Summary
Vi presenterer en protokoll for å merke og analysere pyramidale nevroner, noe som er avgjørende for å evaluere potensielle morfologiske endringer i nevroner og dendrittiske spines som kan ligge til grunn for nevrokjemiske og atferdsmessige abnormiteter.
Abstract
Det har blitt rapportert at størrelsen og formen på dendrittiske spines er relatert til deres strukturelle plastisitet. For å identifisere den morfologiske strukturen til pyramidale nevroner og dendrittiske spines, kan en ballistisk merkingsteknikk benyttes. I den nåværende protokollen er pyramidale nevroner merket med DilC18(3) farog analysert ved hjelp av nevronal rekonstruksjonsprogramvare for å vurdere nevronal morfologi og dendrittiske spines. For å undersøke nevronal struktur utføres dendrittitisk forgreningsanalyse og Sholl-analyse, slik at forskere kan trekke slutninger om dendrittitisk forgrening skantkompleksitet og nevronal arbor kompleksitet, henholdsvis. Evalueringen av dendrittiske spines utføres ved hjelp av en automatisk assistert klassifiseringsalgoritme integrert i rekonstruksjonsprogramvaren, som klassifiserer spines i fire kategorier (dvs. tynn, sopp, stubby, filopodia). Videre velges ytterligere tre parametere (dvs. lengde, hodediameter og volum) også for å vurdere endringer i dendrittisk ryggradmorfologi. For å validere potensialet for bred anvendelse av den ballistiske merkingsteknikken, ble pyramidale nevroner fra in vitro cellekultur merket. Samlet sett er den ballistiske merkingsmetoden unik og nyttig for å visualisere nevroner i forskjellige hjerneregioner hos rotter, som i kombinasjon med sofistikert rekonstruksjonsprogramvare gjør det mulig for forskere å belyse de mulige mekanismene som ligger til grunn for nevrokognitiv dysfunksjon.
Introduction
I 2000 beskrev Gan et al. en rask merkingsteknikk for individuelle nevroner og glia i nervesystemet som kombinerte ulike lipofile fargestoffer, noe som muliggjør samtidig merking av mange hjerneceller med forskjellige farger1,2. Mer nylig ble en ballistisk merkingsteknikk beskrevet av Seabold et al.3 som introduserte fluorescerende fargestoffer (Dil) i nevronene i hjerneskiver. En allsidig fargeteknikk, ballistisk merking er verdsatt for sin evne til å bli utnyttet i flere dyrearter og over et bredt spekter av aldre. Videre kan det kombineres med immunfarging for å identifisere underpopulasjoner av hjerneceller3. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker (f.eks. Golgi-Cox sølv impregnering, mikroinjeksjon)4, gir ballistisk merking en mulighet til å tydeligere skille morfologiske egenskaper, inkludert dendrittiske spines, en funksjon som er avgjørende for å tegne slutninger om nevronal kompleksitet og synaptisk tilkobling5.
Eksitatoriske pyramidale nevroner er preget av en enkelt, stor apical dendritt, flere kortere basal dendritter, og tusenvis av dendrittiske spines6. Pyramidale nevroner finnes i flere hjerneregioner relatert til høyere orden kognitiv behandling, inkludert prefrontal cortex (PFC) og hippocampus. I PFC observeres pyramidale nevroner i lag II/III og lag V, med hver utstilling av unik morfologi. Spesielt pyramidale nevroner i lag II / III av PFC har en kortere apical dendritt og mindre forgrening enn pyramidale nevroner i lag V6. Innenfor hippocampus, pyramidale nevroner ligger i både CA1 og CA3 regioner, med hver viser distinkte morfologier. Spesielt viser pyramidale nevroner i CA1-regionen en mer særegen apical dendritt, med forgrening som skjer lenger fra soma, i forhold til CA3-regionen6.
Dendrittiske spines på pyramidale nevroner i både PFC og hippocampus er det primære stedet for eksitatoriske synapser7. Morfologiske egenskaper av dendrittiske spines, som er klassisk preget i tre primære kategorier (dvs. tynn, stubby eller sopp8), har vært relatert til størrelsen på eksitatoriske synapse9. Tynne spines, preget av en lang, tynn hals, lite bulbous hode, og mindre postsynaptiske tettheter, er mer ustabile og utvikler svakere forbindelser. Imidlertid er soppspines, som har et større dendrittisk ryggradshode, anerkjent for å danne sterkere synaptiske forbindelser, en effekt som følge av deres større størrelse. I skarp kontrast er stubby spines blottet for en ryggradsnakke, og viser et omtrent lik hode- og nakkevolumforhold8. Innenfor hippocampus kan forgrenede spines også observeres, hvorved ryggraden har flere hoder som kommer fra samme dendrittiske ryggraden halsen10. Derfor kan morfologiske endringer av dendrittiske spines reflektere funksjonalitet og strukturell kapasitet. Videre har studier vist at størrelsen og formen på dendrittiske spines er knyttet til deres strukturelle plastisitet, noe som fører til ideen om at små spines er involvert i læring og oppmerksomhet, mens større, mer stabile spines, er involvert i langsiktige prosesser, inkludert minne11. I tillegg kan fordelingen av dendrittiske spines langs dendritten være forbundet med synaptisk tilkobling5,12.
Dermed har dagens metodiske papir tre mål: 1) Presenter vår protokoll for ballistisk merking, som har blitt benyttet med en suksessrate (dvs. nevroner som oppfyller utvalgskriteriene og egnet for analyse) på 83,3%5,12,13 og på tvers av flere hjerneregioner (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Demonstrere generalizability av teknikken og dens anvendelse til nevroner dyrket in vitro; 3) Detalj metodikken som brukes i neuronal rekonstruksjon programvare og slutninger som kan trekkes fra slike data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina (føderal sikringsnummer: D16-00028).
1. Forberedelse av DiI/ Wolfram perle rør
- Oppløs 100 mg polyvinylpyrrolidon (PVP) med 10 ml ddH2O. Vortex PVP-oppløsningen lett.
- Fyll slangen med PVP-løsningen (se Materialtabellen) og la den stå i 20 min. Deretter utviser pvp-oppløsningen gjennom den andre enden av slangen ved hjelp av en 10 ml sprøyte.
- Kombiner 170 mg wolfram mikrobærerperler med 250 μL metylenklorid. Vortex wolfram perle suspensjon grundig.
- Kombiner 6 mg lipofil dilc18(3) dye med 300 μL metylenklorid. Vor dilc18(3) dye oppløsning grundig.
MERK: Utfør trinn 1,3–1,4 i en røykhette. - Pipette 250 μL av wolframperlesuspensjonen på et glasslysbilde. Vent til suspensjonen lufttørke (~3 min).
- Tilsett 300 μL DilC18(3) dye oppløsning på toppen av wolfram perle fjæring laget. Bland DiIC18(3) fargeoppløsningog wolframperlesuspensjon grundig med en pipettespiss og la blandingen lufttørke (~ 3 min).
- Når den er tørket, bruk et barberblad for å dele blandingen i to 1,5 ml sentrifugerør. Fyll rørene med vann.
- Sonicate i et vannbad (Amp I, 100%) til homogen (~5 min). Sørg for at spissen av sonicator ligger direkte på rørene med perlesuspensjonen.
- Bland de to 1,5 ml homogeniserte blandingen i et 15 ml konisk rør. Sonicate blandingen for en annen 3 min.
- Trekk wolframperlene-DilC18(3) fargeblandingen inn i pvp-belagt slange med en 10 ml sprøyte. Mate slangen inn i forberedelsesstasjonen (se Materialtabellen).
- Roter i 1 min på klargjøringsstasjonen. Fjern forsiktig alt vannet fra slangen med en 10 ml sprøyte.
- Slå på nitrogengassen og juster nitrogenstrømmen til ca. 0,5 liter per minutt (LPM), roter slangen i klargjøringsstasjonen og tørk med nitrogen i 30 min.
- Fjern slangen fra klargjøringsstasjonen og kutt i 13 mm lengder (som passer til lastestørrelsen på patronen) ved hjelp av en slangekutter. Oppbevar 13 mm lengder i scintillation hetteglass i mørket.
2. Tilberedning av hjerneseksjoner
MERK: Voksne mannlige F344/N rotter ble paret plassert i et kontrollert miljø under en 12/12 lys:mørk syklus med ad libitum tilgang til mat og vann. Alle dyr ble tatt vare på ved hjelp av retningslinjer fastsatt av National Institutes of Health i Guide for care and use of Laboratory Animals.
- Dypbedøve rotter ved hjelp av 5% sevofluran.
- Fortsett til følgende trinn når rottene ikke reagerer på skadelige stimuli og reflekser er fraværende.
- Fest rotten i en supineposisjon inne i en kjemisk røykhette.
- Lag et snitt gjennom huden langs thoraxmidtlinjen. Skill membranen og åpne brystet med saks. Sett en 20 G × 25 mm nål inn i venstre ventrikkel.
- Klipp umiddelbart høyre atrium med saks. Perfuse 50 ml 100 mM PBS med 5 ml / min strømningshastighet. Perfuse 100 ml 4% paraformaldehyd bufret i 100 mM PBS.
- Fjern hele rottehjernen rett etter perfusjon.
- Postfiks hele hjernen i 10 min med 4% paraformaldehyd.
MERK: Ikke postfiks i 4% paraformaldehyd i mer enn 30 min, fordi det vil påvirke merkingen. - Klipp 500 μm tykke koronale seksjoner ved hjelp av en rotte hjernematrise (se Materialtabellen). Gjør det første kuttet og hold bladet på plass. Lag et nytt kutt ved hjelp av et annet blad og fjern det første bladet vertikalt, og hold vevet på bladoverflaten.
- Legg hjerneskivene i en 24 brønnplate med 1 ml 100 mM PBS i hver brønn. Gjenta denne prosessen til alle skiver er kuttet.
3. Ballistisk merking og visualisering av hjerneseksjoner
- Fjern PBS fra hver målrettede brønn.
- Legg sylinderampullen med et stykke DII/Tungsten perlerør og legg den i applikatoren.
- Legg et filterpapir mellom to nettingskjermer. Koble applikatoren til heliumslangen. Juster utgangstrykket av helium til 90 pounds per kvadrattomme (psi).
- Plasser applikatoren vertikalt for hånd på midten av den målrettede brønnen i en avstand på 1,5 cm mellom prøven og nettingskjermen. Avfyr DiI/ Wolfram perler rør.
MERK: Pass på at du fjerner alle PBS fra de målrettede brønnene før du tar bilder. - Legg i patronen med neste DiI/Tungsten perleslange. Kontinuerlig avfyr DiI / Wolfram perler fra slangen på de resterende skiver.
- Fyll 24 brønnplate med 100 mM PBS. Vask med 500 μL fersk 100 mM PBS 3x. Ikke la skivene snu mens du vasker med PBS.
- Tilsett 500 μL fersk 100 mM PBS og hold skivene ved 4 °C i mørket i 3 timer.
- Overfør hjerneskivene til glasssklier med en fin børste.
MERK: Tre hjerneseksjoner kan overføres til hvert glasslysbilde. - Tilsett umiddelbart 1 ml antifademonteringsmedium på hver seksjon. Plasser en 22 mm x 50 mm dekselslip over hjerneseksjonene. Tørk glassskliene i mørket i 2 dager.
- Slå på konfokalmikroskopsystemet og bytt til et mål på 60 ×.
- Sett konfokalmikroskopsystemet til å ha en forstørrelse på 60 × (A/ 1,4, olje) og et Z-planintervall på 0,15 μm (pinhole størrelse 30 μm, tilbakeprojisert pinhole radius 167 nm). Bruk en 543 nm bølgelengde for å skaffe bilder av nevronene av interesse.
- Få Z-stack bilder for målrettet nevron type basert på hjernen regionen grenser og morfologiske egenskaper av nevroner.
MERK: Få minst tre bilder fra hver dyr.
4. Bruk av metodikken med cellekultur
- Isoler primære kortikale nevroner fra F344/N rotter ved postnatal dag én ved hjelp av tidligere rapportert metodikk14.
- Kultur primære kortikale nevroner i en 35 mm glass bunntallerken i en uke. Endre halvparten av kulturmediet med frisk nevronvekstmedium på tredje dag etter isolasjon. Vask glassbunnsfatet 2x med 1 ml 100 mM PBS.
- Fest med 4% paraformaldehyd i 15 min ved romtemperatur. Gjenta trinn 3.2–3.6 for å merke cellene ballistisk.
- Vask med 1 ml 100 mM PBS 3x. Tilsett 500 μL fersk 100 mPBS og oppbevar den ved 4 °C i mørket i 3 timer.
- Tilsett 200 μL antifademonteringsmedium.
- Få Z-stack bilder for hver målrettet nevron ved hjelp av parametrene i trinn 3.10.
5. Neuronal analyse og dendrittisktifisering av ryggraden
- Blinde nevroner bruker kodenumre for å forhindre eksperimenterebias.
- Etablere utvalgskriterier for nevroner basert på hjerneområdet av interesse.
MERK: Utvalgskriterier for nevroner inkluderer kontinuerlig dendrittisk farging, lav bakgrunn, ingen fargeklynger inne i cellene, minimal diffusjon av DiI-farge inn i det ekstracellulære rommet, riktig morfologi av pyramidale nevroner (Figur 1). - Åpne programvare for nevronal rekonstruksjon (Se den vedlagte video 1).
- Last inn en bildefil ved å klikke på"Filmappe"bildet øverst til venstre.
- Klikk "Soma" og merk soma av nevronene på bildet.
- Klikk "Tree" og velg "Brukerstyrt".
- Spor alle dendrittiske grener av interesse.
MERK: For pyramidale nevroner, som er preget av en apical dendritt og flere basilar dendritter, spores bare den apiske dendritten. Kontroller at alle tilkoblingsgrener er festet til hverandre. - Klikk "Spine".
- Definer registreringsparametere og klikk "Finn alle".
MERK: For hjerneskiver er de konsekvente parametrene som brukes på tvers av hjerneregioner: 2.0 (Outer Range), 0.3 (Minimumshøyde), 100 % (detektorfølsomhet) og 10 (minimumantall). For cellekultur er det nødvendig å øke detektorfølsomheten og redusere minimumsantallet. - Klassifisere spines ved å velge "Klassifisere alle".
MERK: Dendrittiske spines er klassifisert ved hjelp av en algoritme integrert i nevronal rekonstruksjon programvare15. - Lagre sporing ved å velge Diskbilde øverst til venstre.
- Utfør nevronale og dendrittiske spinal morfologiske analyser.
- Åpne kvantitativ analyse programvare for nevronal rekonstruksjon (se vedlagt video 2).
- Last inn bildet ved å klikke på"File"og "Åpne datafil".
- Klikk "Analyse" og "Branched Structure Analysis" for å analysere nevronal morfologi og dendrittisk ryggraden morfologi.
- For nevronal morfologi, klikk"Tre totaler"og velg boksen for "Dendrite Totals".
- For dendrittisk ryggradmorfologi, klikk"Spines"og velg deretter boksen for "Spine Details".
- Lagre utdata som en tekstfil (TXT) ved å høyreklikke på utdatatabellen og velge"Lagre i fil".
- Klikk "Analyse" og "Sholl Analyse".
- Sett startradiusen til 10 μm og radiusøkningtil 10 μm.
- Klikk på boksen "Dendritter" og klikk "Display".
- Lagre utdata som en tekstfil (TXT) ved å høyreklikke utdatatabellen og velge"Lagre i fil".
6. Dataanalyse
- Analyser de nevronale morfologidataene (dvs. dendrittitisk forgreningskompleksitet).
- Legg til antall dendritter i hver grensordre og del det totale antallet dendritter. Multipliser med 100 for å beregne de relative frekvensene for antall dendritter i hver grensordre.
- Analyser Sholl-analysedataene for å undersøke nevronal arborkompleksitet og dendrittitisk ryggradstilkobling.
- Beregn gjennomsnittet og standardfeilen for gjennomsnittet for antall kryss ved hver radius.
- Sum antall spines avhengig av ryggraden type (dvs. tynn, stubby, sopp) ved hver radius og dele med det totale antall spines for at ryggraden type. Multipliser med 100 for å beregne de relative frekvensene for antall spines ved hver radius.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2Able de typiske pyramidale nevronene i hippocampalregionen i rottehjerneseksjonene identifisert av ballistisk merkingsteknologi, preget av en stor apical dendritt og flere mindre basal dendritter rundt soma. Figur 2B viser nevronen i den kvantitative analyseprogramvaren for nevronal rekonstruksjon etter at soma ble oppdaget, dendrittiske grener ble sporet, og spines ble oppdaget. Deretter ble dataene analysert ved hjelp av nevronal rekonstruksjon kvantitativ analyseprogramvare, noe som ga en mulighet til å vurdere dendrittiske forgreningskompleksiteten (figur 2C) og nevronal arbor kompleksitet (Figur 2D).
I figur 2Cbenyttet vi sentrifugalgrensbestillingsmetoden, samlet inn fra "Tretotaler"-utdataene, for å telle antall segmenter som er krysset langs hver dendritt og tildelt grensordre. Den relative frekvensen av segmenter ved hver grensordre ble undersøkt for filialordrer 1–15. Når endringer i fordelingen av dendrittiske grener ble observert mellom grupper, kan endringer i dendrittisk forgreningskompleksitet utledes. Videre ble en Sholl-analyse utført som et komplementært mål på nevronal arbor kompleksitet, hvorved antall dendrittiske kryss som forekommer hver 10 μm fra soma ble kvantifisert i hver prøveseksjon (Figur 2D). Når endringer i antall dendrittiske kryss ble observert mellom grupper, kan endringer i nevronal arbor kompleksitet utledes.
Morfologiske endringer i dendrittiske spines kan vurderes ved hjelp av lengde (μm), hodediameter (μm) og volum (μm3),som sett i figur 3A–B. Videre ble spines klassifisert ved hjelp av det automatiske assisterte klassifiseringssystemet i nevronal rekonstruksjonsprogramvare. Den relative frekvensen av antall spines mellom hver radius ble undersøkt for tynne, sopp og stubby spines. Gitt vår forståelse av hvilke ryggradstyper som danner sterkere synaptiske forbindelser (dvs. sopp i forhold til stubby) og nevrotransmitterafferenter, kan skift i fordelingen av spines langs nevronen indikere synaptisk tilkobling.
Videre validerte vi nytten av den ballistiske merkingsteknikken på en primær pyramidal neuron i cellekultur. Først dyrket vi primære hippocampale nevroner ved postnatal D1 (dag 1) på en cellekulturplate belagt med poly-L-lysin i 2 uker eller til ca 70% samløpet. Deretter ble prøvene fikset med 4% PFA i 15 min og vasket 2x med PBS. Fra trinn 3.1 i den nåværende protokollen, vi ballistisk merket og avbildet de primære pyramidale nevroner fra hippocampus. Data viste stabilisert merking og identifisertpyramidale nevroner basert på trekantformen på soma og stor apical dendritt (Figur 4A). Utnyttelse av nevronal rekonstruksjon programvare for å undersøke dendrittiske spines av primære pyramidale nevroner dyrket i cellekultur gir muligheter som ligner de i rottehjernen. Eksempelresultater er illustrert for fordeling av tynne dendrittiske spines (Figur 4B) og dendrittisk ryggradslengde målt i μm (figur 4C). Det er imidlertid bemerkelsesverdig at de primære pyramidale nevronene dyrket i cellekultur hadde mindre dendrittiv forgrening, utelukker vurderingen, i hvert fall i dette eksemplet, av dendrittitisk forgrening kompleksitet og nevronal arbor kompleksitet.
Figur 1: Utvalgskriterier benyttet for pyramidale nevroner i den mediale prefrontale cortex merket ved hjelp av ballistisk merking teknologi. (A) Et representativt konfokalt bilde (60x) av et godt merket pyramidalt nevron fra medial prefrontal cortex. En enkelt pyramidal neuron med en klar soma og apical dendrite inkludert kontinuerlig, lyse dendrittiske farging med lav bakgrunn. (B-C) Et representativt konfokalt bilde (60x) av et pyramidalt nevron fra medial prefrontal cortex med lys farging på de mer distale grenene (B) og høy bakgrunn (C). (D) Et representativt konfokalt bilde (60x) av et merket nevron fra medial prefrontal cortex (basert på Bregma koordinater) som har feil morfologiske egenskaper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Merking av pyramidale nevroner i hippocampus (HIP) ved hjelp av ballistisk merking teknologi og nevroanatomiske vurderinger. (A) Tre representative konfokale bilder (60x) av pyramidale nevroner merket av ballistiske wolframperler. (B) Vurderingen av nevronal morfologi: dendrittisk grenordreanalyse og Sholl-analyse. Det sporede bildet av dendrittiske ryggraden der ryggraden morfologi ble også identifisert ved hjelp av dendrittisk ryggraden analyse programvare. (C) Branch ordreanalyser benyttet til å undersøke den relative frekvensen av dendrittiske grener på ulike grensordrer. (D) Antall dendrittiske kryss hver 10 μm fra soma ble vurdert ved hjelp av Sholl analyse som et mål på nevronal arbor kompleksitet. Data beskrives som relative frekvenser av hele datasettet (C) eller passer med 95 % konfidensintervaller (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Vurderingen av dendrittisk ryggradmorfologi. (A–B) Fordelingen av dendrittiske spines illustrert som en funksjon av ryggraden type (dvs. tynn, stubby, sopp). Ytterligere dendrittiske ryggradsparametere ble også analysert (dvs. lengde, volum, hodediameter) som en vurdering av dendrittisk ryggradsmorfologi. Data illustreres som relative frekvenser av hele datasettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Merkingav primære kortikale neuron in vitro ved hjelp av ballistisk merking teknologi. (A) Representative konfokale bilder (60x) av primære kortikale nevroner merket av ballistiske wolfram perler in vitro. Eksempelresultater som ligner på de som er anskaffet fra ballistisk merking i hjerneskiver, vises for fordeling av tynne dendrittiske spines (B) og lengde (C). Data illustreres som relative frekvenser av hele datasettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Prosedyrer for nevronal sporing og dendrittisk ryggradsdeteksjon. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Prosedyrer for datainnsamling og utgang for kvantitativ analyse. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en allsidig merkingsteknikk for nevroner fra både rottehjernen og de som dyrkes in vitro. Videre rapporterer vi metodikken for bruk av nevronal rekonstruksjonprogramvare og nevronal rekonstruksjon kvantitativ analyseprogramvare for å vurdere nevronal morfologi og dendrittiske spines. Vurderingen av nevronal morfologi og dendrittiske spines gir en mulighet til å bestemme endringer i dendrittiske forgreningskompleksitet, nevronal arbor kompleksitet, dendrittisk ryggraden morfologi og synaptisk tilkobling.
Når du gjennomfører protokollen, bør forskerne være spesielt oppmerksomme på noen få trinn. Først, post-fiksering i 4% PFA for lenge vil skade integriteten til den lipofile membranen og føre til at fargen lekker utenfor cellene. For det andre, sammenlignet med spesifisiteten av ballistisk merking i hjerneskiver, som bare retter seg mot nevroner, merking av primære kortikale nevroner in vitro introduserer ikke-spesifikk merking av glia fordi ballistisk merking i hjerneskiver ikke er spesifikk for en type nevron (dvs. pyramidal neuron, medium spiny neuron, granulecelle). Dermed bør Bregma koordinater, morfologiske vurderinger eller spesifikke cellemarkører kombineres med den ballistiske merkingsmetoden. For det tredje kan tykkelsen på hjerneskivene være mellom 200–500 μm; for best resultat bør det optimaliseres. For det fjerde er effektiviteten av merking og fargepenetrasjon relatert til mange faktorer, for eksempel heliumtrykk, inkubasjonstider etter ballistisk påføring, DiI / Wolfram perler, avstanden mellom nettingskjermen og overflaten av hjerneskiver, etc. Protokollen skal optimaliseres for hver studie. Femte, store klumper eller klynger av ballistiske dye belagt wolfram perler under forberedelse må unngås, fordi klumper ikke ville tillate individuelle nevroner å bli stående. Vi fastslo også at DiI sprer seg gjennom individuelle nevroner mer fullstendig enn DiO i denne ballistiske metodikken.
Likevel, sammenlignet med tradisjonelle merkingsmetoder4, gjør den ballistiske merkingsteknikken høy oppløsning konfokal avbildning mulig, noe som gjør det mulig å vurdere nevronal og dendrittisk ryggradmorfologi. Videre bruker nevronal rekonstruksjonsprogramvare en algoritme for automatisk assistert klassifisering av dendrittiske spines (dvs. tynn, sopp, stubby), grenbestillingsmålinger, klassisk Sholl-analyse og måling av morfologiske egenskaper av dendrittiske spines, for eksempel lengde (μm), hodediameter (μm) og volum (μm3). Kvantifiseringen av flere nevronale parametere gir en mulighet til å bedre forstå mekanismene som ligger til grunn for nevrokognitiv dysfunksjon.
Samlet sett tillater den ballistiske merkingsmetoden visualisering av nevronale strukturer i forskjellige hjerneregioner av rotten og i cellekulturen, noe som er viktig å belyse de mulige mekanismene som ligger til grunn for nevrokognitiv dysfunksjon. I den nåværende studien presenterer vi en metode for å merke pyramidale nevroner ved en ballistisk merkingsteknikk. Videre, kombinert med nevronal rekonstruksjon programvare, demonstrerte vi evnen til å undersøke nevronal og dendrittisk ryggraden morfologi i hippocampal pyramidale nevroner. Gruppeforskjeller i nevronal og/eller dendrittisk ryggradsmorfologi gir en mulighet til å forstå mekanismene som ligger til grunn for nevrokognitiv dysfunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH-bevilgninger HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
