은 각 연구에 맞게 최적화되어야 합니다. 다섯째, 덩어리가 개별 뉴런을 구별하는 것을 허용하지 않기 때문에 준비 중에 탄도 염료 코팅 텅스텐 비드의 큰 덩어리 또는 클러스터는 피해야한다. 우리는 또한 DiI가 이 탄도 방법론에서 DiO보다 더 완전히 개별 뉴런에 걸쳐 확산된다는 것을 결정했습니다.
그럼에도 불구하고, 기존의 라벨링 방법4와비교하여 탄도 라벨링 기술은 고해상도 공초점 이미징을 가능하게하여 신경 및 수지상 척추 형태학의 평가를 가능하게합니다. 또한, 신경 재건 소프트웨어는 수지상 척추 (즉, 얇은, 버섯, 스텁비), 분기 주문 측정, 고전적인 Sholl 분석 및 길이 (μm), 머리 직경 (μm), 및 부피 (μm3)와같은 수지상 척추의 형태학적 특징의 측정을위한 알고리즘을 활용합니다. 여러 신경 매개 변수의 정량화는 신경 인지 기능 장애의 기본 메커니즘을 더 잘 이해할 수있는 기회를 제공.
전반적으로, 탄도 라벨링 방법은 쥐의 다른 두뇌 지구와 세포 배양에서 신경 구조의 시각화를 허용합니다, 이는 신경 인지 기능 장애의 근본적인 가능한 메커니즘을 설명하는 것이 중요합니다. 본 연구에서, 우리는 탄도 라벨링 기술에 의해 피라미드 뉴런에 라벨을 붙이는 방법을 제시한다. 또한, 신경 재건 소프트웨어와 결합, 우리는 해마 피라미드 뉴런에서 신경 및 수지상 척추 형태를 검사 하는 능력을 입증. 신경 및/또는 수지상 척추 형태학의 그룹 차이는 신경 인지 기능 장애의 기본 메커니즘을 이해할 수 있는 기회를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
어떤 저자도 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 HD043680, MH106392, DA013137 및 NS100624에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
